第二节 细菌血清学鉴定法-第四军医大学基础医学教学实验中心
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第二节 细菌血清学鉴定法
血清学反应是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀或凝集现象。在微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果，是临床细菌性疾病诊断和病原菌鉴定的重要手段之一。血清学试验可分为血清学鉴定和血清学诊断两部分。用已知抗体(即含特异抗体的免疫血清或单克隆抗体等)检测标本中或分离培养物中未知细菌的种、型或细菌抗原，称为血清学鉴定；而用已知细菌或特异性抗原检测患者血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，作为某些感染性疾病的辅助诊断，称为血清学诊断。血清学试验基本类型包括凝集反应、沉淀反应和补体结合反应等。
一、玻片凝集试验
【实验目的】
1. 掌握玻片凝集试验的操作方法，了解其特点和用途。
2. 学习玻片凝集试验结果的观察方法。
【实验原理】
当颗粒性抗原与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象。
【试剂与器材】
1． 诊断血清：1∶10稀释的伤寒杆菌诊断血清。
2． 菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌24 h琼脂斜面培养物。
3． 器材：载玻片、毛细吸管。
4． 试剂：生理盐水。
【实验方法与步骤】
1． 取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1∶10稀释伤寒杆菌诊断血清1～2滴，第三格加1～2滴生理盐水。
2． 无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。
3． 同法取痢疾杆菌培养物少许，于第二格内混匀。
4． 轻轻摇动玻片，经1～2min后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为平等的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。
二、试管凝集反应——肥达反应
【实验目的】
1. 掌握肥达的操作方法，了解其特点和用途。
2. 学习肥达反应结果的观察方法。
【实验原理】
试管凝集反应是一种半定量的凝集反应。常用已知抗原测定受检血清中有无相应抗体及其含量，以辅助临床诊断或供流行病学调查分析。
【试剂与器材】
1． 诊断血清：1∶10稀释伤寒杆菌“H”血清、1∶10稀释伤寒杆菌“O”血清。
2． 菌液：伤寒杆菌“H”菌液、伤寒杆菌“O” 菌液。
3． 试剂：生理盐水。
4． 器材：小试管、吸管。
【实验方法与步骤】
1． 取洁净小试管14只分两排排列于试管架上，每排7只依次用蜡笔注明号码，于每管中分别加入0.5 ml生理盐水。
2． 在第1排第1管中加入1∶10稀释伤寒“H”血清0.5 ml，使血清与盐水充分混合，而后吸出0.5 ml注入第2管，同样予以混匀后吸出0.5 ml注入第3管。以此类推，稀释到第6管，自第6管吸出0.5 ml弃去。此时，自第1管至第6管的血清稀释倍数为1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640。第7管不加血清作为对照。
3． 同法用吸管吸取1∶10稀释伤寒杆菌“O”血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀释。
4． 用移液管吸取伤寒杆菌“H”菌液，加入第1排各管中每管0.5 ml，此时血清稀释倍数又增加了一倍。
5． 同法于第2排各管中加入伤寒“O”菌液0.5 ml。
6． 将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2~4h或37℃孵育箱中过夜，次日取出观察结果。
【观察结果】
1． 对照管无凝集现象，管内液体仍呈混浊状态。但如放置时间较长，细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反应。
2． 试验管与对照相比可见管底有不同大小的圆片状边缘不整齐的凝集物，上清则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用“+”号表示如下：
“++++”凝集很强，管内液体完全澄清，凝集块完全沉于管底；
“+++”凝集强，管内液体不完全澄清稍有轻度混浊，凝集块沉于管底；
“++”凝集中等强度，液体半澄清，凝集块沉于管底；
“+”凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底；
“－”不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。
3． 记录观察的结果并判断凝集效价。通常以能产生明显凝集（++）的血清大于稀释倍数作为该血清的凝集效价。如血清的最低稀释度（即第1管1:40）仍无凝集应报告为低于1:40。如血清的最高稀释度（即第6管1:1280）仍显完全凝集现象，应报该血清效价高于1:1280。
【注意事项】
观察切勿摇动试管，以免凝集块分散。
&　思 考 题
1. 生理生化反应鉴别细菌的原理是什么？
2. 细菌生理生化反应试验中为什么要设对照？
3. 血清学试验有哪些类型类型？
4. 影响血清学试验的因素有哪些？
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微生物鉴定中常用的生理生化实验28
微生物鉴定中常用的生理生化实验；摘要：大分子物质水解试验中，将所要检测的菌种（枯；杆菌、金黄色葡萄球菌）接种到淀粉培养基和油脂培养；糖发酵试验中向葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试；杆菌，并留一空白培养基试管对照；IMVIC试验中向蛋白胨培养基和葡萄糖蛋白胨水培；关键词接种无菌操作；前言微生物必须依靠包外酶对大分子物质进行水解后才；过观察细菌菌落周围的物质变
微生物鉴定中常用的生理生化实验摘要：大分子物质水解试验中，将所要检测的菌种（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）接种到淀粉培养基和油脂培养基上，培养一段时间后在淀粉培养基滴上碘液，通过比较透明圈来判断各微生物水解淀粉能力的强弱；观察油脂培养基上是否有红斑点产生来判断微生物是产生脂肪酶。糖发酵试验中向葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管中各接种大肠杆菌和变形杆菌，并留一空白培养基试管对照。经过一段时间培养后对试管中的颜色变化和产气情况进行观察。IMVIC 试验中向蛋白胨培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基中各接种上大肠杆菌和产气杆菌，经过一段时间培养后，向葡萄糖培养基的培养物中滴上甲基红试剂，通过颜色变化来判断微生物生长代谢产物中是否有有机酸产生；向蛋白胨培养基中先加入适量的乙醚后再沿壁加入对二甲基氨基苯甲醛试剂，根据产生红色反应层与否来判断微生物生长代谢中是否有产生吲哚，进而来判断微生物对色氨酸是否有分解能力。 关键词 接种 无菌操作前言 微生物必须依靠包外酶对大分子物质进行水解后才能被其加以利用，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液时显蓝色，当滴有碘液后不显蓝色则说明细菌产生了淀粉酶；脂肪水解后会产生脂肪酸降低培养基的PH值，使培养基中含有的中性红试剂由淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生的有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气。大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖并产酸产气；变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。当发酵产酸时，培养基试管中的培养液会由紫色转变为黄色，当产气时，试管中的倒置德汉氏小管中会有气泡。有些细菌能产生分解蛋白胨中色氨酸的色氨酸酶，分解产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。在细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变使加入培养基中的甲基红指示剂变红。在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢过程主要是酶促返反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内。许多细菌产生包外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异性，反应除出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被作为细菌鉴定和分类的内容。材料与方法1.1 材料1.1.1培养基 淀粉培养基：蛋白胨10g、NaCl5g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水1000ml、琼脂15-20g。油脂培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl5g、香油或花生油10g、1.6%中性红水溶液1ml、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml、PH 7.2。 蛋白胨水培养基：蛋白胨10g、NaCl5g、蒸馏水1000ml、PH 7.6。糖发酵培养基：蛋白胨水培养基1000ml、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2ml、PH 7.6、20%葡萄糖溶液10ml（葡萄糖发酵培养基）、20%乳糖溶液10ml（乳糖发酵培养基）。 葡糖糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO42g、蒸馏水1000ml、PH 7.0-7.2。 1.1.2标准菌株 酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡糖球菌、变形杆菌 1.1.2仪器及其他用品酒精灯 接种环 碘液 乙醚 吲哚 甲基红 对二甲基氨基苯甲醛 培养皿 试管 德汉氏小管 胶头滴管 1.2方法1.2.1大分子物质的水解实验(铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌) 1.2.1.1淀粉水解实验1） 配好培养基后灭菌，在无菌条件下制成平板并冷却。2） 用记号笔在平板底部化成四个区域，并标记好每个区域将要接种的菌种名称。 3） 将铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在无菌操作下点种到所对应的标记区域内，接种3个平板。 4） 将平板倒置在37℃的培养箱中培养24h。5） 观察各菌种的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均与铺满整个平板，观察菌苔周围出现无色透明圈。 1.2.1.2油脂水解实验1）配好培养基后灭菌，在无菌条件下制成平板并冷却。2）用记号笔在平板底部化成四个区域，并标记好每个区域将要接种的菌种名称。 3）将铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在无菌操作下分别画十字线接种到所对应的标记区域内，接种3个平板。 4）将平板倒置在37℃的培养箱中培养24h。5）取出平板，观察菌苔颜色，看是否出现红色斑点。 1.2.2糖发酵试验（大肠杆菌、产气大肠杆菌）注意：在将培养基装入试管时要先用胶头滴管将德汉氏小管注满培养基，再小心倒置在试管中，以防空气进入其中。1） 将配置好并标明培养基名称的发酵培养基灭过菌后冷却到一定的温度。 2） 用记号笔在个试管壁上标明发酵培养基将要接种的菌种名称。3） 取葡萄糖发酵培养基试管5只，分别按其试管上所标记的菌名接种相应的菌种，其中大肠杆菌2只，变形杆菌2只，另一只不接种，作为空白对照。4） 取乳糖发酵培养基试管5只，分别按其试管上所标记的菌名接种相应的菌种，其中大肠杆菌2只，变形杆菌2只，另一只不接种，作为空白对照。5） 将接种过的试管连同2只空白对照试管置于37℃的培养箱中培养24-48h。 6） 观察各试管颜色变化及德汉氏试管中有无气泡。1.2.3 IMVIC实验（大肠杆菌、产气大肠杆菌）1） 将配置好蛋白胨培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基用记号笔表明培养基名称后进行灭菌并冷却到室温。2） 取六只蛋白胨培养基试管，在管壁上标注好将要接种的菌种名称，对应接种大肠杆菌3只，产气大肠杆菌3只。3） 取六只葡萄糖蛋白胨水培养基试管，在管壁上标注好将要接种的菌种名称，对应接种大肠杆菌3只，产气大肠杆菌3只。4） 将接种过的试管置于37℃的培养箱中培养24-48h。5） 向培养48h后的蛋白胨水培养基内加入适量乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应（+）。6） 向培养48h后的葡萄糖蛋白胨水培养基培养物中加入甲基红试剂2滴，培养基变红色的为阳性（+），培养基变黄色的为阴性（-）。 2.结果与分析 2.1结果2.1.1大分子物质的水解实验(铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、淀粉水解阳性（+）为有水解圈；油脂水解实验阳性（+）为培养基由淡红色转变为红色。2.2.2糖发酵试验 阳性（+）为产酸或产气，阴性（-）为不产酸活不产气；普通变形菌产气较少。2.2.3 IMVIC实验吲哚试验阳性为有红色环状物，阴性无；甲基红试验阳性为培养基变红，阴性为培养基变黄2.2分析 1．大分子物质的水解实验中，在淀粉培养基中，枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌周围产生大小、厚度一致的透明圈，说明这两种菌产生淀粉酶且两者的淀粉酶水解活性大致相同。 2．在葡萄糖发酵的试验中，发现大肠杆菌较普通变形菌产气较多，说明大肠杆菌分解葡萄糖的能力较普通变形菌的强。3．在乳糖发酵的实验中，接种大肠杆菌试管中的德汉氏小管中有气泡存在，而普通变形菌中的没有气泡存在，说明大肠杆菌能够利用乳糖，而普通变形菌不能够将乳糖作为碳源来利用。4．在吲哚的实验中，有些接种大肠杆菌的试管中，在加入了乙醚后再滴加吲哚后并不显红色，可能是加入的乙醚的量把握不当或是乙醚和培养液没有充分震荡所致。3．小结本次试验基本成功，在这次实验中我们掌握了利用生理生化所微生物进行鉴定的方法，知道了不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，并对微生物的一些代谢过程的原理有所了解，且知道了对照组在实验中重要性。 4参考资料沈萍 陈向东
实验室环境和人体表面的微生物检查
微生物学实验【M】
高等教育出版社包含各类专业文献、行业资料、应用写作文书、各类资格考试、幼儿教育、小学教育、外语学习资料、高等教育、文学作品欣赏、微生物鉴定中常用的生理生化实验28等内容。
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12微生物生理生化鉴定
微生物生理生化鉴定；?目的要求?基本原理?实验器材?操作步骤；目的要求；?了解细菌生理生化反应原理以及在细菌鉴定中的重要；基本原理；?糖发酵试验：是鉴别肠道细菌的常用生化反应；糖发酵试验；大肠杆菌：产酸产气；大肠杆菌分解糖类产生多种有机酸，使培养液呈酸性；；发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂由紫色(pH6.8)变；乳糖发酵试验；大肠杆菌：+；变形杆菌：C；
微生物生理生化鉴定? 目的要求 ? 基本原理 ? 实验器材 ? 操作步骤目的要求? 了解细菌生理生化反应原理以及在细 菌鉴定中的重要作用 ? 掌握通过生理生化反应鉴别不同细菌 的基本方法基本原理? 糖发酵试验：是鉴别肠道细菌的常用生化 反应。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳 源和能源，但是它们在分解糖的能力上有 很大的差异，例如大肠杆菌能分解乳糖和 葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌分解葡 萄糖产酸产气，不能分解乳糖。糖发酵试验大肠杆菌：产酸产气大肠杆菌分解糖类产生多种有机酸，使培养液呈 酸性；产生的甲酸在酸性条件下可进一步裂解生 成H2和CO2发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂由紫色(pH6.8)变为 黄色(pH5.2)；气体的产生可由倒置的德汗氏小管 中有无气泡来证明。乳糖发酵试验大肠杆菌：+变形杆菌： CIMViC 试验? IMViC是吲哚试验（indol test）、甲基红试验 （methyl red test）、伏-普试验（Voges-Prokauer test） 和柠檬酸盐试验（citrate test）四个试验的 缩写。这四个试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气肠 杆菌，而且主要是用于水的细菌学检查，因为大肠 杆菌虽非致病菌，但在饮水中若大肠杆菌超过一定 数量则表示受粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在 于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。IMViC 试验? 吲哚试验：用来检测细菌对色氨酸的利用能力。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色 氨酸产生吲哚和丙酮酸，吲哚本身无色，不能 直接观察到，当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂 时，可形成红色的玫瑰吲哚。吲哚试验大肠杆菌：+产气杆菌： C阳性 阴性IMViC 试验? 甲基红试验：用来检测细菌发酵葡萄糖的产 酸能力。当细菌代谢糖大量产酸时，就会使 加入培养基中的甲基红指示剂由橘黄色 （pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基 红反应阳性。甲基红试验大肠杆菌：+ 产气杆菌： C阳性 阴性伏-普试验原理产气杆菌： V.P.试验阳性大肠杆菌： V.P.试验阴性V.P试验大肠杆菌：C产气杆菌：+阳性 阴性IMViC 试验? 柠檬酸盐试验：用来检测细菌利用柠檬酸的 能力。有些细菌能分解柠檬酸形成CO2，由 于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使 pH升高，当用溴麝香草酚蓝作为指示剂时， 培养基颜色发生变化。溴麝香草酚蓝变色范 围为，pH6.0-7.6呈绿色，pH＞7.6时呈蓝色。柠檬酸盐试验大肠杆菌： C产气杆菌：+阳性 阴性实验器材? 菌种：大肠杆菌，普通变形杆菌，产气肠杆 菌斜面各1支 ? 培养基：葡萄糖发酵培养基；乳糖发酵培养 基（内装倒置的德汉氏小管）；蛋白胨水培 养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；柠檬酸盐斜 面培养基 ? 仪器或其他用具：培养箱，试管架，接种环操作步骤? 编号：用记号笔在各试管上分别标明培养基名称和所 接种的菌名。 ? 接种：取盛有葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试 管各3支，分别按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种 普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。再将大肠杆 菌和产气肠杆菌分别接种于2支蛋白胨水培养基、2支 葡萄糖蛋白胨水培养基和2支柠檬酸盐斜面培养基中。 ? 将上述已接种的试管和对照管置37℃温室中培养 24~48小时。 ? 观察结果。基本操作（斜面接种法）? 点燃酒精灯。右手持接种环，在火焰上灼烧灭菌。 ? 试管口靠近火焰旁，用右手的小指与掌间拔掉左手上两 只试管上的棉塞，同时迅速将试管口在酒精灯上烧灼3s 左右，使管口上可能沾染的少量杂菌得以烧死。 ? 接种环轻轻接触菌苔，取出少许。注意接种环抽出时不 要碰到管壁和管口。 ? 迅速将接种环伸入另一试管，在培养基上轻轻划线，接 种菌体于其上。划线时，要由底部起划较密的平行线， 一直划到顶部，以充分利用斜面表面积，同时不要将培 养基划破。 ? 烧灼试管口，将棉塞塞上。塞棉塞时不要移动试管，以 免在移动中纳入可能含菌的空气。 ? 将接种针在火焰上烧灼灭菌后放回原处。
结果观察? 将葡萄糖蛋白胨水试管中的培养液一分为二，分别用 于甲基红试验和伏-普试验。? 甲基红试验 ：沿试管壁向培养液加入甲基红试剂4-6滴， 呈鲜红色者为甲基红试验阳性，呈橘黄色者为阴性。 ? 伏-普试验：在培养液中加入40% KOH溶液10滴，再 加入等量的5%萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱 中保温15-30 min如培养液呈红色为反应阳性。结果观察? 糖发酵试验：产酸：指示剂使培养基由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）；产气：倒置的德汉氏小管内 有气泡产生。? 吲哚试验：在培养液中加入乙醚约1 ml，充分振荡，使吲哚溶于乙醚中。静置片刻，待乙醚层浮于液面后 形成明显的乙醚层，再沿管壁加入吲哚试剂8-10滴。如有吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色，为阳性反应。结果观察? 柠檬酸盐试验：观察培养基颜色变化，含有 溴麝香草酚蓝的斜面呈蓝色者为阳性反应， 呈绿色者为阴性反应。
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细菌的生理生化试验
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