“长寿基因”SIRT6维持人干细胞活力的新机制 - 微科普
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“长寿基因”SIRT6维持人干细胞活力的新机制
作者：孙学军
时间： 21:48:53
& & &最近《细胞研究》发表一篇来自北京多家单位关于干细胞的一篇研究，其中涉及到抗氧化的研究引起我的关注。阅读后总体感觉不错，但仍然觉得不够全面，因此提出以下一些问题，作为学术探讨。因为对干细胞的研究属于外行，或有不当。
既然氧化损伤是导致干细胞早衰的重要因素，那么或许可以采用理想的抗氧化物质，例如NAC、氢气作为干预手段。不过从这个研究中发现，如果将SIRT6去除，细胞内活性氧水平增加，认为这是抗氧化能力降低导致的结果，有一个比较奇怪的推测，因为细胞氧化水平提高是激活抗氧化系统的重要信号，这似乎有矛盾。
即使内源性抗氧化NrF2是活性是这种抗氧化作用的基础，那么应该采用激活该系统的药物如萝卜硫素作为阳性对照，而且从实际应用角度，如果该系统比较关键，利用基因手段只能下下策，作为研究手段是没有问题的。另外作为抗氧化系统，HO-1并不是唯一抗氧化作用的分子，而且这个分子也不是理想的效应分子，更多更常用的目标基因为什么不进行验证。
1月15日，中国科学院生物物理研究所刘光慧实验室与北京大学汤富酬实验室及中科院动物研究所曲静实验室合作，在Cell Research&杂志发表了题为SIRT6 safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivating NRF2&的研究论文。该研究首次揭示了SIRT6协同转录因子NRF2，共同激活抗氧化基因的表达，参与人类干细胞稳态维持的新机制，为衰老和衰老相关疾病的研究和干预提供了新的潜在靶点和思路。
SIRT6为Sirtuin家族蛋白的成员，是酵母Sir2蛋白在哺乳动物中的同源基因。早在1999年，研究者发现Sir2基因具有延长酿酒酵母寿命的作用，因此又被称为&长寿基因&。在哺乳动物中，SIRT6参与了衰老的调节以及寿命的调控。过量表达SIRT6能够延长雄性小鼠的寿命，而敲除SIRT6则会使小鼠表现出早衰的症状，且寿命缩短至只有约1个月。SIRT6缺失影响了DNA损伤修复和端粒稳定性，致使小鼠出现细胞和机体的稳态失衡及早衰。然而，由于缺乏有效的人类衰老研究体系，SIRT6能否调节及如何调节人类的组织细胞衰老尚不明确。
SIRT6缺失的小鼠表现出的骨质疏松和脊柱弯曲等异常提示了SIRT6在中胚层组织稳态维持中扮演着重要角色。干细胞的衰老或衰竭是机体衰老的重要特征。间充质干细胞存在于骨髓、脂肪、骨骼、肌肉、胰腺以及牙周等组织中，在中胚层组织的再生中发挥重要作用。间充质干细胞随年龄增长而出现的数目减少或功能紊乱被认为是骨质疏松、肌肉萎缩、血管退行、脂肪代谢紊乱等衰老性疾病的重要原因。因此，该研究旨在探索SIRT6在人类间充质干细胞衰老及稳态维持中的作用及机制。
在该项研究中，研究人员利用TALEN介导的基因编辑技术产生了SIRT6纯合性敲除的人间充质干细胞。SIRT6缺失的人间充质干细胞表现出加速衰老的特征，说明SIRT6是该细胞中抑制衰老的重要组分。但与小鼠不同的是，SIRT6在人间充质干细胞中的缺失并没有导致细胞核内遗传物质的损伤和基因组不稳定性。研究团队通过对可能影响细胞活力的小分子化合物库进行筛选，发现SIRT6敲除后的间充质干细胞对于氧化应激诱导的凋亡更为敏感。进一步研究发现SIRT6缺失显著降低人间充质干细胞的抗氧化能力，并引起胞内活性氧和DNA氧化产物的聚集。
RNA测序结果显示，受转录因子NRF2调控的一系列抗氧化基因在SIRT6缺失的间充质干细胞中均发生了不同程度的转录抑制。其中血红素加氧酶（HO-1）的转录沉默是人间充质干细胞抗氧化能力减弱和加速衰老的重要因素。该研究进一步揭示了SIRT6在人间充质干细胞中作为NRF2的辅助激活因子发挥作用。一方面，SIRT6在HO-1基因启动子区作为脚手架蛋白（Scaffold protein）帮助NRF2招募基础转录机器。另一方面，SIRT6催化H3K56去乙酰化，这在染色质水平使得NRF2转录复合物更加稳固。SIRT6与NRF2协同作用确保了人间充质干细胞中的抗氧化基因得以正常表达，并可据此有效对抗衰老过程所伴随的氧化应激。
该项研究为人类SIRT6的生物学功能研究提供了新视角。之前小鼠的研究显示SIRT6主要作为H3K9的去乙酰化酶而行使转录抑制作用。而该研究首次揭示在人间充质干细胞中，H3K9并非内源性SIRT6的有效底物，相反，SIRT6通过其特异的H3K56去乙酰化酶活性发挥对NRF2靶基因的转录激活作用。此外，该项研究首次揭示了SIRT6具有&抗氧化&的生物学活性，这对于深入理解SIRT6对衰老和寿命的调控及探索衰老相关疾病的干预具有重要意义。
该工作由中科院生物物理所、北京大学、中科院动物所以及杭州师范大学等科研机构合作完成。生物物理所研究员刘光慧、北京大学研究员汤富酬及动物所研究员曲静为该论文的共同通讯作者。生物物理所博士研究生潘慧泽、博士后管娣和北京大学博士研究生刘晓萌为该文的并列第一作者。研究受到科技部&973&计划、&863&计划、国家自然科学基金、中科院干细胞与再生医学战略先导专项以及中国博士后科学基金等资助。
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于Nrf2调控SIRT6表达的初步研究的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：第 38卷第 3期 2015年 9月南京师大学报(自然科学版) JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY(Natural Science Edition) Vo1.38 NO.3 Sept,2015 Nrf2调控 SIRT6表达的初步研究杨文娟,丁 贺,刘新华,刘海霞,桑泽玲,温传俊(南京师范大学生命科学学院,江苏省分子细胞生物学研究所,江苏南京 210023) [摘要】衰老是一个普遍的、动态的,并持续发展的复杂过程.对其机制的研究中,比较公认的是氧化应激损伤理论,其中核转录因子 Nrf2发挥重要的作用,这一理论主要强调在寿命调节中Nrf2的抗氧化作用.而本实验结合生物信息学、生物化学、细胞生物学等方法证明去乙酰化酶蛋白家族成员 SIRT6的表达受 Nrf2的调控,即提示 Nrf2的抗衰老作用可能是通过 SIRT6发挥作用. [关键词] 衰老,Nrf2,SIRT6 [中图分类号]Q28 [文献标志码]A [文章编号](9-07 The Prelim inary Study on Nrf2 Regulating SIRT6 Expression Yang Wenjuan。Ding He。Liu Xinhua,Liu Haixia,Sang Zeling。Wen Chuanjun (School of Life Sciences,Nanjing Normal University,Jiangsu Province Key Laboratory for Molecular andMedicalBiotechnology,Nanjing 210023,China) Abstract:Aging is an universal,plex process.The oxidative stress theory is a generally recognized expla- nation of a molecular mechanism underlying the aging process.The nuclear transcription factor Nrf2 plays an important role in this process.A series of experiments were done to verify that SIRT6 was a possible target gene of Nrf2 and it may act in conjunction with Nrf2. Key words:aging,Nrf2,SIRT6 衰老的氧化应激理论指出:机体内氧化损伤的积累导致了衰老的发生,而这些损伤主要是由活性氧自由基(ROS,reactive oxygen species)的产生造成的….当细胞受到 ROS刺激时,细胞内的一个重要抗氧化调节者是 Nrf2(nuclear factor—erythorid2一related factor 2).Nrf2是一种碱性亮氨酸拉链转录因子,C 的一员.正常情况下,Nrf2与其抑制因子 Keapl(kelch—like ECH—associated protein 1)结合,通过 26s蛋白酶体的降解作用维持 Nrf2的表达稳定性.在细胞受到 ROS的刺激后,Nrf2与 Keapl解耦联并转入细胞核内,与小 Mar蛋白结合形成异二聚体,识别并结合ARE(anti0xidant response element),启动下游一系列抗氧化蛋白基因,如 HO一1 heme Oxygenase 1)、GST(glutathione S-transferases)的转录,从而提高细胞的抗氧化能力b],检测下游抗氧化基因的表达情况能间接地反映 Nrf2的表达水平. 研究发现,去乙酰化酶蛋白家族的成员 Sir2(沉默信息调控因子 2)可以显著延长酵母的寿命.哺乳动物基因组编码 7种 Sir2家族成员即 SIRT1~SIRT7.其中有报道 :SIRT6过表达的小鼠寿命较对照组明显延长,进一步研究发现 SIRT6可以通过降低血清中IGF一1(胰岛素样生长因子 1)水平及下游的级联效应], 同时抑制炎症反应,参与DNA修复等途径对寿命进行调控. 虽然衰老不是一种疾病,但是很多疾病的发生都和衰老有关,因此寿命的研究对人类的健康有重大意义.Nrf2可以提高细胞的抗氧化能力,但有文献报道,过表达一些主要的抗氧化基因并不能显著延长小鼠寿命.另有文献报道,两种品系的 SIRT6转基因小鼠中,雄性小鼠的寿命较野生型明显延长,而在雌性小鼠中却无此明显差异&].同样 Keapl功能部分缺失的雄性果蝇较野生型的寿命明显延长,而在雌性果蝇收稿日期:. 基金项目:国家自然科学基金(057). 通讯联系人:温传俊,副教授,研究方向:肿瘤分子细胞生物学.E-mail:wenchuanjun@h0tmaiL corn - -49 —- 南京师大学报(自然科学版)
第 38卷第 3期(2015年) 中突变型和野生型寿命也没有明显差异.因此本实验结合 Nrf2与 SIRT6在调节寿命中所表现的相似功能,猜想出两者之间可能存在着相互调控的作用.利用一些细胞生物学、生物化学、生物信息学等方法证明,SIRT6可能是 Nrf2的靶基因从而介导 Nrf2延长寿命的作用. 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1
Nrf2敲除小鼠 Nrf2敲除的C57BL/6J小鼠来自江苏省中医药研究院. 1.1.2 试剂真核表达质粒 Nrf2、pGL3.Basic载体、内参质粒 pRL—TK为本实验室保存;小提质粒试剂盒购自 Biomega公司,割胶回收纯化试剂盒购自Promega公司,连接酶和限制性核酸内切酶均购自大连宝生物 Takara公司,转染试剂脂质体 2000购自Invitrogen公司,高糖 DMEM培养基和胎牛血清购自Gibico生物公司,Nrf2抗体购自Abcam公司,SIRT6抗体和 NAPDH抗体均购自CST公司,反转录试剂盒和Q—PCR试剂盒均购自Takara公司,双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司. 1.1.3 细胞 人胚肾细胞株(HEK一293)、肝癌 7402细胞为本实验室保存,小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为原代分离细胞. 1.2 方法 1.2.1 质粒构建 1.2.I.1
H—Keap1质粒的构建利用 NCBI找到 H—Keapl的编码序列,结合 Prime 5.0设计了如下引物: up 5 -3 ; down 5 .TCAACAGGTACAGTTCTGCT一3 . PCR产物纯化后用 I、 n I于 37℃水浴锅中双酶切 3 h 4 h,割胶回收后,与 Xoh I、 n I双酶切后的pEGFP—C,载体 16。c过夜连接,连接产物转化感受态,挑取克隆,进行菌液验证,提取质粒送去测序. 1.2.1.2 SIRT6启动子质粒构建利用 UCSU找到人的SIRT6启动子序列,选取转录起始位点上游约 2 000 bp.结合 Prime 5.0及 NCBI设计如下引物: up 5'-TGGGTAGCTC一3 ; down 5 .一3 . PCR产物经纯化后用 Sac I、Hind m 37 oC水浴双酶切 3 h~4 h,割胶回收后,与Sac I、Hind llI双酶切后的pGL3.Basic载体 l6℃过夜连接,连接产物转化感受态细胞,挑取克隆,菌液验证,进行测序. 1.2.1.3
SIRT6启动子区域缺失突变和点突变质粒的构建利用TFSEARCH分析SIRT6启动子区域 GGCG一,并以上述 TATG一点突变序列的质粒并命名为SIRT6PM,又构建了SIRT6 promoter缺失的突变质粒 SIRT6P2,及 SIRT6P2的点突变质粒 SIRT6P2M.利用Prime 5.0设计引物如下: SIRT6PM(1723bp)up 5 一3 , down 5 -ATCGGAAGCGGGGC一3 : SIRT6P2(481bp)up 5 A一3 , down 5'-ATAAGCTTGGGGCGGGGCGGGGAAGAA一3 ; SIRT6P2M(481bp)up 5 一TATCTCGAGA IvI’A一3 , down 5 ATCGGAAGCGGGGC一3 . PCR产物经纯化后用 Xho I、扰 m 37 oC水浴双酶切 3 h-4 h,割胶回收后,与Xho I、饿nd II1双酶切后的pGL3一Basic载体过夜酶连,菌液验证,进行测序. 一50 —杨文娟,等:Nrf2调控 SIRT6表达的初步研究 1.2.2 双荧光素酶报告基因活性检测弃去 24孔板中的细胞培养液,PBS洗 2~3次后吸净,每孔加人双荧光素酶报告基因检测试剂盒中的被动裂解液 100 L,于冰上裂解细胞 15 min,每隔 15 min摇晃一次.收集细胞裂解液,12 000 dmin离心 l0 min,吸取 2O L细胞裂解液于化学发光仪的专用 96:￣L板中后,加人 100 L 1xLuciferase Assay Buffer 1I 测出萤火虫荧光素酶活性值,再在相应孔中加入 100 IxL 1XStop&Glod Buffer,检测得到海肾荧光素酶活性值.每孔细胞的转染效率用内参海肾荧光素酶活性校正,处理数据时利用萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值来比较相对荧光值的大小. 1.2.3
RNA提￣ vXTZQ—PCR分析细胞 RNA的提取:弃去培养基,1xPBS洗 1-2次后吸净,六孔板中每孔加人 500 L Trizol,室温静置 15 min,每隔 5 min摇晃一次,使细胞充分裂解.将裂解液转至 1.5 mL进口EP管中,然后加入 0.1 mL预冷的***仿,振荡 15 s使其充分混匀后室温静置 5 min.4 oC,12 000 r/min离心 10 min,可见 EP管内溶液分层. 转移上层水相至另一 EP管中(200 IxL即可),加入等体积预冷的异丙醇,上下颠倒混匀数次后,室温静置 10 min.4℃,12 000 r/min离心 10 min,EP管底可见 RNA沉淀,小心吸尽上清液,向 EP管中加入 1 mL 75% 乙醇(用 0.1% DEPC水现配现用),轻轻颠倒数次以清洗 RNA沉淀,4℃,7 500 r/min离心 5 min,再次沉淀 RNA.弃去上清液,并将 EP管倒置于干净的滤纸上以除去管内残余的乙醇(不宜太干,以防影响 RNA溶解),最后加入适量 DEPC水溶解 RNA. 组织 RNA的提取:劲椎脱臼处死小鼠后,于解剖板上取出所需组织,预冷的 lxPBS清洗组织直至没有血迹.手术剪剪取 50 mg~100 mg组织于进口EP中,加入 1 mL Trizol,将组织剪碎后,组织匀浆器破碎,室温静置 10 min.EP管中加人预冷的 300 I.LL***仿,振荡 20 s,室温静置 10 min,4℃,12 000 r/min离心 15 min. 转移上清至另一个 EP管中,加人等体积的预冷异丙醇,充分混匀后,一2O℃静置 30 min,管底即可见白色沉淀.4℃,12 000 r/min离心 10 min,弃上清,加入 1 mL预冷的75%乙醇(用 0.1% DEPC水现配现用),4℃, 7 500 r/min离心 5 min,弃上清.并将 EP管倒置于干净的滤纸上以除去管内残余的乙醇(不宜太干,以防影响 RNA溶解),最后加入适量 DEPC水溶解 RNA. RNA经 NanoDrop分光光度仪测定合格后一部分于一80 cI=保存,一部分反转录得到 cDNA,利用Q.PCR 检测其 mRNA表达水平.操作过程严格按照 Takara试剂盒说明书进行. 1.2.4 蛋白提取以及 Western blot分析弃去培养基,1 xPBS洗 3次,六孔板中每孔加入 200 IxL RIPA裂解液(50 mmol/L Tris—HCI pH=7.5, 0.5% sodium deoxycholate,150 mmol/L NaC1,1%NP一40,0.1% SDS,100￣PMSF,10Xcocktail)置冰上裂解细胞 30 min,每隔5 min摇晃一次,充分裂解细胞,收集裂解液于 1.5 mL EP管中,12 000 r/min离心 10 min,将上清转移至新的 1.5 mL EP管,加入 5XSample Buffer充分混匀,95℃煮样 10 min,煮样后分装样品,一部分存放于一80℃,另一部分进行后续实验分析.10%~12% SDS PAGE电泳恒压 90 V,待样品跑过浓缩胶,电压改为 120 V.恒流 350 mA,90 min转移蛋白于 PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭 90 min,4 oC孵育一抗过夜, 37 qC孵育辣根过氧化物酶标记的二抗 2 h~4 h,利用 ECL显色法进行显色并曝光,保存数据. 1.2.5 原代小鼠胚胎成纤维细胞的分离取 8周龄的雌、雄小鼠,下午 2:00按 1:1比例合笼,次日早 8:30前检查母鼠孕栓(乳白色或蛋黄色胶冻状物即定为怀孕 0.5 d).将妊娠 l2.5 d~13.5 d的母鼠颈椎脱臼处死,在 75%酒精中浸泡 1 min~2 min,于超净台中,用止血钳夹住腹部皮肤向头尾两侧牵拉,撕开腹腔,暴露出母鼠子宫.用眼科镊夹住一侧子宫, 分离子宫系膜,剪断子宫角和子宫颈,将整个子宫分离下来(注意勿使子宫滑落到腹腔外,避免污染).用含有双抗的PBS冲洗子宫,直至无血迹,转入含双抗 PBS的培养皿中.无菌取出胎儿,去头、内脏和四肢于 EP管中保存,用于胚胎小鼠基因型鉴定,将剩余的躯干部置于离心管中,加人适量含双抗的PBS反复振荡几次,直至无血迹.将洗净的躯干部剪碎(&1 mm ),置于(0.25%+0.02%)EDTA胰酶中37℃消化 30 min.将滤液转移至 15 mL离心管中,1 000 r/min离心 5 min~10 min,弃上清液,加4 mL含双抗的 PBS,用移液枪反复缓慢吹打,使细胞重新悬浮,1 000 r/min离心5 min~10 min,重复此过程 3~4次,以洗去小血块以及其他杂质,直至沉淀呈乳白色为止.吸弃上清后,再加人 7 mL左右培养液,重新制成细胞悬液,接种在细胞培养皿中,24 h全量换液.置于 37 oC、5%CO 饱和湿度的CO 培养箱内培养. 一51 —南京师大学报(自然科学版)
第 38卷第 3期(2015年) 1.2.6 统计学处理分析实验重复 3次,采用 Origin 8统计软件分析数据,t检验计算标准差组间差异,其中P&0.05, P&0.05, ￥ P&0.001. 2 结果 2.1
Nrf2蛋白增加了 SIRT6的启动子活性利用生物信息学软件 UCSC查找 SIRT6的启动子(包含转录起始位点上游 2 000 bp),又因为考虑到有些特定基因的转录区域内部也存在着转录因子的结合位点,因此选取 SIRT6转录起始位点上游的 1 687 bp与下游的 35 bp插人pGL3一Basic载体中,将构建好的质粒转染 HEK一293细胞,48 h提取蛋白,利用双荧光素酶报告基因检测构建好的SIRT6启动子质粒的活性.PGL3一SIRT6启动子的活性较 PGL3一Basic上升了将近 60倍(图 1(a)),充分说明SIRT6启动子质粒构建成功.随着 Nrf2的转染浓度的增加,SIRT6启动子活性也随之增加,并具有显著性差异(图 1(b)).加入 Keap1干扰 N
的表达后,SIRT6启动子的活性也明显下降(图 1(c)).以上结果说明,Nrf2这一转录因子对 SIRT6启动子具有一定的激活作用. 2-2 2.0 1-8 1.6 1.4 1.2 1.O O.8 O.6 O.4 O.2 O {
1.6 1.4 1.2 1.O O.8 0.6 0.4 0.2 O pGL3
SIRT6prom oter/ng +
+ promoter-luc+
Nrf2/ng 一 1 50
500 SIRT6 promoter/ng + Nrf2/ng + Keap1/ng 一+ + 200 图 1
293细胞中 Nrf2蛩白增加了 SIRT6的启动子活性 Fig.1
Nrf2 protein increased SIRT6 prom oter activity in 293 cells (a)利用双荧光素酶报告基因验证 SIRT6启动子的活性;(b)利用双荧光素酶报告基因验证 Nrf2转录因子对 SIRT6启动子活性的作用; (c)利用双荧光素酶报告基因验证 Keap1对 Nrf2促进 SIRT6启动子活性的作用(a)SIRT6 pmm0ter activitywas verified bythe dualluciferase reporter assay.(b)Inthe dualluciferase reporter assay,Nrf2increasedthe activi. ty ofSIRT6promoter.(c)Verifiedthefunctions ofNrf2inhibitoryfactorKeap1 onthe SIRT6 promoter activity 利用 TFSEARCH分析 SIRT6启动子区域可能存在的Nrf2结合位点(转录起始位点下游+6处,序列为-GGC一),并对其进行点突变,同时缺失 SIRT6启动子区域上游约 1 000 bp构建了SIRT6启动子缺失突变质粒(图 2(a)),双荧光素酶报告基因鉴定一系列突变质粒活性后,又检测了 Nrf2对 SIRT6PM、 SIRT6P2M、SIRT6P2活性的作用.图 2(b)结果显示,加入 Nrf2对 SIRT6PM的活性没有促进作用,加入 Keapl后也没有抑制作用,说明预测位点对于 Nrf2转录因子与 SIRT6靶基因结合的重要性.图2(c)结果显(a) -1 687 “ L———-
Hl啪Ⅸ Im) — 5 1.........一 SIRT6 promoter (1 723bp) SIRT6PM (1 723 bp) SIRT6P2 (481 bp) SIRT6 P2M f481 bp) -35 _30 . 25 . 20 . 15 . 1O . O5 0 8 10 l 8 l 6 4 童 2 蛊 0 (c) SIRT6promoter/ng +
SIRT6P2/ng +
一 一 Nrr2/ng 一 +
SIRT6P2M/ng 一 一 +
+ Keap1/ng 一 一 lO0
Nrf2/ng 一 +
293细胞中检测Nrf2对 SIRT6启动子区点突变和缺失突变质粒的活性 Fig.2
The effects of Nrf2 on the SIRT6 promo￣r m utation plasmids activities in 293 cells (a)sIRT6启动子的一系列缺失突变和点突变的片段简图;(b)双荧光素酶报告基因检测 Nrf2对 SIRT6PM的活性;(c)双荧光素酶报告基因检测 N
对 SIRT6P2和 SIRT6P2M的活性(a)SIRT6 promoter deletion and point mutations were shown by schematic.(b)Analyzed the effects of Nrf2 on mutated plasmid SIRT6PM activity by the duallueiferase reporter assay.(c)Verified the funotion ofNrf2 on SIRT6P2 and SIRT6P2M 一52 一口I10u∞ 10
IJ ∞一时叫釜 ∞0_【Iau∞ 0 譬一H
三_Bl∞ ou—g 0∞ H0n杨文娟,等:Nrf2调控 SIRT6表达的初步研究董_薹l § 鼋星 1.2 1.0 O.8 O.6 0.4 O.2 O (a) - l Nrf2(+/+)Nrf2(+/一)Nrf2(-/一) (d) l I 1.2 1.0 至 s 0.2 0 1.2 1.0 (b) Nrf2(+/+)Nrf2(+/一)Nrf2(—/一) (c)
鼍 2. 4 忘一 g
2.0 (c) 蜘玎1 SⅡ{=I2 Sm】3S r4 S r5 S r6 SⅡ【r7 (f) 图5 Nrf2 、Nr置2 、Nrf2-/-基因型的3组小鼠心脏和肺部组织中 Nrf2与 SIRT6的mRNA表达水平检测 Fig.5
The m RNA levels of Nrf2 and SIRT6 in the hearts and lungs of mice (a)0.PCR分析 Nrf2 、Nrf2 、Nrf2 基因型小鼠心脏组织中Nrf2的 mRNA表达水平.(b)Q.PCR分析 Nrf2 、Nrf2 、Nrf2 基因型小鼠心脏组织中 GST的 mRNA表达水平.(c)Q—PCR分析 Nrf2+'+、Nrf2 、Nrf2-I-基因型小鼠心脏组织中SIRT1.7的 mRNA表达水平.(d)Q.PCR分析 Nrf2￣/&、Nrf2 、Nrf2+基因型小鼠肺部组织中 Nrf2的 mRNA表达水平.(e)Q.PCR分析 Nrf2￣'￣、Nrf2 、Nrf2+基因型小鼠肺部组织中 GST的 mRNA表达水平.(f)Q—PCR分析 Nrf2 、Nrf2+/-、Nrf2-'-基因型小鼠肺部组织中 SIRT1-7的 mRNA表达水平(a)The Nrf2 mRNA levels were analyzed by Q—PCR in hea￣s of mice.(b)The GST mRNA levels were analyzed by Q—PCR in hea￣s of mice. (c)The SIRTI一7 mRNA levels were analyzed by Q—PCR in mice hearts。(d)The Nrf2 mRNA levels were analyzed by Q·PCR in lungs of mice. (e)The GST mRNA levels were analyzed by Q—PCR in lungs ofmice.(f)The SIRT1—7 mRNA levels were analyzed by Q—PCR in mice lungs 在探索 Nrf2和 SIRT6的结合位点过程中,缺失 SIRT6启动子的上游序列后,双荧光素酶报告基因结果提示,缺失的上游 1 000 bp和软件预测的结合位点对于 Nrf2与 SIRT6启动子区的结合也具有重要作用,因此进一步的验证还可以通过染色质免疫沉淀技术(chromatin immun叩recipitation assay,CHIP)分析出Nrf2 与 SIRT6的具体结合位置.如果 Nrf2不是直接作用于 SIRT6,也可能是 Nrf2影响了其他转录因子的表达从而间接地影响了SIRT6启动子的活性. 在动物水平上,检测 Nrf2各基因型小鼠肺部和心脏组织中 SIRT1.7的 mRNA表达,结果提示 Nrf2对 SIRT其他家族成员也有一定的调控作用.但因为存在组织表达差异性及复杂性,导致在肺部组织和心脏组织中的SIRT家族成员的mRNA表达上也存在不一致的现象.就 SIRT6而言,与之前在细胞水平上的研究结果有出人,但由细胞到组织的过渡其间涉及的表达调控网络更多,因此并不能就此否定在细胞中所得到的Nrf2可以激活 SIRT6的表达这一结论.组织上的结果只是从另一个层面上为 Nrf2介导寿命延长的研究拓宽了研究思路. [3] [4] [参考文献】 Harman D.Free radical theory of aging:an update:increasing the functional life span[J].Ann N Y Acad Sci,: 10—21. Zhang D D,Lo S C,Cross J V,et a1.Keapl is a redox-regulated substrate adaptor protein for a Cul3一dependent ubiquitin plex[J].Mol Cell Biol, 94l一10 953. Kobayashi M ,Yamamoto M.Molecular mechanisms activating the Nrf2一Keap l pathway of antioxidant gene regulation.Antioxid [J].Redox Signal,. KanfiY,DavidB,LombardA,et a1.Sorting out sirtuins【J J.Nature,-221. (下转第 63页) 一55 — 9
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第 38卷第 3期 2015年 9月南京师大学报(自然科学版) JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY(Natural Science Edition) Vo1.38 NO.3 Sept,2015 Nrf2调控 SIRT6表达的初步研究杨文娟,丁 贺,刘新华,刘海霞,桑泽玲,温传俊(南京师范大学生命科学学院,江苏省分子细胞生物学研究所,江苏南京 210023) [摘要】衰老是一个普遍的、动态...
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