MTT 法和CCK-8 法检测细胞活性之测试条件比较对比,检测,法,CCK,细胞活性..
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MTT 法和CCK-8 法检测细胞活性之测试条件比较
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【讨论】用CCK-8测细胞增殖/毒性的疑难解答
发现大家有很多关于CCK-8的问题，
这方面虽然算不上专家，
但还是有一定经验，
想着这边开一个整合的帖子，
如果大家有遇到相关实验上的问题，
都可以在帖子中回复我，
我会抽时间给大家简单简答，
交流的同时顺便学习，
希望能够帮到大家！
【加CCK-8的时候是用排枪吗？】
一般建议用排枪，缩短加样以及CCK-8的时间，保证孵育之前，每个孔的状态一致，如果实验室只有普通的移液枪，也可以，不过尽量保证在短时间内加完。
【10uL的量感觉总是加不准】
无论是排枪还是移液枪，都可以设置加样的量，量程足够的话，设置在10ul就可以了，枪有两档，一般推荐加到第一档就可以了，虽然那样可能整体的量不到10ul，但只要保证整体的状态一致就行，如果加到第二档，很有可能出现气泡或者带走培养液。
【若枪头触及底部，那就应该每加一次cck就换一次枪头了？】
对的，每次加完枪头都会不可避免沾有培养基或细胞或CCK-8，所以建议每加一次就换一次枪头，可以事先准备96孔板固定板，把枪头都摆好，加样的时候就可以快速高效了~
【全部加完cck后，是不是要用酶标仪震板以混匀每孔的溶液呢？若不是，楼主是如何解决溶液混匀的问题的？】
不需要震板，加完之后盖上盖子，轻轻拍打孔板即可
【楼主是怎样设置复孔的，一般设置多少个？感觉这个实验最后得出的数据，每孔之间有时差别比较大】
复孔也可以说是平行孔，一般设置3-5个，复孔之间差异比较大的话有很多因素，可能是CCK-8的问题，也有可能是操作的问题，当然也可能是实验设计的问题
有些药物本身会在450nm处有吸收，会造成OD偏高，不一定是因为药物有还原性的问题。
【有些药物本身会在450nm处有吸收，会造成OD偏高，不一定是因为药物有还原性的问题。】
这个操作还是比较简单的，无论是药物具有还原性，还是本身具有吸光度，同样进行孵育前换液的操作，记住用PBS多清洗几遍，建议清洗的次数控制在3-5遍，把细胞表面残留的药物洗干净，即使有吸光度，也不会影响接下去的实验，原因是CCK-8不会进入细胞内反应，整个染料形成过程只存在于培养基体系。
&进行孵育前换液的操作，记住用PBS多清洗几遍&,如果培养时使用的是细胞悬液，是不是这一操作就不可行了？
【进行孵育前换液的操作，记住用PBS多清洗几遍，如果培养时使用的是细胞悬液，是不是这一操作就不可行了？】
悬浮细胞如果加入的药物具有还原性或者本身有吸光度的话，需要用到平板离心机，换液之前使用平板离心机离心，吸取上清液，留底下细胞，PBS清洗，再加培养基、CCK-8孵育。
期待楼主继续盖楼。
安得广厦千万间，大庇同仁学子俱欢颜。
悬浮细胞的标准曲线制作方法和贴壁细胞类似。
标准曲线不是一定要做，只是找一个最合适的实验条件。
您好，请教一下：打算做双氧水诱导心肌细胞凋亡实验，以确定双氧水的最佳诱导浓度，但双氧水对CCK有影响，测样之前更换无双氧水的培养基的话，那空白孔就直接用不含细胞的普通培养基再加CCK了。是这样的么？谢谢了！
的确是这样，孵育之前换液的话，理论上就不存在双氧水与CCK-8反应的可能。希望实验能够顺利！
谢谢！打算预实验先摸索细胞数和孵育时间，以保证OD在1左右。后续按此孵育条件检测双氧水的毒性。后续试验打算直接加DAPI染色或加CCK8后直接提取RNA、蛋白质,没有影响么？
【后续试验打算直接加DAPI染色或加CCK8后直接提取RNA、蛋白质,没有影响么？】
可以用PBS多清洗几遍，再加入DAPI或者PI染色；提取RNA、Pr，同理，多清洗几遍就OK了。
做毒性的话，OD值可以控制到1.5左右，这样趋势会更明显一点。
可以撒，我在武汉，您是哪里的？
那样的话，保证OD在1.5左右,就按此条件后续检测双氧水的毒性。谢谢前辈！
我没有用PBS再清洗过
你好，我在做CCK8细胞毒性实验。做出来的结果是加高浓度药物的空的吸光度异常高，而不加药物的对照孔的OD值偏小。加CCK8时，我是从药物的高浓度到低浓度，再到空白对照的顺序进行的。会是什么原因导致这样的结果呢
【做出来的结果是加高浓度药物的空的吸光度异常高，而不加药物的对照孔的OD值偏小。】
我有几个问题先问下：1.加入高浓度药物的孔，是否做过镜检，检查细胞状态？2.是否做过药物和CCK-8的空白对照（药物+培养基+CCK-8）？3.不加药物的对照空OD值偏小，具体是多少？跟加药组的OD差异是多少？正常情况下，如果药物对细胞有杀伤，那么根据CCK-8的原理，加药组的OD值会明显降低，所以先需要确定一些实验内容和结果
需要加入DMSO溶解的情况我之前遇到过，实验先设计了一个预实验：
对照组：细胞+培养基
实验组：细胞+培养基+药物+DMSO+CCK-8
Blank1：培养基+药物+DMSO+CCK-8
Blank2：培养基
由于是预实验，这边多设了一个Blank，每个组设了5个副孔，
Blank1主要是观察药物和CCK-8是否有反应，如果OD值偏高的话，
说明药物有一定的还原性，需要在加入CCK-8之前进行清洗并更换培养基的操作。
另外，通过实验组和Blank1的对比，判断在加入DMSO的环境下，
CCK-8是否能够跟药染的细胞反应，如果OD值没有明显差异，
在确保药物已经达到对细胞杀伤的浓度下，可以判断DMSO是否会对反应有影响。
补充的一点是：DMSO溶解药物后，会让药物具有一定的粘附性，预实验是做下来只是让自己心里明白，之后的实验我还是每次都会清洗换液。
希望能够帮到你！
【就是我CCK-8各个副孔有差异，你们最大差异可以放宽到多少呢？】
副孔的差异当然是越小越好，按我自己的理解，一般副孔间差异在0.1以内的都可以接受，如果超过0.1，数据基本没有参考的价值，需要找存在的原因
【还有我不同时段测各副孔的OD值不同，比如1hA孔大于B孔，再半小时测时B孔又大于A孔的OD值，这是什么原因，楼主能帮忙解释下吗？】
加入CCK-8反应的时间不同，OD值也就会有变化，你指的【再半小时测】是指孵育半小时还是孵育完之后测了一遍，静置半小时又测一遍？另外最好把你具体的实验内容能够告诉我，这样方便用我的理解帮你分析一下~
这个OD值为1，只是在做预实验摸条件过程中的一个数值，并不是适合所有实验，例如有些促细胞生长的药物，在做预实验的时候OD值达到0.5就可以了，具体参考之前我写的关于预实验的设计操作吧~
原因很多哦，可以告诉我实验设计，操作过程以及具体数据么~
这样更容易找角度分析！
非常感谢；我是这样做的：CCK-8加入后孵育分别取0.5h，1h，2h，3h测同一板的OD值，之间间隔的时间是放回培养箱继续孵育的；出现我上述差异；不知我这种做饭有失妥当？还有疑问是：论坛里很多人说OD值要为1比较好？这个1是指对照组的OD值吗？实在很难理解。刚刚接触CCK8，问题也许比较幼稚，楼主不吝赐教。
我做的是细胞毒性检测，用没加毒的细胞做对照。实验组细胞都发生病变了，对照组没有发生病变，按理说对照组OD值应该大啊？但是我的为什么那么小呢？求解！
遇到这种情况，我会先镜检观察细胞形态，如果细胞出现明显皱缩破裂等病变的状态，那么有几种可能：
1.你的毒物具有还原性，需要做一个Blank（培养基+CCK-8+毒物），检测OD值是否大于0.2，或者用肉眼观察颜色变化，如果有明显的橘黄色物质形成，那么说明你的毒物有还原性会跟CCK-8反应，导致加药组的OD值反而升高，则需要在加CCK-8孵育之前换液
2.培养基中具有影响测定或还原性物质，同理，做一个Blank去验证
3.孵育时间过长，导致培养基变酸，使得体系的PH值明显变化，同样会对CCK-8与细胞之间反应有影响
4.实验本身的操作或者记录问题
5.试剂质量问题
其中药物具有还原性的可能居大，自己可以尝试做几个Blank看一下，希望能成功！
【CCK-8加入后孵育分别取0.5h，1h，2h，3h测同一板的OD值，之间间隔的时间是放回培养箱继续孵育的；出现我上述差异；不知我这种做饭有失妥当？】
不建议用同一块板做，我简单说明一下，0.5h的时候去检测，结果能够代表孵育0.5h时，细胞生长的状态，但是，再放入培养箱，过0.5h再去检测，其结果并不代表“孵育1小时的细胞生长状态”，因为你忽略了检测的这段时间内CCK-8和细胞的反应，另外，在整个过程中，增加了实验数据稳定的风险，所以我一般会建议准备4块板，同时加CCK-8进行孵育，分别在4个时间段取其中一块板去检测，这样体现的数据更具有代表性，也是尽可能去避免了误差
【论坛里很多人说OD值要为1比较好？这个1是指对照组的OD值吗？】
我举个例子，比如我们做毒性实验，加入的药物对细胞有一个杀伤作用，那么理论上来说，只要加入药物，那么OD值就会比不加药组的OD值要低，所以我们推荐正常组细胞在加入CCK-8孵育过后能够达到OD值为1甚至1.5这样的数值，那么加药组在同等孵育情况下，OD在1或者1.5以下随着药物浓度的增加而逐渐变小，并带有明显趋势，如果正常组的细胞OD值比较小，比如0.5，那么加入药物之后，OD值要比0.5还要低，整体的趋势就拉不开了，这样说可以理解为什么要强调OD值为1的原因么？
楼主是个很NICE的人，感谢。。我现在做悬浮细胞的CCK8，发现比复孔之间OD值相差比贴壁细胞要大很多，甚至&0.5，这个靠增加复孔数或是去除两个最值能解决吗？我尝试了几个细胞数梯度，发现都存在这样的现象。puzzled:rol:
【我现在做悬浮细胞的CCK8，发现比复孔之间OD值相差比贴壁细胞要大很多，甚至&0.5，这个靠增加复孔数或是去除两个最值能解决吗？】
悬浮细胞副孔间差异大的情况，很有可能是2种原因造成的：
1.团聚，某些悬浮细胞在生长时会出现细胞团聚的现象，导致每孔间细胞和CCK-8之间的反应不充分，也就容易使副孔间的OD值拉开差距
2.没有用平板离心机离心，悬浮细胞在加CCK-8孵育之后，建议用平板离心机离心，每孔吸取一定量的上清液至新的96孔板，然后再用酶标仪检测，原因是基于酶标仪的检测原理，通俗一点来讲，酶标仪在每孔底部射出一定波长的检测光，通过光在液体中的折射来读取最后的吸光度，悬浮细胞如果没有经过离心处理，细胞半悬于体系中，容易对光的折射产生较大影响，由于大多是酶标仪在检测吸光度时使用单光源检测，所以为了避免不必要的误差，会使用平板离心机先离心，再移液，达到最后检测的标准
楼主，您好！如果是想检测不同代次的细胞活力的变化，是不是要保证每次检测的细胞数目要一致，我在说明书上只是看到了在测增值的时候要求数目，在测活力的时候是不是不需要保证每次检测的细胞数目。谢谢楼主
【如果是想检测不同代次的细胞活力的变化，是不是要保证每次检测的细胞数目要一致，我在说明书上只是看到了在测增值的时候要求数目，在测活力的时候是不是不需要保证每次检测的细胞数目】
保证接种的细胞数目一致，而不是去保证每次检测的细胞数目一致
可以，我写在下面一楼:victory:
说的很详细，受教了！:hand:
你好，你们实验室H2O2诱导心肌细胞凋亡结果如何？可以交流一下么？
推荐还是用CCK-8，药物处理后，用CCK-8孵育，检测后可以洗干净直接去做其他检测
500孔的CCK-8多少钱？
哎~也不是很贵啊。可能是我搞混了，我记成一块板子就要大几百块了~能说一下您说在哪儿买的吗？用着效果还好?:hand:
可以进DOJINDO的官网
我收集了一些文献，你可以看一下，其中有用CCK-8 的孵育条件
刚才忘了插入...
请问楼主一下，细胞数量怎么确定呢，随着药物作用的时间不同，细胞生长数量也不同呀，比如，孵育24小时，测OD值是1左右，那孵育48小时之后，估计OD值就不是了吧~
做天数实验的话，细胞数量怎么确定呢？
楼主，你好！ECV304 (人脐静脉血管内皮细胞) 和HUVEC（人脐静脉内皮细胞），这两者有区别吗？
【细胞数量怎么确定呢，随着药物作用的时间不同，细胞生长数量也不同呀，比如，孵育24小时，测OD值是1左右，那孵育48小时之后，估计OD值就不是了吧】
细胞数量的不同，相同条件下所测得的OD值也肯定不同，如何确定细胞数量以及其目的、方法，你再仔细看一下我预实验写的内容，包括“预实验”的概念，内容较为累赘，不重复陈述。
【做天数实验的话，细胞数量怎么确定呢？】
不同种类的细胞株（甚至是不同批次），细胞状态都有所差异，细胞数量都会有所变化，关于这个问题，我只能说一个比较模糊的概念，做天数实验，假设做3天实验，如果加的药物对细胞有促进增殖作用，那么第一天的OD值尽量控制在0.5以下较好，第三天的OD值控制在1.5以下；做毒性实验，第一天正常组OD值控制在0.7左右，这样线性会控制的比较好。
做天数的时候，一定注意一点，例如第一天是下午2点开始加CCK-8孵育，4点检测，那么第二天下午还是应该下午2点开始加CCK-8孵育，4点检测，一定要保证实验的同步性。
之前的观点，ECV304 和HUVEC 是同一种细胞，但现在的信息，ECV304 现在大多都不被认为是血管内皮细胞，这个内容我没有具体考究过，抱歉。
减少细胞数量或者减少孵育时间，都可以操作。
这两个方法都可以控制OD值，OD值如果达到3.0，参考价值会减弱，不知道你的药物是粗增至还是抑制，前者，正常组OD值控制在0.5左右，后者，正常组OD值控制在1.0-1.5就可以了。
灰常感谢楼主的耐心解答~
楼主 你好 ！我最近也需要做CCK-8实验，之前做了一次，效果不理想，看了你的帖子之后发现你在这方面很在行，希望能加你QQ能咨询你些问题，我的QQ是 谢谢，加的时候注明CCK-8 谢谢！
你说的不是增殖，是毒性
加DAPI和CCK8后提取RNA蛋白没有影响？？
DAPI 属于细胞核的荧光染料，不会对CCK-8 的吸光度检测产生影响，但基于DAPI 和CCK-8 的作用原理，之后的实验应该尽量避免核基因片段和胞内脱氢酶的相关检测，即，DAPI 对于分离纯化RNA Pr 可能会有影响，CCK-8 则无。
已当面交流，期待接下来的结果！
【我们养新生大鼠神经元细胞，需要在细胞培养10-14天后造模，再加干预药物，再测细胞存活率，这样的话，细胞一般应该接种多少密度呢？】
神经元细胞没有亲自做过，细胞接种量的确定，可以参考帖子第一页，关于预实验确定细胞接种量的操作。
【我之前用96孔板养的细胞，接种时是50000个/孔，100ul/孔，种的时候很满，但是等去做CCK时孔里的细胞都不满】
’种的时候很满，但是等去做CCK时孔里的细胞都不满‘这句话我没有特别理解...或许能够描述的更加详细一点？
【正常细胞+培养基组OD值平均也只有0.3多，孵育了2小时，结果很不好，96孔板里养细胞似乎很不好做，我们在6孔板、培养瓶养的同一批细胞都不错，只有96孔板背景总是不干净，这有什么窍门吗？】
神经细胞因为存在突触的关系，跟一般的癌细胞或者干细胞培养的条件可能会有一定的差异，因为没有做过，只能以很理论的角度说下自己的看法， 如果6孔板和培养瓶都能做，而仅96孔板做不了，那很有可能是细胞的特性有关系，如果没有一定要求，说必须要在96孔板中培养，那使用6孔板操作当然是可行的，酶标仪检测时，可以将液体吸出转移到96孔板检测，唯一的缺点是会比较消耗试剂（因为CCK-8 都是以培养基1/10 比例加），至于96孔板的背景不干净，可能是由于细胞的正常代谢引起的，当然，如果可能你把照片可以贴给我，这样分析起来会更客观。
希望对你有用
请教：为什么整个染料形成过程只存在于培养基体系？染料不是由CCK进入细胞在线粒体中由酶催化生成的吗
CCK-8 是“Cell Counting Kit -8” 的简称，主要成分是WST-8 （一种水溶性较高的四唑盐），辅助成分是PMS（电子载体），原理上分两部分，PMS 先进入细胞内，进行胞内H 离子的运载，携带到胞外，反应第二步，H-PMS 再于WST-8 还原反应生成显色物。
反应的第一步，也就是H 离子的运载，介于细胞膜表面内外，第二步反应才是真正意义上的“检测反应”，所以说染料形成过程只存在于细胞外体系，也就是培养基体系。
MTT 反应比较简单，我的理解的话，MTT 进入细胞内，与线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，形成蓝紫色结晶，再用DMSO 溶解即可。
复孔的问题，归根结底就是“熟能生巧”，我个人的习惯使用单枪，贴着孔壁加，在加完所有的孔后将96孔板轻轻旋转2-3下，保证壁上没有残留的液体，同样也是保证每孔的“状态”一致。
你提到的培养基混匀，加样槽太大，应该是使用排枪时的操作，一般情况下一次性做的板比较多的，会考虑T型槽，否则的确有些浪费试剂，毕竟无法像普通的溶液一样回收，混入了培养基的CCK-8 也无法长时间保存，因人而异吧。
楼主说的很有用，最近在做HUVEC的增殖，求楼主加我QQ&&& &备注CCK-8&&感谢哇
我的扣扣：;)
【培养基蒸发的很厉害】是否能够具体描述？
一般情况下，很少会发生这种情况，如果遇到的话，可以尝试每孔都补偿一定量的培养基。
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CCK-8结果分析
四组材料 (每组重复3个样本，每个样本的表面积为：1*1cm)，样品放置在24孔板中，在表面分别种植原代成骨细胞，1万细胞每孔（最初实际粘附在样品上的细胞量应该是少于1万的），用CCk-8检测12小时 以及1天-7天的细胞增殖结果，发现四组材料从第1-3天OD值是上升的，但是3天后OD值开始下降了。
求这种现象的可能原因？接触抑制造成的？但接触抑制是细胞停止继续繁殖，细胞量不下降吧。
请多多指教。
每天测一次CCk-8，然后换新的培养液，养分应该是够的
我们做的是钽金属表面涂层样品，钽作为对照组，希望这个涂层是能促进细胞增殖的，在前3天是上升的，但是3天后下降了，现在测得结果感觉样品表面都没有细胞了似的，和空白组（培液+cck-8)的值差不多。
是材料导致细胞数量减少？还是其他原因导致的？
看文献，钽金属的生物相容性很好的
cck8检测细胞活性的啊细胞死了，就没值了吧，正常的原代细胞活不了很多天吧
测完cck8之后，继续用原来的板吗？
不应该是一个时间点一块板吗？
做完cck8之后，一般就不再继续养或者做其他用途了
CCK-8的优势不就是不对细胞造成损伤吗？
我只铺了一块板，测完CCK-8后继续养
CCK-8不是可以重复使用细胞的嘛。
我只铺了一块板，每次测完cck-8后再加入培养基继续养细胞。
我也是醉了 当然不可以！你看哪边说可以的 CCK-8的原理本来就是破坏性的 是MTT方法的改进 MTT就是直接与线粒体反应生成不可溶的甲赞 CCK8 MTT测完细胞基本就死了
测CCK8要每个时间点 铺快板子 测完 就扔了
哦哦，多谢多谢。
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[求助]cck8实验问题
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[求助]cck8实验问题
我做了一次，因为我的细胞增殖速度很慢，培养24h基本没有增殖。所以我铺板的细胞密度挺大的，每孔3*10五次。铺板后第二天换低血清培养基，1%浓度，饥饿培养24h。第三天，配好药物浓度梯度，加药。培养24h。第四天，因为我的药物是重金属离子，跟CCK8会有强烈的反应，我就先把原培养液吸出，很小心的尽力吸干净，我没有用PBS冲洗，因为我怕冲洗会冲洗掉细胞。接着加入100ul培养基每孔，再加入10ulCCK8每孔。孵育后半个小时，1个小时，2小时，4小时都在酶标仪上检测了。
我的第一个问题是：我的药物是致细胞凋亡的，有没有饥饿培养的必要呢？
第二个问题是：我的检测结果正常组OD值在0.5~0.4之间，加药组最低0.29，空白（只有培养基和CCK8）是0.27左右。这样的实验结果可信么？OD值范围是多少比较合适呢？必须要做OD和细胞数的标准曲线么？
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其实我觉得不需要饥饿，你换低血清培养基和饥饿，细胞状态也会不好的，贴壁细胞用PBS洗不太容易洗掉细胞的 还有你的OD值 太低了 试着加细胞浓度 或者你看看你的细胞状态吧 OD值太高或太低都不是很可信得
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我在镜下观察看到细胞是很多的，但是不知道为什么检测出来的OD值就很低了……
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药物跟CCK8反应，没洗板子。 致使显色太低？
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回复 #4 dongdongqiang 的帖子
但是我的正常组也是0.4-0.5之间的啊。
我想可能是细胞种的太多了，密度太大，导致细胞状态不好。
我再铺了一块板，这次没有饥饿培养的过程，加药24小时后镜下观察发现，加药组从低到高跟正常对照组基本没有变化。现在只能继续再放一会，明天很早去看看，会不会是作用时间不够啊……
细胞饥饿培养会有这么大的影响么？
我想了又想，这次跟上次的实在是无差别，只有去掉了饥饿培养这一步。那我的药对细胞的杀伤作用岂不是很小？
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还有，我这次铺板的密度是10四次方/孔。镜下观察细胞占了孔面积的约60%。
希望各位有经验的帮帮我啦。多谢！
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我做了一次，因为我的细胞增殖速度很慢，培养24h基本没有增殖。所以我铺板的细胞密度挺大的，每孔3*10五次。铺板后第二天换低血清培养基，1%浓度，饥饿培养24h。第三天，配好药物浓度梯度，加药。培养24h。第四天，因为我的药物是重金属离子，跟CCK8会有强烈的反应，我就先把原培养液吸出，很小心的尽力吸干净，我没有用PBS冲洗，因为我怕冲洗会冲洗掉细胞。接着加入100ul培养基每孔，再加入10ulCCK8每孔。孵育后半个小时，1个小时，2小时，4小时都在酶标仪上检测了。
我的第一个问题是：我的药物是致细胞凋亡的，有没有饥饿培养的必要呢？
第二个问题是：我的检测结果正常组OD值在0.5~0.4之间，加药组最低0.29，空白（只有培养基和CCK8）是0.27左右。这样的实验结果可信么？OD值范围是多少比较合适呢？必须要做OD和细胞数的标准曲线么？
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我想请教下你是如何很小心的尽力洗干净的而减少细胞丢失的呢？谢谢哈cck-8什么时候需测参比波长的od值_百度作业帮
cck-8什么时候需测参比波长的od值
cck-8什么时候需测参比波长的od值
Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析.其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）.生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比.因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析.}