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【求助】WB,分子量180KD的蛋白的转膜条件？
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【求助】WB,分子量180KD的蛋白的转膜条件？
请问分子量180KD的蛋白用湿法怎么转呢？多少电流或电压？转多长时间？请各位高手指教！
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我以前也是转180kd左右的蛋白，半干转很难
湿转比较好，我是25v恒压转2。5小时
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绝对不加甲醇，
350mA 1。5小时 BIO－RAD
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请教，为什么 不加 甲醇？
我们用300mA，2h,湿转 ，北京六一的，效果不错
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大分子量蛋白不加，因为大家用的膜都是0。46um孔径的，小分子用甲醇效果好。
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大分子量蛋白不加，因为大家用的膜都是0。46um孔径的，小分子用甲醇效果好。
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请解释的再详细一点.
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甲醇虽然可以帮助蛋白向膜转移，但是其容易在膜上的微孔上引起还原反应，妨碍大分子蛋白质与膜的结合。
但是SDS可以帮助大分子蛋白向膜转移，故转移缓冲液中可不加甲醇，增加SDS.
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我还担心没人回答呢，多谢各位！
转印缓冲液中不加甲醇的确有道理，我这里也是BIO-RAD的仪器，明天再试试看。
还有一个问题：180KD的蛋白电泳时分离胶用10％，12％，8%的应该都可以吧？我看预染的MARKER都是可以分开的嘛，各位有何见解？
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提高高分子量蛋白转移效果有以下几种方法：
甲醇在其中的作用是增加蛋白与膜结合的能力，可增加转移时间，防止胶变形，但其可降低高分子量蛋白的转移效率，个人认为可适当加10%-15%的甲醇，既增加蛋白的结合，对转移效率影响也不大。
另可加入终浓度0.1%SDS，其可增加转移效率，但与甲醇作用相反，可减少蛋白与膜结合的能力。
总之，你可甲醇和SDS 都适当加点，低浓度，我们一直这么做的，转移200KD左右的蛋白都没问题。
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我按楼上战友说的做礼物，可是仍没有结果，预染MARK最上面一条250KD的也是转上去的，那是怎么回事呢？内参42KD也做出来很亮的，难道是我的抗体失效了吗？小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
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在做western blotting时，湿转，求助
在做western blotting时，湿转，一般转膜缓冲液大概加多少毫升？你们是加多少？
对实验不懂
半干转，加多少?
目的蛋白是56kd的话时间多少比较合适呢？
半干转还用两个小时？我们都最多20min啊
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western blot转移电泳一般操作流程
总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。
电泳转膜基本操作流程
电转缓冲液和电转条件的选择
对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad小型 Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表：
Mini Trans-Blot槽湿转设备
Trans-Blot半干转印系统转印槽
槽式转印半干转印
Mini Trans-Blot槽 Trans-Blot半干转印系统转印槽
印迹区域（宽 x 长）
10 x 7.5 厘米
24 x 16 厘米转移参数
缓冲液要求
按夹层结构厚度确定
转移时间（高强度）
15–60 分钟
蓝胶冷却装置/冷却旋管
18.3 x 19.3 厘米
1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）
16 x 20 厘米
1 块凝胶（2块凝胶堆叠）
16 x 16 厘米
13.3 x 8.7 厘米
3 个凝胶并列
8.3 x 7.3 厘米
每个凝胶夹1块凝胶共2个凝胶夹（两种尺寸）
4个凝胶并列
8.6 x 6.8 厘米
通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。& && &
而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2） 之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。& &&&
需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。
具体的对于电压/电流的选择，可以参照下表。但合适的电转条件需要根据凝胶的厚度、膜的种类、蛋白分子量、电转缓冲液选择最优化的方案。
SDS-PAGE Gels (Towbin Buffer)
低强度高强度
Mini Trans-Blot槽
30 V/90 mA, 16 hr
100 V/350 mA, 60 min
Trans-Blot半干转印系统转印槽
Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 minIsoelectric&&Focusing Gels, Native Gels, Basic Proteins, and Acid-Urea Gels (0.7% acetic&&acid)
低强度高强度
Mini Trans-Blot槽
30 V/10 mA, 16 hr
100 V/350 mA, 1 hr
Trans-Blot半干转印系统转印槽N/AMini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 minLarge gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min
（乐研生物 ）
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【求助/交流】请教大分子量蛋白western blot转膜的一些问题
有人做过分子量为140以上蛋白的western blot吗？湿转转膜条件一般是怎么样的？一般有什么优化条件。。。。
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【求助】大分子量蛋白转膜
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【求助】大分子量蛋白转膜
我做的是140KD的蛋白,几次都没有结果.同样的样品内参(50KD)做出来了.
140KD的蛋白6%＆8%的胶都跑过,转膜是70或80分钟,半干转(BIORAD),10V,0.45的PVDF膜.一抗1:200,看不见荧光,也压不出带.
但是免疫荧光做出来了.
不知是怎么回事,郁闷啊.
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分子量太大了,试试湿转吧.
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我做过170 kD和120 kD的蛋白Western。都做出来了，140 kD的蛋白不算是大分子，只能算一般的分子，应该是比较好做的。不过我转膜用的是湿转。如果你有湿转电转槽的话，可以试试25 mA恒流过夜（12 h）。
此外，显影也应该提醒你。
一般actin在暗室是可以看到荧光的，但是大部分蛋白由于表达量少是看不到荧光的。这种情况下，首次曝光请用3min，因为ECL荧光会很快淬灭。至于actin，你就算过1个小时再去曝光也是没有关系的。
还有问一下你所购买抗体的厂家，你的抗体是否可以检测Western？虽然大部分抗体是能做免疫组化就能做western的，但确实有少量抗体只能做免疫组化，不能做western.
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140KD的蛋白6%＆8%的胶都可以，那个BIORAD的半干有点难转的，可以试试15V*2h。转完了用丽春红染下看看。祝好运！
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半干转的方法,你可以试试18V* 35min ,我以前做过160kD左右的很多种,都很顺利
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你检测170KD分子的蛋白用的是什么条件，我也准备做这么大的蛋白，是新手，没经验，恳请你多给些建议。另外，我现在正在做SDS－PAGE，实验室的老师都说没必要做蛋白定量，认为通过调节样本的稀释比例，能跑出较均一的条带就可以了，你觉得是这样吗？非常感谢。
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这个分子量用半干和湿转都是没问题的，建议用预染marker监测一下转移程度。
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没有爆出来，原因有很多，不一定是转膜的问题。140kd，分子量不算大，6%或8%的胶都可以，半干转肯定是没问题，你用10v的话，当时电流怎么样，你再优化一下条件，用个预染marker做一下标记，试一下170ma，90min，我用上述条件转160kd也没问题。还有抗体的问题也是很重要的。再试试吧。
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我做的事170KD的蛋白，转印后用考染胶上还是有条带，立春红染膜上也有条带。我用的是300mA,90分钟，请问zhangdan982你用什么方法转膜较彻底？怎么做才能使电泳槽的温度维持在4度？谢谢。}