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钙磷骨水泥与复合脱蛋白骨关节移植的成骨能力研究
【关键词】 钙磷 研制新型的，特别是具有生物活性的人工关节已成为医学工作者面临的重大课题。若能研制出一种与自体骨形态、结构类似的材料及时重建或修复缺损的骨与关节，并能与受体结合，最终存活而成为患者“自身”的材料，这不仅是生物材料学的发展，也必将带来巨
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　　【关键词】& 钙磷
　　研制新型的，特别是具有生物活性的人工关节已成为医学工作者面临的重大课题。若能研制出一种与自体骨形态、结构类似的材料及时重建或修复缺损的骨与关节，并能与受体结合，最终存活而成为患者“自身”的材料，这不仅是生物材料学的发展，也必将带来巨大的社会和经济效益。“载体+骨诱导因子（BMP）+生长因子”模式的人工骨已被证实为理想的人工骨生物学材料。笔者设想采用钙磷骨水泥与BMP、TNF-α进行复合，在已钻孔的复合脱蛋白骨关节材料表面涂层及髓腔内填塞，以达到钙磷骨水泥与脱蛋白骨关节移植材料“自锁”。移植后，利用其生物降解特性达到局部持续、高浓度的BMP和TNF-α释放，促进骨愈合。另外，由于钙磷骨水泥无免疫原性，在脱蛋白骨关节表面涂层及髓腔内填充后，是否还可起到早期免疫“封闭”作用，而降低异体脱蛋白骨关节的免疫反应。
　　1 材料与方法&&&& 　　1.1 材料的制备 （1）兔股骨下端脱蛋白骨（DPB）:将新西兰大白兔处死后取双侧股骨下段（保留关节端，长度15mm），经蒸馏水反复冲洗，用20%过氧化氢等反复脱蛋白，乙醚循环脱脂，制成脱蛋白骨关节材料，低温冷冻保存。（2）人重组肿瘤坏死因子（rhTNF-α）:第四军医大学生物化学所提供。（3）人重组骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）:杭州华东医药集团基因技术研究所提供。（4）钙磷骨水泥（CPC）:上海瑞邦生物材料有限公司提供。（5）DPB/rhBMP-2/rhTNF-α的制备:将rhBMP-2/和rhTNF-α粉末按一定比例与重蒸水混合后，在脱蛋白股骨下段髁间钻孔处及近段截骨处四周进行滴注，并置入冷冻干燥机，真空下冷冻干燥后，环氧乙烷消毒。（6）CPC/rhBMP-2/rhTNF-α的制备:将rhBMP-2和rhTNF-α粉末按一定比例与CPC固定液混合后，再与CPC粉末进行调和，在未固化前将CPC添入复合脱蛋白股骨下段髓腔内，并在其表面均匀涂层。&&& 　　1.2 动物模型 选取健康成年新西兰大白兔60只（年龄1～1.5岁），雌雄不拘，体重3.0±0.5kg，随机分成A（复合有钙磷骨水泥的异体复合脱蛋白骨关节移植）、B（异体复合脱蛋白骨关节移植）、C（单纯异体脱蛋白骨关节移植）3组。麻醉，暴露股骨远端和胫骨近端，用线锯于距关节面15mm处，锯断股骨，采用张力带钢丝加克氏针固定方法将脱蛋白骨关节固定于断端。复位膝关节，修复关节附属韧带，缝合切口，分笼饲养。&&& 　　1.3 检测内容 （1）肉眼观察:分别于术后4、8、12、16周处死实验动物，观察骨折愈合情况、局部粘连程度及有无感染、内固定物松动发生，同时在第4周采用游标卡尺测量DBP表面纤维组织包裹厚度。（2）X线照片:各组分别于术后4、8、12、16周于麻醉后行膝关节正侧位摄片。（3）组织学检查:标本截自骨断端和股骨外侧髁关节面，常规切片、HE染色，光学显微镜下观察。（4）透射电镜检查:将标本于3%戊二醛中固定3～4h后，置入0.1%PBS（磷酸缓冲液）中保存，然后EDTA（乙二胺四乙酸）脱钙，锇酸再固定，逐级脱水后环氧树脂包埋，切片，枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色后，H-600型透射电镜观察。
　　2 结果&&&& 　　2.1 大体观察 A、B组:于术后4周时，见脱蛋白骨表面被薄层纤维组织包裹（见表1），骨断端间有纤维组织连接。第8、12周时，骨断端附近逐渐有骨痂形成。至第16周时，骨断端间被大量环形骨痂包绕，脱蛋白骨与受体骨组织紧密粘着，界限模糊，剥离时可见有散在出血点。膝关节腔内有少量纤维组织粘连，脱蛋白骨关节面仍保持光滑。A组无感染、内固定松动发生。B组有3例发生移植部位化脓性感染（占15%），并导致内固定松动2例。&&& 　　C组:术后4周时，见脱蛋白骨表面被纤维组织包裹。第8、12周时观察到的骨断端间骨痂在形成速度和量上都明显少于A、B组。至第16周时，脱蛋白骨与受体骨组织间的界限仍然清楚，其膝关节腔内情况与A、B组类似。本组有2例发生局部化脓性感染（占10%），其中1例死亡。
　　表1 第4周时各组纤维组织包裹厚度 （略）&&& 　　注:1A、B组两样本间差异有非常显著性（P&0.01）;A、C组两样本间差异有非常显著性（P&0.01）;B、C组间差异无显著性（P&0.05）;2采用多样本两两比较秩和检验（Nemenyi法）&&&& 　　2.2 X线照片 各组术后X线片均显示骨断端对位对线良好。&&& 　　A、B组:术后第4周时，见骨折线清晰，脱蛋白骨密度较正常骨组织稍高。第8、12周后，骨折线趋于模糊，断端间有骨痂形成。第16周时见骨折线消失，断端间大量环形骨痂形成，骨愈合。脱蛋白骨密度已接近正常骨组织。C组:术后第4、8、12、16周的X线片显示，与A、B组相比其在骨折愈合时间、骨痂形成量上均落后于前两者。第16周时，其脱蛋白骨密度与前并无明显变化。&&& 　　2.3 组织学检查 A、B组在组织学改变上类似:术后第4周时，脱蛋白骨可见大量新生血管、间充质细胞及散在成骨细胞出现，软骨细胞成熟伴网织状骨形成（见图1、2）。第8周时，大片网织状骨及软骨细胞团形成，并向板层状骨组织转化，但未见有骨爬行替代现象。第12周时，断端间形成大量板层状骨，并有骨髓腔形成，骨髓细胞分化成熟。在脱蛋白骨内可见骨爬行替代现象。邻近关节端处有大量软骨细胞团。第16周时，形成更多板层状骨组织，脱蛋白骨-受体骨界面间并无明显分界线，骨折完全愈合（见图3、4），同时在靠近关节面附近可见较多增生成熟的软骨细胞团（见图5、6）。关节端表面仍保持光滑，但关节面下方并未见明显成骨及成骨软骨活动。A组脱蛋白骨材料内填充的骨水泥在第16周时，可见结缔组织长入，并将骨水泥分割成团、降解，可见成骨细胞活动（见图7）。&&& 　　C组:术后第4周时，脱蛋白骨内可见少量炎性细胞浸润，血管、间充质细胞及成骨细胞数量较A、B组为少（见图8）。第8周时，部分网织状骨形成，软骨细胞团少。第12周时，板层状骨形成缓慢，亦未见脱蛋白骨替代。关节端仍无软骨细胞团形成。第16周时，断端间有较多板层状骨形成，但脱蛋白骨材料无或仅小范围内骨替代活动，部分动物出现骨折不愈合。关节端软骨细胞团形成少（见图9）。&&& 　　2.4 电镜检查 A、B组基本为成熟的骨细胞:位于骨陷窝中，胞体呈扁卵圆形，有许多细长的突起，体积较小，胞质浓聚，细胞器少，核呈卵圆形。C组大部分成骨细胞:细胞丰满，呈卵圆形，核内有核仁，以常染色质为主，少量异染色质积聚于核边缘，胞质内有大量粗面内质网、发达的高尔基体及基质小泡。
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可否来做骨水泥治疗？
状态：就诊前
希望提供的帮助：
请医生给我一些治疗上的建议
所就诊医院科室：
肿瘤医院 胸外科，放疗科，介入科
检查资料：
状态：就诊前
好的，周三我们过来，谢谢您！
状态：就诊前
您这周三下午在总院还有门诊吗？
状态：就诊前
我看到挂号网上两个时间都没有排班信息了
周三下午在上海六院有专家门诊。
周二上午六院东院有专家门诊。
疾病名称：椎体骨质增生，c5椎体异常信号，血管瘤。&&
希望得到的帮助：看看应该咋治疗。贵院采用PVP,PKP吗？
病情描述：C3_4,c4_5,c5_6,c6_7,椎间盘变性向后方突出。
疾病名称：颈椎体血管瘤&&
希望得到的帮助：麻烦医生帮忙看一下有多严重？
病情描述：颈椎处酸胀，疼痛！头晕头痛！嗜睡很严重！然后手臂有时会麻木！我想等生了小孩再做治疗可以不？
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疾病名称：骨结合或骨肿瘤&&
希望得到的帮助：请医生给我一些治疗上的建议,目前病情是否需要手术？,到底是骨结合还是骨肿瘤或其他
病情描述：双腿不能动，但是有知觉，后背有个大包，盗汗，食欲不振
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疾病名称：颈椎2/3肿瘤压迫食道能做手术吗&&
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病情描述（发病时间、主要症状、就诊医院等）：
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吴春根大夫的信息
1.胸腰椎体压缩性骨折诊治
2.脊柱良恶性肿瘤诊治
3.颈腰椎间盘突出症诊治
4.骨转移瘤(癌)诊治
5.疑难病...
吴春根，医学博士，主任医师，教授，博士生导师；上海六院东院理事会理事，放射科行政主任；上海市医学重点...
放射科可通话专家
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当前位置： > 万古霉素骨水泥物理和力学性能及洗提特性的实验研究
万古霉素骨水泥物理和力学性能及洗提特性的实验研究
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作者：张明磊,高忠礼,崔宝甲,张炳声,姜志刚　　作者单位：吉林大学中日联谊医院骨科，吉林 长春 130033
【摘要】目的探讨万古霉素加入骨水泥后，对骨水泥物理和力学的影响以及万古霉素的析出情况。方法 将万古霉素从0 g开始每组增加0.5 g直至3.0 g，共分为7组，分别与40 g骨水泥混合。测定各组万古霉素骨水泥的压缩强度、弯曲模量和弯曲强度，并进行洗提实验。 结果 40 g骨水泥中加入少于2.5 g万古霉素时对骨水泥的力学无明显影响；40 g骨水泥中万古霉素的含量为1.5～2.0 g时，骨水泥中释放万古霉素的量更趋于稳定。结论 抗生素能够从骨水泥中持续有效的释放；每40 g骨水泥中加入1.5～2.0 g万古霉素为宜。
【关键词】& 骨水泥；万古霉素；感染
　　抗生素骨水泥是预防和治疗人工关节置换术后感染以及治疗骨髓炎的重要方法，但加入抗生素后对骨水泥的物理和力学性能是否有影响，抗生素能否从骨水泥中有效析出，一直存在争议。许多学者通过力学实验和临床观察证实，骨水泥中加入适量抗生素不会对骨水泥的力学性能产生明显的影响〔1，2〕。但也有些学者持有相反观点，认为骨水泥加入抗生素后会影响其物理和力学性能，从而影响其在临床方面的应用〔3，4〕。本实验选择临床上较常使用的万古霉素加入国产骨水泥中，探讨其对骨水泥物理和力学性能的影响，以及万古霉素的释放情况。
　　1& 材料与方法
　　1.1& 材料
　　骨水泥（PMMA，天津合成材料工业研究所），万古霉素（稳可信，美国Lilly公司），高效液相色谱仪，Instron8501型万用压力测试仪。SBF配制参照Kokubo〔5〕的方法在1 000 ml蒸馏水中依顺序加入NaCl 7.996 g，NaHCO3 0.350 g，KCl 0.224 g，K2HPO4&3H2O 0.228 g，MgCl2&6H2O 0.305 g，1 mol/L HCl 40 ml(pH7.4)，CaCl2 0.278 g，Na2SO4 0.071 g，(CH2 OH)3CNH2 6.057 g（pH7.4)，制成本实验中使用的SBF。本研究未采用常用的PBS缓冲液，而是选用SBF缓冲液，是由于Otsuka〔6〕等曾在实验中发现当介质中Ca2＋浓度增加时可减慢药物的释放，药物浓度与Ca2＋浓度呈负相关。其机制是Ca2＋可在孔隙中沉积使药物释放的通道减少，故本实验为了更加准确的模拟体内环境及实验的可信度，而选择了SBF溶液。
　　1.2& 方法
　　1.2.1& 分组
　　共分7组，每组5个标本。对照组：40 g骨水泥；Ⅰ组：40 g骨水泥＋0.5 g万古霉素；Ⅱ组：40 g骨水泥＋1.0 g万古霉素；Ⅲ组：40 g骨水泥＋1.5 g万古霉素；Ⅳ组：40 g骨水泥＋2.0 g万古霉素；Ⅴ组：40 g骨水泥＋2.5 g万古霉素；Ⅵ组：40 g骨水泥＋3.0 g万古霉素。将上述各组在（23&1）℃和相对湿度不低于40％的无菌条件下，将万古霉素与骨水泥固相按比例混合后搅拌均匀，加入骨水泥液相，搅拌成糊状，制得抗生素骨水泥制件。
　　1.2.2& 骨水泥压缩强度测定
　　按国际标准制成直径(6&1）mm，高（12&1）mm的骨水泥抗压圆柱标准试件，标本在制成24 h后检测，于万能力学试验机上测定其压缩强度，标件分为浸泡与未浸泡。
　　1.2.3& 骨水泥弯曲模量和弯曲强度测定
　　按国际标准制成75 mm&10 mm&3.3 mm的骨水泥板条。24 h后用万能力学试验机测定骨水泥板条的四点弯曲实验，计算弯曲模量和弯曲强度。
　　1.2.4& 骨水泥的洗提实验
　　在温度（23&1）℃条件下将骨水泥圆柱体试件分别置入100 ml烧杯并加入50 ml模拟体液浸泡，分别于1 d、3 d、1、2、3、4、5 w取5 ml浸泡液作为样品。取样时，先顺时针搅动浸泡液10次，再逆时针搅动10次，每次每个烧杯中取样5 ml。取样后，每个烧杯补充5 ml模拟体液，每个试件用10 ml模拟体液清洗，再换50 ml新鲜体液浸没。所取样品冷冻保存于-20℃的冰箱内待测。
　　1.3& 统计学处理
　　实验结果以x&s表示，多组资料比较采用单因素方差分析，均数的两两比较采用q检验，两组资料比较采用t检验。
　　2& 结& 果
　　2.1& 洗提实验
　　不同剂量组缓释时间均可持续5 w，并且在第1周内呈爆发性释放，样本中抗生素含量与其释放速度呈正相关，在第1周后释放量缓慢降低。在第1周后，各组间进行方差分析后显示其释放量具有显著性差异，进一步经q检验后，Ⅲ、Ⅳ组释放量高于其他各组(P＜0.05)（见表1）。表1& 万古霉素骨水泥力学特性（略)
　　2.2& 抗生素骨水泥的物理和力学性能
　　抗生素骨水泥洗提前的压缩强度通过方差分析后显示各组间差异无显著性。抗生素骨水泥洗提后的压缩强度通过方差分析后显示各组之间差异有显著性，进一步做q检验发现，Ⅵ组洗提后压缩强度明显低于其他各组。各组抗生素骨水泥洗提前、后压缩强度相比，通过t检验分析后均无显著性差异。抗生素骨水泥的弯曲模量通过方差分析后显示各组间差异无显著性。抗生素骨水泥弯曲强度通过方差分析后显示各组之间的差异有显著性，进一步做q检验发现，Ⅵ组弯曲强度明显低于对照组及其他实验组（见表2）。表2& 万古霉素骨水泥洗提结果（略)
　　3& 讨论
&&& 局部使用抗生素预防和治疗骨科感染由来已久，1970年Buchholz和Engelbrecht〔7〕第一次提出了在骨水泥中掺入抗生素来预防关节置换病人关节感染的概念。实验证明抗生素骨水泥可以通过浓度梯度向周围扩散抗生素，在局部达到预防和治疗感染的目的。
&&& 研究证实，细菌一旦被隔离在无血运的骨中，全身用抗生素很难达到局部治疗浓度。而且，一旦微生物附着在骨或其他生物材料上，就会产生被膜，代谢也变得不活跃，治疗量抗生素浓度更难起作用。生物被膜是一个细胞外的多聚体多糖?蛋白质复合物，一旦形成，被膜保护生物有机体避开抗微生物制剂、调理素作用和吞噬作用。生物被膜包裹的有机体的基本结构是一个微菌落，它们的间隙只允许营养素流通并且可发生细胞间的信号。细胞的临近位置可促进质粒的交换，因此基本的结构类似于多细胞的有机体的微菌落。如果要杀灭有生物被膜包裹的细菌，一般安全剂量的抗生素不能达到，抗生素的浓度必须是通常剂量抗生素浓度的10～100倍。因此，全身用抗生素治疗骨的细菌感染经常是无效的〔8〕。
&&& 本研究显示，万古霉素骨水泥的洗提前的压缩强度各组间差异无显著性。扫描电镜下观察，骨水泥断面可见到不规则、大小不一的散在孔隙，形状各异，彼此连接，使骨水泥成多孔状。加入抗生素后可以充填骨水泥的孔隙，使骨水泥结构更紧密，因此适量的抗生素并不影响骨水泥的压缩强度，而万古霉素骨水泥洗提后的压缩强度各组之间存在显著性差异，Ⅵ组洗提后压缩强度明显低于其他各组。这是因为洗提过程中随着骨水泥中万古霉素的释放，势必会在骨水泥中留下很多细小的孔隙，当万古霉素超过一定量时，洗提后的万古霉素骨水泥的压缩强度开始下降。而Ⅵ组万古霉素的释放量明显高于其他各组，洗提后在骨水泥中留下的孔隙也较大，因此压缩强度下降更明显。抗生素骨水泥弯曲强度各组之间的差异有显著性意义，Ⅵ组弯曲强度明显低于对照组。因此可以看出40 g骨水泥中加入0.5～2.5 g万古霉素时，骨水泥的压缩强度、弯曲强度和弯曲摸量无明显影响（P＞0.05），但当加入的量大于2.5 g时，骨水泥的物理和力学的性能将受到明显影响。并且需要注意的是，万古霉素粉剂应与骨水泥粉剂充分拌匀，以免成团的抗生素析出后在骨水泥中留下较大的孔隙，从而影响骨水泥的力学性能〔9〕。
　　抗生素加入骨水泥后，抗生素能否有效释放是一个我们一直关注的问题。扫描电镜显示骨水泥断面可见许多孔隙，这种结构可以保证液体良好的扩散，这是抗生素能够有效释放的前提，抗生素多为水溶性，组织液进入骨水泥中的孔隙，抗生素溶于其中，并随之扩散。本研究显示，在第1周内样本中抗生素含量与其释放速度是呈正相关，其释放规律基本符合Higuchi方程，即抗生素缓释速率与时间的平方根成正比。Bayston认为骨水泥中抗生素的释放可能是通过浓度梯度的弥散作用，释放浓度随时间逐渐降低。故抗生素的含量可以影响其释放速度，含量越高，抗生素就越易释放〔10〕。第1周后Ⅲ、Ⅳ组万古霉素的释放量高于其他各组，考虑可能与骨水泥的微孔变化有关，随着药物释放，所留下的空间被SBF溶液所充填，此时在骨水泥孔隙发生溶解沉积的再水化过程，使孔隙结构更加致密，体积缩小，液相进入骨水泥相对较少，进而影响骨水泥内部抗生素的释放，从而使药物缓释速度下降〔11〕。Ⅴ、Ⅵ组骨水泥中抗生素含量高，其开始释放速度快，表面发生溶解沉积再水化也更广泛，因此药物释放度下降更明显。但由于Ⅰ组和Ⅱ组本身抗生素含量较低，在1 w后释放量仍低于Ⅲ组中的含量。
&&& 综上所述，作者认为40 g骨水泥中加入1.5～2.0 g万古霉素为宜，对骨水泥的物理和力学特性没有明显的影响，而且抗生素可以有效持续的释放，其释放初期呈爆发式释药，有利于早期杀菌，释放中期抗生素浓度逐渐下降，有利于长期抑菌。
【参考文献】
　　1 Espehaug B，Engesaeter LB，Vollset SE,et al.Antibiotic prophylaxis in total hip arthroplasty.Review of 10 905 primary cemented total hip replacements reported to the Norwegian arthroplasty register，1987 to 1995〔J〕.J Bone Joint Surg(Br),0?5.
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　　10 阎作勤，张光健，刘成安，等.头孢呋辛－聚甲基丙烯酸甲酯株链的体内外释放〔J〕.中国临床药学杂志,?5.
　　11 黄 粤，刘昌胜，邵慧芳.妥布霉素对磷酸钙骨水泥性能的影响〔J〕.中国生物医学工程学报，（5）：417?29.
申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于
&&&&& 学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。
【关键词】　骨水泥,万古霉素,感染
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