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25kg白色编织袋
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按排行字母分类：四川大学 硕士学位论文 胶原、明胶和胶原水解物的物理化学性能及护肤功能的研究 姓名：张忠楷 申请学位级别：硕士 专业：皮革化学与工程 指导教师：李国英
：ｙ四川大学硕士学位论文９９３７７９胶原、明胶和胶原水解物的物理化学性能 及护肤功能的研究皮革化学与工程专业研究生 张忠楷指导教师李国荚用不同制备工艺从牛皮中制备胶原、明胶和胶原水解物。十二烷基硫酸钠． 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法确定三种样品的相对分子质量及其分布。结果表明： 胶原的相对分子质量大约为３０万，分布很窄；明胶的相对分子质量小于３０万，分布很宽；胶原水解物相对分子质量从几千到５万，分布也很宽。利用压ｔａ电位滴定胶原、明胶和胶原水解物的等电点分别为８．２６、４．８８、４．５４。圆二色谱分析表明胶原在２２１ｎｍ和１９２岫处分别有一个特征的正吸收峰和负吸收峰，即典型的胶原三股螺旋结构。而明胶和胶原水解物的正吸收峰消失，表现为典型 的无规卷曲构象。粘度法测定的胶原变性温度为３７．５℃，而明胶和胶原水解物 在测定过程中无明显的螺旋．无规卷曲变化过程。胶原在生理条件下能够自发聚 集成纤维，而明胶和胶原水解物丧失纤维再生能力。并且胶原比明胶和水解胶 原更耐胰蛋白酶水解。此外，胶原膜在扫描电子显微镜下呈现出纤维结构，其 抗张强度（５８Ｎ／ｍｍ２）大于明胶膜（３６ Ｎ／ｍｍ２）。因此，从牛皮中制备高价值 的特有性能的胶原在生物材料、功能添加剂、日用化学品和制药等领域有着许 多潜在应用。 为提高胃蛋白酶溶解胶原（ＰＳｃ）在中性条件的溶解性，选择酸酐接枝改 性，得到的改性胶原（ｓＰＳｃ）基本物理化学性能发生了变化：胶原由改性前的 酸溶性胶原变成改性后水溶性胶原；等电点由在碱性范围变成酸性范围；ｓＰＳＣ 的相对粘度和特性粘数分别为ＰＳＣ的１．６倍和１．８倍。氨基酸分析表明ＰＳＣ和 ｓＰＳＣ的氨基酸组成基本保持不变，只是，改性使ＳＰＳＣ的赖氨酸含量细微减少， 而缬氨酸含量增加。ＳＤＳ―ＰＡＧＥ电泳表明ｓＰＳｃ的亚基（Ｂ，ａｌ和睨）与Ｐｓｃ 相似，只是电泳迁移小于ＰＳＣ，这很可能与ｓＰＳＣ的相对分子质量以及分子结Ｃ一々￡ｆ’ｐ四川大学硕士学位论文构变化有关。圆二色谱分析表明改性细微降低了ＳＰＳＣ的三股螺旋构象。粘度 法测定的ＰＳＣ和ＳＰＳＣ变性温度分别为３８＿４℃和３４．７℃。ＰＳＣ和ＳＰＳＣ冻干海 绵ＳＥＭ形貌有所不同，由改性前规则的蜂窝状均匀的多孔结构变成改性后长 条状的多孔结构。此外，从ＰＳＣ和ＳＰＳＣ再生纤维的ＳＥＭ形貌可以看出ＰＳＣ 再生纤维分布随机、均匀，而ＳＰＳＣ再生纤维有一定的取向且分布不均匀。总 之，化学改性达到在不破坏胶原结构的条件下拓宽了胶原应用范围的目的。 研究胶原、明胶和胶原水解物的基本性能以考查它们的护肤功能。采用鸟 氏粘度计测定胶原、明胶和胶原水解物的相对粘度和特性牯数，结果表明在相 同质量浓度下胶原的相对粘度是明胶或胶原水解物的５倍左右，其特性粘数也 明显大于明胶和胶原水解物。用三硝基苯磺酸法测定样品的伯氨基含量，结果 表明胶原的伯氨基含量最少，其次是明胶，胶原水解物最多。吸湿实验的测定 结果表明胶原的吸湿性强于明胶和胶原水解物。通过荧光显微镜观察荧光标记 三种样品在大白鼠皮肤表层的分布和渗透情况。结果表明胶原、明胶和胶原水 解物都能渗透至毛囊中，但只有胶原仍均匀分布于皮肤表面，显示其优良的保 湿功能。角质形成细胞培养实验表明只有胶原能明显促进细胞的生长和繁殖， 而在明胶和胶原水解物上培养的角质形成细胞的生长情况与参比样相似。因此， 胶原比明胶和胶原水解物具有更优良的吸湿、保湿性能以及抗皮肤衰老功效。关键词：胶原 明胶 护肤功能胶原水解物水溶性胶原物理化学性能四川大学硕士学位论文Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｋｉｎ－ｃａｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅＬｅａｔｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：Ｚｈａｎｇ ＺｈｏｎｇｋａｉＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｌｉ ＧｕｏｙｉｎｇＣｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍｂｏｖｉｎｅ ｓｋｉｌＬｓ ｉｎ ｇｅｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ―ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｗａｓ ｖｅｒｙｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ２００ １００ ｋＤａ ｆｏｒｎａｌＴｏｗ（ａｂｏｕｔｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ 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ｓｕｂｕｎｉｔｓ（ｐ，１１１ ａｎｄ ｑ０ａｎｄｏｆ ＳＰＳＣ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ＰＳＣ，ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ＳＰＳＣ ｗａｇ ｓｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＰＳＣ，ｐｒｏｂａｂｌｙ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒａｆｔｅｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎｌｙｓｌｉｇｈｔｌｙａｌｔｅｒｅｄ ｔｈｅｔｒｉｐｌｅ－ｈｅｌｉｃａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｆ ＰＳＣａｎｄ ＳＰＳＣ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ，ｗｅａ＇ｅ ３８．４＂Ｃ ａｎｄ ３４．７℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ＳＰＳＣ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｌｅｓｓ ｕｎｉｆｏｒｍ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｒ ｐｏｒｅｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＰＳＣ，ｄｕｅｔｏｔｈｅ ｒｅｐｅｌｌｅｎｃｙ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｓ ｉｎ ＳＰＳＣ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅｏｎｅｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄｆｉｂｒｉＩｓ ｏｆ ＳＰＳＣ ｗｅｒｅ ｔｈｉｎｎｅｒ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｏｍｅｅｘｔｅｎｔ．ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｆｉｂｒｉｌｓ ｏｆ ｗｅｒｅＰＳＣ祈ｔｈ ｕｎｉｆｏｒｍｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ．ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｎｅｔｗｏｒｋ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｈｅａｒｒａｎｇｅｄｒａｎｄｏｍｌｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｙＩｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｃｅｒｔａｉｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｋｅｐｔ ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｉｅｌｄｓ．ｏｆ ＰＳＣ ａｎｄａｃｈｉｅｖｅｄＴｈｅ ｂａｓｉｃｖｉｓｃｏｓｉｔｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｗｅｒｅ 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ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｈａｔｇｅｌａｔｉｎａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｔｒｉａｌ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｉｔＣａｎ ｂｅ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔ，ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｇｅｌａｔｉｎ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈａｓｂｅｔｔｅｒ ｍｏｉｓｔｕｒｅｐｒｏｐｅｒｔｙ ａｎｄｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ａｇａｉｎｓｔ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｋｉｎ－．ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ，ｃｏｌｌａｇｅｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅｃｏｌｌａｇｅｎ，ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｋｉｎ－ｃａｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ四川大学硕士学位论文１前言１．１胶原、明胶和胶原水解物的结构区别?胶原、明胶和胶原水解物可从动物的皮、骨、肌腱等组织中提取制备，因 而它们在氨基酸组成和某些性能上具有相似的地方，但在二级及高级结构和生 物性能上却有很大的区别ｕｌ。 胶原是构成动物机体的重要功能物质，遍布动物体内的各处器官，并对各 器官的正常生理功能的调节起着举足轻重的作用，某些疾病与胶原发生的病变 有着内在的联系１２－＂．到目前为止，已分离出至少１８种胶原，如表１．１所示。胶原 由三条ａ多肽链组成，每一条ａ链自身为左手螺旋构型，３条ａ链又相互缠绕在一， 起形成右手超螺旋结构。在胶原的Ｏｒ，链中，螺旋区肽段一般呈（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）周期 性排列，ｘ和Ｙ常为Ｐｒｏ或Ｈｙｐ。在螺旋区的两端，还有两个非螺旋的端肽，即 ｃ．端肽和Ｎ．端肽。在这两个区段中极性氨基酸含量明显高于螺旋区段，且脯氨 酸含量很低，肽链构象呈比较松散的折叠构象。Ｉ型胶原分子含有３条ａ多肤链，组成可表示为陋ｌ彻２№∞】，每条链含有１０００多个氨基酸，不同的脊椎动物Ｉ型胶原ａ链的氨基酸序列结构只有微小的 差别。Ｏｒ，ｌ（Ｄ和ａ２０）是不同的基因产物，通过氨基酸序列和ｅＤＮＡ序列可确定它 们长度略多于１０００个氨基酸。甘氨酸分别占Ⅱ１①和ａ２０）ｇ氨基酸总量的１／３， 即（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）周期性排列，其中ｘ和Ｙ是可变的，脯氨酸和羟脯氨酸所占的 比例很高。氨基酸连接次序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的构象方式：无 规卷曲、ａ螺旋、Ｂ折叠、Ｂ转角等。胶原（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）周期性排列一级结构是 其特有三股螺旋构象的基础。因为单股螺旋每圈是３．３个残基，而三股的超螺旋每圈每股是ｌＯ个三联体，所以每第三个Ｇ就必然靠近超螺旋的中心轴，且在轴上没有侧链出现，也即侧链有最小的基团（一个Ｈ原子）的甘氨酸能够满 足这种结构，从而得到致密的有氢键键合的稳定结构。而羟脯氨酸的羟基（经 脯氨酸羟化酶的羟基化作用后形成）对于氢键的形成以及三股螺旋结构的稳定 都是必不可少的。此外，Ｉ型胶原的螺旋和非螺旋结构区还含有赖氨酸和羟赖 氨酸，与羟脯氨酸的形成类似，羟赖氨酸是在内质网内通过赖氨酸羟化酶的羟 基化作用形成的。脯氨酸羟化酶和赖氨酸羟化酶都需要分子氧，抗坏血酸（维生素ｃ），舡酮戊二酸和矽作为催化剂的辅助因子。赖氨酸和羟赖氨酸残基可以链间共价交联，有利于胶原分子三股螺旋结构的稳定，同时羟赖氨酸的形四川大学硕士学位论文成有利于糖组份的吸附，可以发生半乳糖化或葡萄糖半乳糖化刚。表１．１各类型胶原在动物体内组织的分布Ｆｉｇ．１．１ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ哩塑堕胶原类型 Ｉ型 ｎ型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ｖ型 Ⅵ型 Ⅶ型 Ⅷ型组织分布 皮肤、骨、角膜、肌腱、肿瘤 软骨、玻璃体皮肤、子宫壁、血管壁基底膜、胎盘皮肤、胎盘、羊膜 子宫壁、皮肤、角膜 羊膜、皮肤 内皮细膜过程中和性能７；．／厂／、＼四川大学硕士学位论文（４）机械强度降低； （５）用发酵可以增大胶原的消化性。 在向明胶转变过程中，胶原规则的三股螺旋结构向无规卷曲转变，从而在 性能上发生了巨大的变化：易于溶解、不耐酶解、许多生物性能丧失。 胶原水解物化学组分与氨基酸的组成与胶原和明胶无大的区别，但是相对 分子质量一般比明胶小，不存在胶原螺旋结构，极易溶于水，也没有明显的生 物活性。 然而，目前人们对这三者的认识常常产生混淆，认为它们具有相同性能， 甚至认为它们是同一种东西。１．２胶原的生物学性能【６】．随着胶原研究的不断深入，特别是近年来基因工程和克隆技术的飞跃发展， 人们对胶原的形态结构、分布、物理性质以及生物生理功能有了更加深刻的了 解。胶原在医用生化材料、保健材料等方面，具有合成材料不可比拟的优越性。 用各种不同方法精制得到的未变性胶原，其结构仍然保持其在动物体内时的天 然结构。因此，作为生物医用材料在人体内应用时，胶原被看作是生物体的一 个组成部分而不是外来物质。（１）胶原的低抗原性 胶原的抗原性与其它蛋白质比较，要低得多，而且常被认为是没有抗原性 的蛋白质。胶原的抗原性主要是来自胶原分子链端的非螺旋区域，即ｃ末端肽 和Ｎ末端肽。通过适当的处理方法去除胶原的端肽可获得非常低抗原性的胶原。 因此，不同方法制备的胶原表现出的抗原性不同。（２）可生物降解性 胶原的三股螺旋结构十分稳定，只有特定的酶（如：胶原酶）对它才有降 解作用。但是一旦胶原变性（三股螺旋结构瓦解）后，胶原就可被许多蛋白酶 水解。胶原酶对胶原作用很专一，胶原特定的位点被水解后，形成两个片断一 ―ＴＣＡ和ＴＣＢ，长度分别为原来胶原的３／４和１／４。胶原在生物体内发生分解 代谢时，因场所不同而分为细胞外和细胞内两条途径。胶原纤维受胶原蛋白酶、３四ＪＩＩ大学硕士学位论文弹性蛋白酶等中性蛋白酶作用而分解成小分子多肽、氨基酸后再进入血液循环 中。这个过程发生在细胞外，称为胶原的细胞外代谢途径。另一种为先经酶作 用将胶原分子打断成适当分子量大小的断片后由于细胞的吞噬作用而被细胞吸 食，在细胞内被分解成小分子多肽和氨基酸的过程，称为胶原的细胞内代谢途径。（３）胶原止血作用 胶原通过促使血小板的凝集形成血栓达到止血作用。血管壁的内皮层发生 损伤时，靠近损伤部位的血小板与内皮细胞下层的结缔组织接触，促使血小板 活化、聚集，形成血栓从而迅速凝血。这一过程纤维胶原是诱导血栓形成的主 要基质蛋白，即纤维胶原是触发血小板血栓形成的一个重要因素。（４）胶原有利于细胞的存活和生长 在细胞培养中，多数细胞是贴壁依赖性的，使细胞生长、分化、生殖和代 谢，需要有一个结合位点。胶原是生物体中细胞外基质的主要成分，它能提供 这样的位点。例如，成纤维细胞在胶原上生长时，代谢和形态与其在体内十分 相似。胶原不仅能促进细胞的生殖分裂，而且对维持细胞的分裂机能也有效果。 因此，胶原可以作为组织修复的支架材料。１．３胶原、明胶和胶原水解物的应用胶原保留特有的天然螺旋结构和性质，使得胶原有着广泛的用途。胶原纤 维是动物皮肤组织的主要纤维，具有特殊立体网状结构。生皮经过一系列的物 理和化学的处理，去除其它非胶原组分后，并通过鞣制提高其耐湿热稳定性和 机械强度，使其变成革，再通过整理工序赋予革特殊的性质和风格，从而成为用途广泛的商品。胶原作为生物材料具有其它合成材料无法比拟的优良性甜”，比如生物相容性、可生物降解性以及生物活性等。胶原经特殊处理后，可用于 烧伤和创伤治疗、美容、矫形、组织修复和创面止血等医药卫生领域。现已运 用于临床中的有用于烧伤、创伤治疗的胶原膜；用于美容矫形的胶原医用注射 剂；用于刨伤止血的胶原止血海绵等。胶原结构一定程度上决定了应用性能， 例如，胶原止血海绵止血性能优于明胶海绵［８１，作为澄清剂用的鱼胶原如果变４性则沉降能力明显降低【９１。胶原作为一种皮肤结构蛋白质，在护肤品中起着滋 润、调理和保湿等作用。因此，胶原作为天然的生物资源，可以广泛应用于食品［１０－１１１、医刻１２１、组织工程‘１３１、化妆品‘１４１等领域。在很多领域中，要将胶原制备成可溶性胶原才能应用，其制备的方法一般可分为酸法、碱法、盐法、酶法以及它们的结合法。明胶是胶原在高温作用下变性、解旋的产物，在食品、医药卫生、照相工 业等领域有重要的应用价值。明胶虽然是一种缺少色氨酸的“不完全蛋白质”， 但是优良物理性质使明胶广泛用作食品的胶凝剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、 发泡剂、粘合剂、粘结剂、澄清剂等，消费量相当可观。在医药卫生方面，明 胶主要用于制作药物胶囊、药物载体【ｌ卯。 常用于制备明胶的原料一般为动物的皮和骨，制备方法有热处理法、酸法、 碱法、盐碱法、酶法等。 （１）仅用热水长时间抽提，使胶原转化为明胶的方法称为热处理法； （２）通过浸酸使胶原水解而制取明胶的方法称为酸法； （３）用石灰悬浮液、氢氧化钠溶液等预处理含有胶原原料生产明胶的方法 称为碱法； （４）用硫酸钠和氢氧化钠的混合液代替石灰乳液浸渍原料而生产明胶的方 法称为盐碱法： （５）用酶处理使胶原溶解并经热变性而成为明胶的方法称为酶法。 美国药典把酸法明胶归类为Ａ型明胶，碱法明胶归类为Ｂ型明胶。Ａ型明胶 在酸性溶液中较稳定，含氮量为１８％～１８．６％，等电点为７．５～９；Ｂ型明胶在碱性 溶液中较稳定，含氮量为１８％以下，等电点为５左右。 胶原水解物是胶原变性后进一步经过酶、化学试剂水解后的产物，相对分 子质量更小，并且具有更易降解和吸收的特点，所以广泛用作营养保健品和日 用化学品添加剂【ｌ“８】。胶原水解物可用于生物发酵培养基，也可以作为一种高 蛋白饲料营养添加剂替代进口鱼粉用于混、配合饲料生产。１．４胶原作为生物材料的缺点及解决方法胶原作为一种重要的生物材料具有其它合成材料无可比拟的安全性，应用 空间十分广阔。但是。胶原作为生物材料也存在不足的方面，比如在体内降解四川大学硕士学位论文过快，机械强度较低‘１９－２０１，在组织内易钙化ｎ２１１，酸溶胶原随着ｐＨ值的升高， 胶原的溶解性会降低，甚至沉淀析出。因此，选择适当的方法改性胶原，可以 克服其应用局限性，扩展胶原的应用空间。化学改性方法是一种有效的方法， 针对胶原活性基团的性质，常见化学改性方法如下：四川大学硕士学位论文２胶原、明胶和胶原水解物的制备及物理化学性能表征２．１试剂及仪器２．１．１化学试剂名称 胃蛋白酶 胰酶 三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ） 牛血清白蛋白 考马斯亮３埴．Ｒ２５０ＴＨｓ规格１：１００００ Ｉ：２５０产地Ｓｉｇｍａ Ｐ７０００ Ａｍｉ＇ｅ，ｓｃｏ ４５８５％（ｗ／ｖ）ＳＩ（枞Ｐ２２９７北京元亨圣马生物技术研究所 上海伯奥生物科技有限公司Ａｍｒｅｓｃｏ ４－９７生化试剂溴酚蓝（ＢＩＢ）分析纯 分析纯 分析纯上海试剂三厂 成都科龙化工试剂厂Ｂ―巯基乙醇十二烷基硫酸钠成都科龙化工试剂厂 汕头市西陇化工厂ＢＩ（）ＭＯＬ ５００７３ ＢＩＯＭＯＬ０６０３ｌ过硫酸铵丙烯酰胺 双丙烯酰胺 四甲基乙二胺 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠分析纯分析纯分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯中国前进化学试剂厂成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂成都化学试剂厂 成都科龙化工试剂厂碳酸氢钠 乙二胺四乙酸二钠。氯化钠 五水硫酸铜成都科龙化工试剂厂 上海公私合营恒信化工厂 重庆化学试剂总厂 成都科龙化工试剂厂重庆北碚化学试剂厂分析纯分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯碘化钾乙酸 酒石酸钾钠氢氧化钠盐酸成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 天津傲然精细化工研究所 成都科龙化工试剂厂对二甲氨基苯甲醛氯氨Ｔ７四川大学硕士学位论文规格 ＱＨＺ－９８Ａ产地 江苏省太仓市华美生化仪器厂哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 ＧＬ２０Ｇ－ⅡＢ一２６０ ＵＶ７５ｌＧＤ上海安亭科学仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 上海分析仪器总厂ＰｅｒｌｄｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡＬＡＢＣＯＮＣＯ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮＬａｍｂｄａ ２５６ Ｌｉｔｅｒ Ｃａ，ｑｃａｄｅ Ｆｒｅｅｚｅ ＤＨＧ＿９０７０Ａ ＢＨ２－ＲＦＬ上海一恒科技有限公司ＯＬＹＭＰＵＳ．日本ＪＥＯＬＪａｐａｎＪＳＭ．５伽０ＩⅣＺｅｔａｗｅｉｇｈｔ Ｎａｎｏ ＺＳｉａｌｖｅｔｌ．ＵＫＪ－５００Ｃ ２０（）ＰＣＪａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ ＮＥＴＺＳＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ ３ ＣｅＵＭｉＩｌｉ．ＰＲｄＩＥＡＮＡｓｓｅｍｂｌｙ美国ＢＩＯ．ＲＡＤ公司０．５ｒａｍ－０．６ｍｍＰＨＳ一３Ｃ上海申立玻璃仪器有限公司上海精密科学仪器有限公司 昆山市超声波仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 浙江黄岩求精真空泵厂 广东恒联食品机械有限公司 上海青浦沪西仪器厂ＫＱ３２００ＢＲＢ－５２ＣＳＳＨＺＤ（Ⅲ）ＴＪ２２ＸＷ－∞Ａ９０．２ ＥＡｌｌ０４Ａ上海振荣科学仪器有限公司 上海精天电子仪器有限公司８四川大学硕士学位论文２．２实验方法２．２．１原料皮预处理 天然Ｉ型胶原是具有生物活性的纤维蛋白，主要分布在皮、肌腱、骨骼、 大动脉、神经、肝脏、胎盘等组织。动物皮组织来源广泛，胶原含量高，因此 从皮中提取Ｉ型胶原不会受到原料限制。实验选择新鲜牛皮经脱脂、脱毛处理 后作为胶原的原料。２．２．２胶原的制备’胃蛋白酶水解方法得到胶原具有低抗原性，可生物降解等优点。其操作工序如下：（１）将预处理过的皮用绞肉机绞成米粒大小颗粒； （２）酸性、低温条件下将皮酶解成可溶性胶原； （３）用适量浓度的ＮａＣｌ盐析、透析纯化。 用Ｂｅｒｇｍａｎ和Ｌｏｘｌｅｙ方法测定羟脯氨酸质量浓度，从而确定胶原的质量浓度１２４１。２．２．３明胶和胶原水解物的制备 脱毛后的牛皮用３％－４％石灰和０．５％ＮａＯＨ复灰两周，然后水洗、中和至 ｐＨ值为５．５－６．０。从７０＂Ｃ到９０４Ｃ以５１２间隔提取明胶，产物１０，０００Ｘｇ离心后 取上清液即为明胶。胶原水解物是由明胶用０．０２％（ｗ／ｖ）胰蛋白酶在４０℃水解 ４ｈ，然后在沸水浴中煮５ｍｉｎ使得胰酶失活得到的。用Ｂｉｕｒｅｔ方法测定明胶和 胶原水解物的质量浓度伫５ｌ。２．２．４冻千实验样品制备 透析处理后的胶原及明胶和胶原水解物用蒸发表面皿装取３ｍｍ高度，置 入冻干机冻干．样品冻干操作如下： （１）将箱体温度降低至４０℃，使得样品冻结实； （２）打开真空泵抽真空（真空度０．１３３ｍｂａｒ以下）； （３）保持低温高真空条件将样品冻干； （４）缓慢升高温度至室温，关闭真空泵。’９四川大学硕士学位论文溶液恒湿器中， ，以５＂Ｃ／ｍｉｎ升２．２．１１成纤维性能 取胶原、明胶和胶原水解物溶液各１０ｍＬ，浓度均为０．５ｍｇ／ｍＬ，装入透析 袋中，在４＂Ｃ，用ｐＨ＝７．２磷酸盐缓冲液透析２４ｈ后，用紫外分光光度计观测样 品在３５＂（２，３１３ｒｉｍ处吸光度随时间变化情况，得到它们的纤维形成曲线。将所 得到的胶原再生纤维样品在１０，０００Ｘｇ离心，得到沉淀，经处理１２＂／１、冻干后用 扫描电子显微镜观察再生纤维的形貌。２．２．１２样品抗胰酶水解性将质量浓度为０．４ｍｇ／ｍ１．加．５ｍｇ／ｍＬ的胶原样品在４＂０，用ｐＨ为７．２磷酸盐缓冲液透析７２ｈ，明胶和胶原水解物溶液则直接用去离子水配制成质量浓度 为０．５ｍｇ／ｍＬ的溶液。所有样品在３０℃，用０．０４％（ｗ／ｖ）胰酶（１：２５０）水解， 每隔ｌｈ取出一定量样品，加入１．％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液在沸水浴中煮５ｍｉｎ，以使胰 酶失活。通过ＴＮＢＳ方法测定相应水解时间后样品的伯氨基含量． ２．２．１３成膜及其性能表征 分别将１０ｍＬ浓度为５ｍｇ／ｍＬ的胶原、明胶和胶原水解物溶液倒入培养皿 中，在室温下自然干燥、成膜。用扫描电子显微镜观察膜的形貌特征，并测定 膜的抗张强度和断裂伸长率。２．３结果与讨论２．３．１相对粘度及特性粘数测定 粘度法测定得到比浓增比粘度，通过哈里斯外推方法得到样品的特性粘数。 而特性粘数值的大小与样品的粘均分子量是相关的，对于同一类的样品来说， 一般特性粘数越大，其粘均分子量也越大。胶原、明胶和胶原水解物的相对粘 度及特性粘数见表２．１。四川大学硕士学位论文表２．１样品的相对粘度和特性牯数Ｔａｂ．２．１ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｖｉｓｃｏｓｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｖｉｓｃｏｓｉｔｉｅｓ ｏｆｓａｍｐｌｅｓ‘质量浓度均为ｔｍｇ／ｍＬ，以水作为溶剂从表２．１看出胶原水解物和明胶的相对粘度相差很小，而胶原的相对枯度是 其它样品的５倍左右，这与胶原的高相对分子质量及其特殊的结构是密切相关 的。特性粘数是高聚物的一个物理参数，当聚合物的化学组成、溶剂、温度确 定后，【ｒＩ】值与聚合物的相对分子质量关系，可用Ｍａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋ方程表达，即 【ｒｌｌ＝ＫＭ４。由于这些样品在溶液中所呈现出的形态未知，相对分子质量分布 又比较宽，因此特性粘数只能定性地反映出它们粘均分子量的大小．从表２．１ 可以看出胶原的特性粘数最大，明胶次之，胶原水解物最小。因而，粘均分子 量从大到小顺序为胶原、明胶、胶原水解物。２．３．２样品的等电点 等电点是蛋白质一个重要的参数，它与蛋白质侧链酸性和碱性氨基酸的残 基比例相关。明胶和胶原水解物是不同的相对分子质量的多肽混合物，因此， 等电点是各种多肽的平均等电点。胶原、明胶和胶原水解物的Ｚｅｔａ电位与ｐＨ 值关系，见图２．１。，：、‘ｋ、―～茹罱．。－２胶原―、。＼～、、、、、ｅ ｐ８１２四川大学硕士学位论文佰主，ｏ霍 ５ 主 。 罱．５．，Ｏ＼明胶４ＰＨ４目 Ｉ＼、、～～ＰＨ”拿 Ｓ晨１０―――、咬原水解物茎６￡＼＼ＰＨ?５４品ｏ－５＼ ＼～ＤＨ――――－～图２．１胶原、明胶和胶原水解物Ｚｅｔａ电位与ｐＨ关系 Ｆｉｇ．２．１ＲｅｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＺｅｔａｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｃｅｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎｈｙｄｒｏｉ，＇ｓａｔｅ耐血ｐＨ胶原、明胶和胶原水解物的等电点分别为８．２６、４．８８和４．５４。胶原的等电 点在碱性范围是由于酸性的提取条件保持了胶原侧链氨基酸残基的完整性。在 强碱和高温的制备条件下明胶和胶原水解物的侧链酰胺残基被水解，从而产生 高密度的羧基残基，使得等电点在酸性范围。２．３．３ＳＤＳ―ＰＡＧＥ凝胶电泳分析ＳＤＳ．ＰＡＧＥ系统由于加入一定量的阴离子表面活性剂（ＳＤＳ）和强还原剂 （Ｄ．巯基乙醇）后，蛋白质样品与ＳＤＳ充分结合形成带负电荷的复合物，蛋白 质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的相对分子质量的大小，而电荷因素可以 忽略不计。从图２．２所示的电泳分析图谱可以看出：胶原的相对分子质量最大， 电泳图有３条泳带，在１００ｋＤａ附近出现的２条泳带分别是胶原分子的ｃｔｌ链和０ｃ２ 链，在２００ｋＤａ附近出现的１条泳带是胶原分子的Ｂ链。即胶原的每条多肽链相 对分子质量为ｌＯ万，３条多肽链构成一个胶原分子，因此，胶原分子相对分子质四川大学硕士学位论文量为３０万；明胶的电泳分离带为一个连续带，相对分子质量分布在小于３０万ｌ 胶原水解物也是一个连续分离带，但其相对分子质量比明胶小，主要分布在几 千到５万左右。四川大学硕士学位论文２．３．４三股螺旋构象及螺旋一无规卷曲转变 胶原是一类光学活性蛋白质，采取类聚脯氨酸．ＩＩ型的螺旋构象‘２８１，其圆二 色谱特征是在１９０ｎｍ左右有一个负吸收峰，在２１０ｎｍ一２３０ｎｍ范围内有个弱的正吸收峰。●０，吐耄黾署吨 弓 ｑ ｛．＝Ｐ１９０ ２１０ ２３０ ２５０妻巴Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｍｎ）图２．３胶原、明胶和胶原水解物的ＣＤ图谱Ｆｉｇ．２．３ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ从图２．３可以看出胶原样品的圆二色谱在２２１ｎｍ左右有个弱的正吸收峰，在 １９２ｎｍ左右有个负的吸收峰，属于典型的胶原螺旋构象结构【期．而明胶和胶原 水解物在２１０ｎｍ－２３０ｎｍ范围内没有弱的正吸收峰，呈现出典型的无规卷曲的构 象。上述样品的测试温度是２５℃，高于它们的凝胶化温度。若测试温度降至凝 胶化温度以下，无规卷曲的结构会部分转变成胶原螺旋的结构１３０１。样品的二级 结构及更高级结构在一定程度上将影响它们生物学及细胞生物学性能，而三股 螺旋结构是胶原发挥生物功能的基础。例如，胶原作为角质形成细胞培养底物 时，三股螺旋能够提供细胞结合的位点，有利于细胞的贴壁和繁殖，而结构被 破坏的明胶和胶原水解物没有这种生物活性【Ⅷ；胶原作为止血海绵止血性能优 于明胶海绵【８ｌ，也是由于明胶的结构被破坏的缘故；参与胶原在生物体内代谢四川大学硕士学位论文过程的胶原酶和巨噬细胞的活性位点都分别位于螺旋区域的特定位置；基因变 异导致胶原氨基酸组成和结构细微的变化是某些胶原相关疾病发生的根本原因 ［２ｓｌ。因此，某种程度说，胶原二级及更高级的结构是其良好生物和物理性能的 基础，决定了胶原的应用。 在温度高于胶原变性温度后，天然胶原三股螺旋将向无规卷曲转变。在变 性过程中，由于三股螺旋结构的瓦解，胶原的物理性能，如粘度、溶解性和光 学活性，将发生很大的变化。圆二色谱法和粘度法广泛用于测定天然胶原的变 性温度，当蛋白质浓度和溶剂相同时这两种方法测定的结果足相同的【３Ｉ】。比浓 增比粘度对温度曲线如图２．４所示。； 已§拍∞弘∞拍∞佰佃ｏ¨ 们¨２５ ３０ ３５ ４０ ４５ ５０Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃’图２．４粘度法测定胶原、明胶和胶原水解物的热变性曲线Ｆｉｇ．２．４ＴｈｅｒｍａｌｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎＣＵＩ＇Ｙｅ￥ｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ从图２．４可知胶原的比浓增比粘度从３０℃开始下降，到４２．５＂Ｃ达到一个平台， 胶原变性温度为３７．５℃。胶原的螺旋。无规卷曲转变涉及到胶原分子多肽链间的氢键的破坏，完整的胶原三聚体似变成单根的Ｃｔ链或者二聚体（助，因此比浓增比粘度下降。就明胶和胶原水解物而言，随着体系的温度升高，样品的比浓增 比粘度只有细微的降低，这主要是因为胶原的螺旋结构在热处理过程中已经瓦 解，因而没有呈现出明显的螺旋．无规卷曲的转变。‘此外，ＤＳＣ也广泛用于研究材料的热力学行为，湿含量是影响测试结果的１６Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ代图２．５ ＤＳＣ法测定冻千胶原、明胶和胶原水解物的热变性温度Ｆｉｇ．２．５ＴｈｅｒｍａｌｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｍｒⅧｏｆｔｈｅｌｙｏｐ脚耐ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎａｎｄ∞Ｕａｇｅｎ ｈｙｄ叫ｙ∞ｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙ ＤＳＣ ｍｅｔｈｏｄ从图２．５可以看出，胶原的热变性温度为４４．３＂Ｃ，而明胶和胶原水解物没有 出现明显的吸热峰。胶原粘度法测定热变性温度低于ＤｓＣ法测定的热变性温度， 这与测试前样品的状态有关。粘度法测定样品是溶液状态，不存在湿含量的影 响，而ＤＳＣ法测定的是冻干的干燥样品，它的湿含量对热变性温度有很大影响。 明胶和胶原水解物在ＤＳＣ测定过程中没有出现明显的热变性过程，与粘度法测 定结果相符。 胶原的变性温度与动物的体温和生活环境相似，因此，哺乳动物胶原的变 性温度一般比海产动物胶原的变性温度高。如果仅对胶原的变性温度而言，哺 乳动物胶原的应用领域比海产动物胶原要广泛的多。２．３．５成纤维性的对比 将胶原、明胶和胶原水解物在模拟生理条件（与动物体内相似的温度和中１７四川大学硕士学位论文性盐含量）下放置３０ｍｉｎ，期间不断观察吸光度的变化，得到它们的纤维形成 曲线，如图２．６所示。１ ２１．００ ８ Ａ０６ ０４ ０ ２ ０ ０ ２ ４ ６ ８ １０ １２ １４ １６ １８ ２０ ２２ ２４ ２６ ２８ ３０ Ｔｉｍ“ｌＩｌｌｎ图２．６胶原、明胶和胶原水解物的浊度－时间曲线Ｆｉｇ．２．６ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ－ｔｉｍｅ ｃｕｒｖ∞ｆｏｒ ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ在实验条件下胶原溶液迅速浑浊，从图２．６可以看出，吸光度在短时间内迅 速增大，纤维增长很快，但随着胶原纤维增长，吸光度逐渐到达一个相对稳定 的平台，纤维增长接近完全。而明胶和胶原水解物在实验的整个过程中吸光度 都基本保持不变，没有发生成纤维。因此，只有胶原溶液具有独特的成纤维性 质，而它的变性产物明胶和降解产物胶原水解物则没有这样的性质。 胶原在体外一定的生理条件下聚集成纤维经历了三个阶段：温度决定的诱导阶段，与温度无关增长阶段和温度决定的增长阶例３２１。胶原的成纤维行为与胶原的类型、提取方法及自聚集的条件（缓冲液、温度、蛋白质浓度等）有着 密切的关系。不同类型的胶原有着不同成纤维的时间和程度【３３】。同种胶原的不同制备工艺也有着不同的成纤维的行为和条件嗍。胶原的提取条件温和，三股螺旋区域完整保留。明胶在碱性和高温的条件下制备，酰胺键发生部分水解， 三股螺旋被瓦解。胶原水解物是变性的更小相对分子质量产物，也没有胶原螺 旋结构。因此，明胶和胶原水解物是无序的，且相对分子质量分布宽，因而不 能自聚成纤维。此外，胶原分子成纤维与胶原分子链间氢键和静电作用有关。 明胶和胶原水解物的制备条件使得等电点降低，负电荷增加，静电排斥增强， 从而失去成纤维能力。ｊ！！！查兰堡主兰垡堡苎图２．７再生胶原纤维的ＳＥＭ Ｆ皓２．７Ｉ摩ｌ（Ｂａｒ：５ ｐｍ）ＳＥＭ ｉｍａｇｅ ｏｆｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｒｉｌｓ（Ｂａｒ：５ ｐｍ）胶原的再生纤维呈多孔网状纤维结构（图２．７）．在适当的条件下，胶原 分子靠氢键等作用力连接，重新聚集成具有天然胶原纤维形貌的再生纤维，表 现出良好的生物活性。而明胶和胶原水解物没有成纤维的生物活性。 ２．３．６样品耐酶解能力 胶原的螺旋区域非常稳定，只有胶原酶等少数酶对其有作用。但是，胶原的变性产物――明胶和胶原水解物，就很容易受到蛋白酶的水解。实验中利用胰酶测试样品的耐蛋白酶水解能力，用伯氨基的含量作为水解程度的一个指标。 胰酶水解样品的曲线如图２．８所示。０．７ ．０．６芤妊０．２年０．１０．０ ０ １ ２３４５６时间ｍ?图２３胶原、明胶和胶原水解物的胰酶水解曲线№?２．８ ｌＡＴｐｓｌｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｃｕｒｖ８ ｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ１９四川大学硕士学位论文胶原在３０＂Ｃ（低于胶原的变性温度）用胰酶作用６ｈ后伯氨基量增加很少， 没有发生大量的水解反应。明胶在最初２ｈ内伯氨基的含量增加明显，发生明显 的水解作用。实验的胶原水解物是胰酶水解得到的，可能胰酶进一步的作用位 点较少的缘故，因此实验中伯氨基含量也没有明显的增加，进一步的水解作用 较弱。总之，胶原相对于明胶和胶原水解物更耐蛋白酶水解作用。２．３．７成膜性能对比 实验发现：胶原水解物不能成膜，而胶原和明胶可以成膜。利用Ｄｓｃ测试 胶原和明胶的熟物理性能，如图２．９所示。（Ａ）１０２０∞４０邬ｌｅｍｐｅｃｗ．ｎＰＣ∞７００３）图２．９ＤＳＣ法测定胶原膜（Ａ）和明胶膜（Ｂ）的热力学曲线ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａ）ＤＳＣＦｉｇ．２．９ Ｔｈｅｒｍｏｇｒａｍｓ ｏｆｔｈｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｌａｔｉｎｍｅｍｂｒａｎｅ∞）ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ２０四川大学硕士学位论文从图２．９可以看出胶原膜和明胶膜的峰顶温度分别为５９℃和６２．５℃，但是胶 原的吸收峰面积（即热焓）明显大于明胶的峰面积。在二次扫描过程中，胶原 和明胶的吸收峰都消失，仅出现弱的台阶。这表明样品出现玻璃化转变的现象。 胶原和明胶的热行为与湿含量和热历史（制各条件）有关。胶原的三股螺旋结 构在加热过程中螺旋瓦解，因而吸收峰面积比三股螺旋含量甚少的明胶要大得 多。二次扫描两种样品都没有出现明显的吸收峰是由于螺旋结构的解旋是不可 逆。因此，第一次扫描对应于胶原螺旋一无规卷曲的转变，而二次扫描对应于非 结晶生物高分子的玻璃化转变。 用扫描电子显微镜观察到的胶原膜和明胶膜的微观结构，如图２．１０所示。围２．１０胶原膜（Ａ）和明胶袋毋）的表面形貌Ｆｉｇ．２．１０ Ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａ１ ａｎｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｂ）从图２．１０（Ａ）可以看出，胶原成膜后表面较粗糙，且仍保持网状纤维结构。 而明胶膜已不具有纤维结构特征，电子显微镜观察到的只是一个平滑表面（图 ２．１０（Ｂ））。实验测得明胶膜和胶原膜的抗张强度分别为３６士４ Ｎ／ｒａｍ．２，５８± ５Ｎ／ｒａｍ２，断裂伸长率分别为３．０＿０．５％和７．０＿０．５％。 由于胶原、明胶和胶原水解物的相对分子质量和结构差异，使得它们具有 不同的成膜性能．胶原相对分子质量最大且保持三股螺旋结构，具有良好的成 膜性，并且膜的机械性能最好．明胶虽然有成膜能力，但由于丧失了胶原分子 的螺旋构象以及相对分子质量分布宽，膜的机械性能不如胶原膜。而胶原水解 物则完全丧失成膜能力。胶原相对分子质量分布均一，保持了三股螺旋结构， 因此胶原膜比明胶的抗张强度和断裂伸长率大．此外，实验中发现明胶膜性脆、 无韧性，易破碎ｇ而胶原膜具有一定的柔韧性、延伸性，强度较好。四川大学硕士学位论文２．４小结由不同制备工艺得到的胶原、明胶和胶原水解物有着不同物理化学性能。 （１）胶原的特性粘数最大，明胶次之，胶原水解物最小。因而，粘均分子量从 大到小顺序为胶原、明胶、胶原水解物。 （２）ＳＤＳ―ＰＡＧＥ电泳测定结果表明：胶原的相对分子质量大约为３０万，分布 很窄；明胶的相对分子质量小于３０万，分布很宽；胶原水解物相对分子质量从 几千到５万左右，分布也很宽。 （３）胶原、明胶和胶原水解物的等电点分别为８．２６、４名８和４，５４，酸性温和的 提取条件保持了胶原侧链氨基酸残基的完整性，而强碱和高温的制备条件使样 品侧链酰胺的残基彼水解，从而产生高密度的羧基残基，使等电点在酸性范围。 （４）胶原的圆二色谱在２２１ｎｍ左右有个弱的正吸收峰，在１９２ｎｍ左右有个负的 吸收峰，属于典型的胶原螺旋构象，而明胶和胶原水解物在２１０ｎｍ。２３０ｎｍ范围 内没有弱的正吸收蜂，呈现出典型的无规卷曲的构象。在热变性过程中，胶原 经历了螺旋．无规卷曲转变（完整的胶原Ｙ链变成单根的ａ链或者ｐ链），而明胶和 胶原水解物没有呈现出明显的螺旋．无规卷曲的转变。 （５）粘度法测定胶原溶液和ＤＳＣ法测冻干胶原样品的热变性温度分别为３７．５℃ 和４４．３℃，明胶和胶原水解物没有明显的热变性温度。 （６）胶原具有独特的成纤维性质，且再生纤维有明显的天然胶原纤维结构，而 它的变性产物明胶和降解产物胶原水解物则不具有这样的性质。 （７）胶原稳定的三股螺旋结构使胶原比明胶和胶原水解物更加耐蛋白酶的水解 作用。 （８）胶原和明胶都有成膜性，但是胶原膜的机械性能优于明胶膜，且胶原膜有 较明显的网状纤维结构存在，而明胶膜网状纤维结构不明显。四川大学硕士学位论文３水溶性胶原的制备及表征３．１试剂及仪器３．１．１化学试剂名称规格５％（ｗ／ｖ）产地三硝基苯磺酸（田她Ｓ） 考马斯亮］矗．Ｒ２５０ＴｒｉｓＳＫ姒Ｐ２２９７上海伯奥生物科技有限公司Ａｎｌｒｅ．ｓｃｏ ４９７分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯．溴酚蓝（ＢＰＢ）上海试剂三厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 汕头市西陇化工厂 Ｂ＿ＤＭＯＬ ５００７３ Ｂ１０ＭＯＬ０６０３ｌ 中国前进化学试剂厂１３―巯基乙醇十二烷基硫酸钠 过硫酸铵丙烯酰胺 双丙烯酰胺四甲基乙二胺磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 碳酸氢钠 五水硫酸铜 碘化钾 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯成都科龙化工试剂厂分析纯化学纯成都科龙化工试剂厂 成都化学试剂厂上海公私合营恒信化工厂重庆化学试剂总厂重庆北碚化学试剂厂酒石酸钾钠 对二甲氨基苯甲醛 氯§毛ＴＫ２Ｓ０４天津傲然精细化工研究所 成都科龙化工试剂厂成都科龙化工试剂厂分析纯分析纯 分析纯浓硫酸成都科龙化工试剂厂３．Ｉ．２实验仪器名称 氨基酸分析仪 高速冷冻离心机 规格８３５．５０产地ＨＩＴＡＣＨＩ，ＪａｐａｎＧＬ．２０Ｃ｝．Ⅱ上海安亭科学仪器厂四川大学硕士学位论文恒温水浴锅 紫外，可见分光光度计Ｂ一２６０ ＵＶ７５１ＧＤ上海亚荣生化仪器厂 上海分析仪器总广 上海一恒科技有限公司／ＥＯＬ，ｈｐａｎ Ｍａｌｖｅｎ。ＵＫＪａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ ＮＥｒＺＳＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ恒温烘箱ＤＨＧ－９０７０Ａ ＳＥＭ 激光粒度及Ｚｅｔａ电位分析仪ＣＤ ＤＳＣＪＳＭ－５９００ＬＶＺｅｔａｗｅｉｇｈｔ Ｎａｎｏ ＺＳ Ｊ－５００Ｃ ２００ＰＣ乌氏粘度计０．５－Ｏ．６ｍｍ 精密ｐＨ计ＰＨＳ－３Ｃ 凯氏定氮仪 循环水式真空泵Ｋ－４３７上海申立玻璃仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司ＢＵＣＨｉ ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄＳＨＺ－Ｄ（Ⅲ）浙江黄岩求精真空泵厂 上海青浦沪西仪器厂 上海振荣科学仪器有限公司旋涡混合器ＸＷ－８０Ａ 恒温磁力搅拌器９０－２３．２实验方法３．２．１改性胶原（ｓＰｓｃ）制备 用酸性条件下胃蛋白水解提取得到酶溶性胶原（ＰＳＣ）在中性溶液中不稳 定，容易发生沉淀，因而大大限制了其应用范围。在不改变胶原结构的前提下， 利用化学改性，可使得胶原的等电点偏离中性范围，从而可以提高其水溶性。 根据胶原的侧链活性基团多为羧基和氨基，因此可以选择适当的可以与这两种 基团反应的试剂进行接枝，同时引入一些新的基团，达到改变等电点和提高中 性条件溶解性的目的。实验考查不同酸酐用量对氨基改性的接枝率影响。３．２．２改性胶原的接枝率测定通过三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ）方法测定改性前后胶原的伯氨基含量嘲。接枝率计算过程如下： （１）测定样品的吸光度，根据标准曲线计算伯胺基总量Ｔ（Ｉ血Ｄ； （２）单位质量蛋白质伯氨基量Ｐ（ｍｍｏｌ／ｇ）＝ＴＩＣ，其中Ｃ（ｇ／Ｌ）为蛋白质的质量 浓度； （３）接枝率（％）＝ｌＯＯＸ（Ｐｏ－Ｐ１）／Ｐｏ，Ｐｏ为单位质量未改性胶原的伯氨基含量，Ｐｌ四川大学硕士学位论文为改性胶原的伯氨基的含量。３．２．３样品的特性粘数测定 测定方法同２．２．５，ＳＰＳＣ溶剂为去离子水。３．２．４凯氏定氮法 （１）样品消解：固体样品约０．１９或者液体样品５ＩｎＬ一１０ｍＬ，ＣｕＳ０４０．３ 者淡绿色透明样品（约需３ｈ）。空白样为除了样品外上面组分。 （２）自动滴定出氮的含量，乘以转换系数即为蛋白质的含量（具体操作根据凯 氏定氮仪的标准流程进行）ｇ，Ｋ２Ｓ０４５９，浓硫酸１０ｍＬ依次加入凯氏定氮瓶中。在３８０℃将样品消解成白色微黄或３．２．５样品等电点测定测定方法同２．２．６。３．２．６样品的氨基酸测定 色谱柱采用日立舵６１９阳离子交换树脂，内径２．６ｒａｍ，长１５０ｒａｍ。洗脱方 式为４段梯度洗脱，由计算机控制。柠檬酸缓冲液为洗脱液，流动速度０．２２５ｍｌ＿／ｍｉｎ，泵压１１０ ｋｇ／ｅｍ２―１２０ｋｇ／ｃｍ２。茚三酮为显色剂，显色剂溶液流速０．３ｍＩ．／ｍｉｎ，泵压３０ｋｇ／ｃｍ２－－．４０ｋｇ／ｃｍ２．以５７０ｎｍ和４４０ｒｉｍ波长同时检出，色谱 柱温度５Ｉ℃，反应浴温度９８＂Ｃ。反应圈内径０．２５ｍｍ，长２０ｍ。样品分析周期 ７４ｒａｉｎ：进样体积５０ｐＬ；数据由计算机处理，直接打印出定性、定量分析报告。 ＳＤＳ．ＰＡＧＥ凝胶电泳 测定方法同２．２．７。３．２．７３．２．８圆二色谱 将改性后的胶原分成两个，其中一个样品经沸水煮５ｍｉｎ后冷却至室温， 即变性的改性胶原（ＤＳＰＳＣ）。在分析前将所有样品在１０，０００Ｘ ｇ离心１５ｍｉｎ， 调节浓度至０．５ｍｇ／ｍＬ。用圆二色谱仪在１５＂Ｃ，扫描样品１９０ｎｍ一２５０ｎｍ波段的四川大学硕士学位论文摩尔椭圆度。３．２．９粘度法测定样品变性温度 测定方法同２．２．９。３．２．１０冻干样品的表面形貌 冻干操作同２．２．４。３．２．１１ＰＳＣ和ＳＰＳＣ再生纤维的表面形貌改性后的胶原成纤维十分迅速，无法用紫外吸收方法观察成纤维过程。成 纤维后样品经离心及化学处理后，冷冻干燥，再用ＳＥＭ观察再生纤维形貌。３．３结果与讨论３．３．１酸酐用量对改性接枝率的影响 影响接枝率的反应条件很多，如温度，ｐＨ值，时间等因素。实验改性的温 度控制在２０℃～２５℃，介于凝胶化温度和变性温度之间。反应ｐＨ值在弱碱性 范围８。ｌＯ。时间以ｐＨ值不再降低时为终点。本实验主要考查不同酸酐用量对 接枝率的影响如图３．１所示。装薄螂 鲻酸酐用量（以ＰＳＣ计） 图３．１酸酐用量对接枝率的影响Ｆｉｇ．３．１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｍｏｕｎｔｓｏｆａｎｈｙｄｒｉｄｅｏｎｔｈｅｇｒａｆｔｅｄ ｒａｔｅｓ四川大学硕士学位论文从图３．１可以看出：在酸酐用量为３３％前，随着酸酐用量的增加，转化率 很大提高；当用量达到３３％时候接近一个平台，接着酸酐用量增加，转化率提 高很慢。以下试验选择酸酐用量为３３％改性ＰＳＣ。３．３．２改性前后胶原样品物理性能 胶原改性后许多性能发生了变化，改性前后的一些物理性能变化如表３．１ 所示。表３．１ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的物理性能Ｔａｂ．３．１ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆＰＳＣ ａｎｄ ＳＰＳＣ从表３．１可以看出改性后胶原的伯氨基含量降低，等电点降低，相对粘度、 特性粘数增加，由酸溶性胶原变成水溶性胶原。而改性前后的冻干胶原氮含量 和蛋白质含量相近。伯氨基含量的降低是由于改性试剂消耗伯氨基基团，产生 新的酰胺键。改性后胶原的等电点明显的降低，一方面是由于羧基残基比改性 前有了明显的增加，即酸性残基比改性前增加了；另一方面，改性消耗了伯氨 基的基团，即碱性残基的比例下降。相同蛋白质浓度的改性胶原相对粘度是末 改性胶原的１．６倍表明改性后胶原样品的粘度比改性前大大增加。改性后胶原 分子间的作用力增强，流动时候分子闻的摩擦力增大，聚电解质特性表现更加 明显。而改性胶原的特性粘数是未改性胶原的１．８倍，一方面是由于改性后的 相对分子质量明显的增加（可从ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图验证），另一方面可能改性 后分子支链上分枝增大，分子间作用增强，改交了分子在溶液中的存在形态。 溶解条件的变化主要由分子的电荷发生变化，等电点发生迁移造成的。四川大学硕士学位论文３．３．３改性前后胶原的氨基酸变化情况 氨基酸组成分析时利用茚三酮作为显色剂，它在弱酸性条件下与舡氨基酸 共热，引起氨基酸氧化脱氮、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物（氨和还原茚 三酮）发生作用，生成紫色物质，在５７０ｎｍ处有最大吸收。而茚三酮与两个亚氨酸一脯氨酸和羟脯氨酸反应并不释放氨，直接生成黄色物质，在４４０ｈｍ处有最大吸收。改性胶原引入新的基团，因此改性产物的某些氨基酸含量发生一 些变化，改性前后氨基酸测试结果转化成１０００个氨基酸残基计后结果见表３．２。表３．２ ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的氨基酸组成（１０００个氨基酸残基计）Ｔａｂ．３．２Ａｍｉｎｏａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＰＳＣ ａｎｄＳＰＳＣ（ｒｅｓｉｄｕｅｒｄｌ０００ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）各种类型胶原具有比较相似的氨基酸组成，即大约ｌ，３的甘氮酸 （３０％－３４％），脯氨酸和羟脯氨酸共占２２％（２０％－２３％），不含色氨酸等。从表 ３．２可以看出，改性前胶原的甘氨酸为３３．２％，脯氨酸和羟脯氨酸共为２１．１％，四川大学硕士学位论文不含色氨酸，有少量的胱氨酸；改性后胶原的甘氨酸为３３．３％，脯氨酸和羟脯 氨酸共为２０．９％，也不含色氩酸，有少量的胱氨酸。这种氨基酸的组成符合胶四川大学硕士学位论文在１００ｋＤａ一２００ｋＤａ之间出现的２条泳带分别是胶原分子的０【１链和０ｃ２链，大于 ２００ｋＤａ地方出现的ｌ条泳带为Ｂ链。而未改性的胶原在１００ｋＤａ附近出现的２ 条泳带，分别是胶原分子的０【ｌ链和０ｃ２链，在２００ｋＤａ附近出现的１条泳带为Ｂ 链。两者相比后可以看出改性后胶原的电泳迁移小于改性前的胶原分子，这很 可能是由于改性接枝后胶原分子的相对分子质量增加以及分子结构的改变，从 而电泳迁移率小于未改性的胶原。同时电泳结果表明：改性没有破坏胶原的多 肽链，并且胶原链上已经接上改性试剂。胶原改性过程是在胶原不稳定的反应 条件下进行，因此要特别严格控制反应温度和ｐＨ值条件，否则易发生水解、变性。３．３．５ＰＳＣ、ＳＰＳＣ和ＤＳＰＳＣ的二级结构确定 对于胶原的三股螺旋结构来说，圆二色谱在２２０ｎｍ左右的正吸收峰是其重要的特征吸收峰。ＰＳＣ、ＳＰＳＣ和ＤＳＰＳＣ的圆二色谱如图３．３所示。Ｃ屯舀皆门ｇ 君罡巴Ｗａｖｄｅｎｇｔｈ（ｎｎ０围３．３１５＂Ｃ条件下ＰＳＣ、ＳＰＳＣ和ＤＳＰＳＣ的ＣＤ图谱Ｆｉｇ．３．３ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ０ｆＰｓＣ ＳＰＳＣａｎｄ ＤＳＰＳＣ玑１５＂Ｃ四川大学硕士学位论文ＰＳＣ和ＳＰＳＣ在２２１ｎｍ左右有个弱的正吸收峰，在１９２ｎｍ左右有负的吸收 峰，为典型的胶原螺旋构象结构。但是，它们的吸收峰的强度不同，ＰＳＣ的正 吸收峰高于ＳＰＳＣ的吸收峰，说明改性对于胶原的三股螺旋结构有一定的破坏 作用。原因很可能足改性后胶原的负电荷增加，致使胶原多肽链的排斥作用增 强，分子趋于解离。ＤＳＰＳＣ是ＰＳＣ经过沸水煮５分钟变性后，再冷却至ｌＯ℃ （低于凝胶化温度）得到的，其原二色谱图的正吸收峰发生了红移，且强度明 显低于ＰＳＣ和ｓＰｓｃ。这与文献报道情况吻合：变性胶原（明胶）若温度降至 凝胶化温度以下，无规卷曲的结构会部分转变成胶原螺旋的结构。因此，改性 没有影响到胶原的螺旋结构，变性后的胶原具有一定复性的能力。３．３．６粘度法测定ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的变性温度测定胶原的变性温度常用的方法有ＣＤ法、粘度法和ＤＳＣ法，这几种方法 各有优缺点。ＣＤ法测定准确、方便，但对仪器要求高。粘度法具有良好重现 性，但是测定过程十分耗时、麻烦。而ＤＳＣ法虽然方便简单，但是重现性不好。 用粘度法测定ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的变性温度不同地方仅是胶原溶解的溶剂不同：改 性前溶于弱酸性溶液，改性后的胶原可直接溶于中性水．粘度法测定胶原的变 性温度如图３．４所示。口暑譬．Ｉ■１ ０．９ ｏ．８ ｏ．７ ｏ．６ ｏ．５ ｏ．４ ｏ．３ ｏ．２ ０．１ Ｏ２５３０３５加４５５０ＴｅｍｐｅｒａｔⅢｅ（＇Ｃ） 图３Ａ黏度法测定ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的热变性曲线ｎｇ．３．４Ｔｈｅｒｍａｌｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｃｌｉｒｖ嚣ｏｆＰＳＣａｎｄＳＰＳＣｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｖｉｓｃｏｓｉｔｙ３ｌ四川大学硕士学位论文从图３．４可以得到ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的粘度分数为０．５时的温度（即变性温度） 分别为３８．４＂Ｃ和３４．７℃。改性使胶原的变性温度降低表明胶原的稳定性肓所降 低，造成这种变化的原因可能足胶原的负电荷增加，多肽链间排斥力增强，分 子趋于不稳定。虽然两种样品的溶剂不同，但是在变性的过程中它们经历相同 的解旋过程，即完整胶原三股螺旋（Ｔ链）解旋成旺链或者ｐ链。与此同时， 它们的粘度也随着不断下降，直至达到一个稳定的平台，变性趋于完全。化学 改性涉及到伯氨基或羧基含量的变化，对三股螺旋构象有着负面的影响１３钔。 ＳＰＳＣ的变性温度比ＰＳＣ低约４℃（与ｓＰＳＣ的ＣＤ谱在２２１ｒａｎ处正吸收峰低于ＰＳＣ的相应吸收峰的分析结果吻合）。３．３．７冻千样品的表面形貌 冻干后的改性Ｉ狠后的胶原海绵均为纯白色疏松且有弹性的海绵状结构体。 虽然改性前后的胶原在相同冻干条件（胶原的蛋白质浓度，冻干温度，真空度， 冻干降升、温速率等）下冻干，但是二者海绵表面孔隙的大小，形状和均匀度 均不同。四川大学硕士学位论文图３．５冻干ＰＳＣ（Ａ’Ｂ，Ｃ）和冻干ＳＰＳＣ（Ｄ，Ｅ＇Ｆ）的ＳＥＭ图Ｆｉｇ．３．５ＳＥＭｊ埘ｍｇ∞ｏｆｔｈｅｌｙｏｐｈｆｌｉｚｅｄＰＳＣ ＣＡ，Ｂ，Ｃ）ａｎｄｔｈｅｌｙｏｐｈｉｌｌｚｅｄＳＰＳＣ（Ｄ，Ｅ＇ＩＯ从ＳＥＭ图３．５（Ａ，Ｂ，Ｃ）看出未改性胶原冻干海绵孔隙尺寸为 １００斗ｍ～２００１．ｍｌ，形状规则，分布均匀，海绵的骨架宽度为１５ｐ，ｍ左右，为层叠多层结构。而从ＳＥＭ图３．５（Ｄ，Ｅ．Ｆ）可以看出改性后的胶原海绵体的孔隙形状不规则，多为长条状（尺寸：１００”ｍ×５００肛ｍ），．分布也不均匀，骨架宽度为 １５ｌｕｎ－１５０ｐｍ，也为层叠多层结构。孔隙形状规则，分布均匀的胶原海绵体作 为药物载体不仅有利于其它药物在海绵体上的均匀分布，也有利于海绵体吸水、 透气，因此末改性胶原比改性后的胶原具有更好的物理形态和结构。资料表明 胶原海绵体的结构主要与冻干前的胶原蛋白质浓度有关眇加】，而相同冻干条件 下冻干的ＰＳＣ和ＳＰＳＣ海绵表面形貌不同，这表明胶原分子自身的结构和状态 也是影响冻于胶原海绵结构的重要因素。 疏松多孔的结构可以赋予海绵体良好的透水气性和吸水性，作为刨伤的敷 料具有合成材料所不具有的优点和特性，如生物相容性，低抗原性，可生物降 解性等。因而，胶原海绵体单独或者作为其它药物载体在刨伤治疗和组织修复 方面已经得到了临床应用。３．３．８ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的成纤维性能 在磷酸盐缓冲液中进行ＰＳＣ和ＳＰＳＣ再生纤维实验，温度分别为３５℃和３０＂Ｃ（低于各自的变性温度）．成纤维后的沉淀，经处理、冻于后用ＳＥＭ观 察ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的再生纤维形貌如图３．６所示。图３．６ＰＳＣ（ＡｂＡ２’Ａ，’¨和ＳＰＳＣ（Ｂｌ，Ｂ勘Ｂ３，Ｂ４）再生纤维的ＳＥＭ图Ｆｉｇ．３．６ＳＥＭｉｍａｇｅｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄｆｉｂｒｉｌｓ ｏｆＰＳＣ（Ａｂ如如¨ａｎｄＳＰＳＣ（Ｂｌ，Ｂ２，Ｂ知Ｂ４）四川大学硕士学位论文ＰＳＣ和ＳＰＳＣ的再生纤维都有着明显的三维网状结构。ＳＰＳＣ再生纤维的直 径略小于ＰＳＣ再生纤维直径，规则性不如ＰＳＣ再生纤维且有着一定的取向性。 体外再生纤维与胶原的制备方法及成纤维的条件（缓冲液，温度，蛋白质浓度 等）有关【４”。ＰＳＣ和ＳＰＳＣ胶原都没有端肽，它们的成纤维动力学过程有别于 具有端肽的胶原再生纤维［３４１。就ＳＰＳＣ而言，其一级和二级蛋白质结构与ＰＳＣ 差别不大，但是电荷发生很大的变化，为了避免其静电的排斥作用，选择了弱 酸性的成纤维条件，一定程度地屏蔽了负电荷的影响。因此，静电的作用也是 成纤维重要因素。３．４小结（１）酸酐用量是影响反应接枝率重要的因素，酸酐用量大于３３％后接枝率随 酸酐用量的增加缓慢，接枝反应达到一个平台。 （２）改性后的胶原许多基本物理化学性能发生了变化：由改性前的酸溶性胶原 变成改性后水溶性胶原，等电点由改性前的碱性范围变成改性后的酸性范围， 相对粘度和特性粘数分别为未改性胶原的１．６倍和１．８倍。 （３）改性后胶原的赖氨酸含量减少，而缬氨酸含量增加，但是氨基酸组成基本 不变，与胶原一级结构的氨基酸组成特征吻合。 （４）改性后胶原的亚基（ｐ、ｏｃｌ和ａ２）组成与未改性胶原相似，只是电泳迁移 小于未改性胶原，很可能是由于相对分子质量增加和分子结构的改变造成的。 （５）改性后胶原保持典型胶原三股螺旋构象结构，而且变性后仍然有一定复性 的能力。 （６）改性影响了冻干的胶原海绵的结构，由改性前规则的蜂窝状均匀的多孔结 构变成改性后长条状的多孔结构。 （７）改性后的成纤维条件及所形成的纤维不同于未改性的胶原，其纤维呈现一 定取向且不规则，纤维的直径略小于未改性胶原。４胶原、明胶和胶原水解物的护肤功能比较 ４．１试剂及仪器４．１．１化学试剂名称 规格５％（ｗ／ｖ）产地ＳＩＧＭＡ Ｐ２２９７三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ） 十二烷基硫酸钠 磷酸氢二钠磷酸二氢钠Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｋｈｏｄａｍｉｎｅ分析纯 分析纯 分析纯成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 华美生物工程公司 上海公私合营恒信化工厂ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ） 五水硫酸铜 碘化钾 分析纯 分析纯重庆化学试剂总厂 重庆北碚化学试剂厂 天津傲然精细化工研究所 成都科龙化工试剂厂 华美生物工程公司 华美生物工程公司酒石酸钾钠对二甲氨基苯甲醛 氯氨ＴＭＣＤＢｌ５３化学纯 分析纯生化试荆 生化试剂ＫＧＭ．２细胞培养液４．１．２主要仪器名称 高速冷冻离心机规格ＧＬ２０ｌＧ．ⅡＢ一２６０ ＵＶ７５ｌＧＤ ＤＨＧ．９０７０Ａ产地 上海安亭科学仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 上海分析仪器总厂’ 上海一恒科技有限公司恒温水浴锅紫外，可见分光光度计恒温烘箱荧光显微镜 ＳＥＭＢＨ２－Ｒ凡ＪＳＭ．５９００ＩⅣＰＨＳ一３Ｃ ＲＥ．５２ＣＳＯＬＹＭＰＵＳ．日本ＪＥＯＬ，Ｊａｐａｎ精密ｐＨ计旋转蒸发器 循环水式真空泵 旋涡混合器上海精密科学仪器有限公司上海亚荣生化仪器厂ＳＨ不Ｄ（ｍ） Ｘ３口Ｖ－加Ａ浙江黄岩求精真空泵厂上海青浦沪西仪器厂四川大学硕士学位论文４．２实验方法４．２．１样品的伯氨基含量测定 样品的伯氨基含量（以每克蛋白质所含的伯氨基的物质的量计）在一定程 度上反映出单位质量样品的亲水基团含量（以每克蛋白质所含的亲水基团的物 质的量计），本实验通过三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ）方法口５１测定蛋白质溶液中伯氨 基的浓度Ｃ（ｍｍｏｌ／Ｌ），再测定该溶液中蛋白质的质量浓度Ｐ（ｚ／Ｌ），则伯氨基含量＝Ｃ／ｐ（ｍｍｏｌ／ｇ）。４．２．２实验样品的制备 ２００ｍＬ质量浓度为ｉ００９／Ｌ明胶溶液，取一半用０．４９胰蛋白酶在４０＂Ｃ水解 ４ｈ，得到胶原水解物１’。另一半加入０．０４９胰蛋白酶在同样条件下反应４ｈ得到 胶原水解物矿。冻干样品制备同２．２Ａ操作。４．２．３吸湿、保湿性测定将样品冷冻干燥后，用烘箱法测定它们的初始水分质量分数。以甘油为参 照物，在相对湿度Ｒ．Ｈ．－８１％的干燥器中，测定冻干样品吸湿率与时间的关系， 吸湿率＝【（ｗｌ－ｗｏ）／ｗｄＸ １００％，Ｗ０，Ｗ１分别为放置前样品的质量和放置一定时 间后的质量。吸湿结束后，将样品转移至ＣａＣｈ干燥器中，测定样品水分残存 率与时间的关系Ｄ２．４３］，水分残存率＝【（ｗ２－Ｗｏ）／Ｗｏ］Ｘ １００％。Ｗ０同吸湿实验，Ｗ２ 放置一定时间后的样品质量。４．２．４荧光标记样品制备 取质量浓度为ｌｍｇ／ｍＬ胶原、明胶和胶原水解物矿溶液各５ｍＬ，用 ０．２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝９．５碳酸缓冲溶液透析处理后，分别与等质量的荧光剂ＴＲｌＴＣ 反应，经透析处理，作为实验用样品。４．２．５冷冻切片样品制备 选６只９星期大白鼠，将背脊部毛剃除干净，涂上ＴＲＩＴＣ标记的样品．一 定时间后，宰杀，剥取皮肤，经冷冻切片后，用荧光显微镜观察荧光标记样品 在大白鼠皮肤表面的分布及其在切面的渗透情况。四川大学硕士学位论文４．２．６角质形成细胞的分离和培养 取新出生的小白鼠皮肤，用胰蛋白酶处理２ｈ，剥取表皮层，粉碎匀浆，反 复用培养液冲洗，然后用４００ｒｅ细胞过滤器过滤，经离心后收集角质形成细胞。 在３７＂Ｃ、体积分数为５％Ｃ０２培养箱环境中，将提取的角质形成细胞在介质培 养液中培养。大约３天４天后，细胞繁殖成锥形，可用于研究其在不同样品底 物上的贴壁和繁殖情况。４．２．７细胞吸附和生长在室温下，分别在３５ｍＬ培养皿上涂上相同质量浓度的胶原、明胶和胶原 水解物矿，２ｈ后在培养皿中加入细胞密度为４×１０４，ｃｍ２的角质形成细胞，培养 １６ｈ后，用显微镜观察细胞的生长情况。４．３结果与讨论４．３．１样品的伯氨基含量 样品的伯氨基包括分子链端的氨基以及赖氨酸侧链氨基等，一般伯氨基 含量（ｒｅｔｏｏｌ／ｇ）越大，分子链越短，相对分子质量越小。ＴＮＢＳ法测定得到各 个样品的伯氨基含量见图４．１。１．２。警１删０．６扣８Ｏａ籀ｏ．４髦ｏ．２ｂｃｄ样品种类ａ胶原水解物１．；ｂ胶原水解物ｒ：ｃ明胶；ｄ胶原 围４．１样品的伯氨基含量 Ｆ嘻４．１ Ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆｐｒｉｍａｒｙ觚ｌｉｎｏ ｇｒｏｕｐｓｏｆｓａｍｐｌｅｓ３８四川大学硕士学位论文伯氨基含量多少与样品的处理方式有关，明胶和水解胶原都是胶原水解产 物，但后者水解程度更大。因而胶原水解物的伯氨基含量最多，其次为明胶， 胶原伯氨基含量最少。胶原水解物ｌｏ比胶原水解物２’的水解程度更大，相对分 子质量更小，伯氨基含量更大。样品伯氨基含量可以反应其亲水基团的含量， 因此单位质量样品亲水基团的含量大小顺序是：胶原水解物ｌ＃＞胶原水解物２＃＞ 明胶＞胶原。４．３．２吸湿、保湿性能．皮肤一般可以分为三层：表皮层、真皮层和皮下组织层。角质层是皮肤表 皮的最外层，主要由角质形成细胞构成，是皮肤的天然屏障。随着生活水平提 高，人们要求护肤品有良好的保湿和抗皮肤衰老等功能。保湿剂有助于在干燥 的空气中保持皮肤角质层正常的水分（质量分数为：１０％。２０％），防止皮肤因 水分不足而产生皱裂、粗糙等。在国内，天然保湿剂成为护肤品研究热点之一， 已有很多关于壳聚糖及其衍生物保湿性能的研究［４４－４５１，但是有关天然胶原的护 肤功效鲜为报道。国外有了关于胶原作为护肤品的报道［４６１，一些知名品牌公司 也推出了纯胶原和一系列添加了纯胶原的护肤品。目前国产护肤品中添加的所谓胶原蛋白主要是胶原的变性或水解产物――明胶或胶原水解物。胶原、明胶和胶原水解物作为化妆品添加剂使用时，由于分子结构和生物活性的不同，使 得它们有着不同的护肤功效。Ａ６０ ５０Ｘ ４０辫３０矍２０１０ ０ ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０时间（ｈ）四川大学硕士学位论文Ｂ５５ ５０ ４５Ｓ篓褂３０ 忙２５萋薰５ Ｏ ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０时间（ｈ）图４．２样品的吸湿（Ａ）和保湿性能（Ｂ）Ｆｉｇ．４．２ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ（Ａ）ａｎｄｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（Ｂ）ｏｆｓａｍｐｌｅｓ通过测定胶原、明胶和胶原水解物在恒温、恒湿条件下吸湿、保湿性能可 以考查保湿材料自身的性能。样品放置于相对湿度为８１％的恒温干燥器中，一 段时间后，各样品吸湿、保湿性与时间的关系分别如图４．２所示。 从图４．２（Ａ）可以看出，吸湿能力从大到小顺序分别是甘油，胶原，胶原 水解物１’，胶原水解物２’和明胶；从图４．２（Ｂ）可知甘油脱水速率最快，其它几 个蛋白样品表现出十分相似的脱水速率。 吸湿保湿性能与样品的亲水基团的种类和数量，以及它们的分子结构有着 很大的关系。胶原、明胶和水解胶原样品的亲水基团（不考虑肽键）的种类是 一样，主要是氨基、羧基，少量的羟基等。但是由于制备方法的差异，它们的 亲水基团含量和分子结构存在很大差异。胶原的亲水基团含量最小，但是保持 着天然的三股螺旋的结构；明胶亲水基团含量介于胶原和胶原水解物之间，不 具有三股螺旋的结构；胶原水解物的亲水基团含量最大，也不具有三股螺旋的结构。甘油分子的亲水基团（羟基）含量大，吸湿效果最好。胶原虽然亲水基团 的含量不大，但是其具有特有的三股螺旋结构，因此吸湿效果仅次于甘油。对四川大学硕士学位论文于三股螺旋被破坏的明胶和胶原水解物而言，亲水基团含量大的，吸湿性强。 保湿性也与分子结构和亲水基团的含量有关，从实验结果看出，这几类蛋 白样品有着相似的保湿效果。但是，图４．２（Ａ）、４．２（Ｂ）所示的吸湿、保湿 性测定方法仅能反映样品自身的吸湿和保湿性，未能反映出它们对皮肤保湿性 的优劣。下面实验以大白鼠皮肤模拟人体皮肤，观察荧光标记样品在大白鼠皮 肤的表面分布和皮肤组织内的渗透情况。从而更加真实反映样品的保湿性能。４．３．３荧光标记样品的性能比较 在大白鼠背脊皮肤涂上荧光标记样品后，立即处死大白鼠，剥取皮肤，观 察三种样品初始分布，其荧光显微镜图见图４．３中Ａｌ、Ｂｌ、Ｃｌ；１２１１后处死大白 鼠，剥取皮肤，其截面的荧光显微镜图见图４．３中Ａ２、Ｂ２、ｃ２。４１硼川大学硕士学位论文刚涂上样品时ｌ Ａｔ胶原．Ｂｌ明胶．Ｃｌ胶原水解物； 涂上样品１２ｈ后ｚ Ａ２胶原，耽明胶，ｃｚ胶原水解物图４．３在大白鼠皮肤上涂布ＴＲＩＴＣ标记样品的荧光显微镜图聊窖．４．３ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ ｏｆ ＴＲＩＴＣ－ｌａｂｅｌｅｄ ＆ａｍｐｉｅｓ ｂｅｓｍｅａｒｅｄ ｏｎ ｒａｔ蝴ｄｌ衅从图４．３中Ａｌ、Ｂｌ、ｃｌ可以看出，荧光标记样品初始分布都比较均匀，没 有渗透到皮肤以及毛囊中去。而从图４．３中Ａ２、Ｂ２、ｃ２可以看出，三种样品都四川大学硕士学位论文Ａ胶原ｌ Ｂ明胶；Ｃ胶原水解物；Ｄ空白祥 围４．４在胶原、明胶和胶原水解物上培养角质形成细胞的显微照片Ｆｉｇ．４．４Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓｏｆｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｔａａｎ，ＣＯＩＬＴｇｅｌｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ从实验结果看出胶原具有明显促进角质形成细胞生长的作用，培养后细胞 呈现出锥形状，细胞密度明显大于其它三个实验样。而明胶和胶原水解物对角 质形成细胞生长无明显促进作用，与空白样相似。因此，胶原、明胶和胶原水 解物中只有胶原具有明显促进角质形成细胞生长繁殖的生理活性。而皮肤的衰 老表现为皮肤细胞生长繁殖能力下降，表皮重建能力减弱，真皮胶原合成减慢 等一Ｊ，因此胶原具有抗皮肤衰老功效。４．４小结（１）胶原伯氨基含量最少，相对分子质量最大；明胶伯氨基含量介于胶原水解 物和胶原之间；胶原水解物的伯氨基含量最大，相对分子质量最小。 （２）虽然胶原亲水基团含量相对较小，但是胶原具有天然的三股螺旋结构，在 吸湿和保湿实验中都表现出了良好的吸湿和保湿性能。分布，并且布不均匀，的样品，只 显促进角质四川大学硕士学位论文５结论通过不同制备工艺得到的胶原、明胶和胶原水解物有着不同的结构和物理 化学性能及护肤功效。而适当接技改性后的胶原仍保持胶原的三股螺旋结构， 且是水溶性的，从而拓展了胶原的应用范围。?（１）胶原的特性粘数最大，明胶次之，胶原水解物最小。因而，粘均分子量从 大到小顺序为胶原，明胶、胶原水解物。与ＳＤＳ．ＰＡＧＥ凝胶电泳测定结果吻合： 胶原的相对分子质量大约为３０万，分布很窄；明胶的相对分子质量小于３０万， 分布很宽；胶原水解物相对分子质量从几千到５万，分布也很宽。 （２）酸性温和的提取条件保持了胶原侧链氨基酸残基的完整性，等电点为８．２６； 而强碱和高温的制备条件下使得明胶和胶原水解物侧链酰胺的残基被水解，从 而产生较高密度的羧基残基，等电点分别为４．８８和４．５４。 （３）圆二色谱测定胶原在２２１ｎｍ２Ｅ右有个弱的正吸收峰，在１９２ｎｍ左右有个负 的吸收峰，是典型的胶原螺旋构象，而明胶和胶原水解物在２１０ｎｍ一２３０ｎｍ范围 内没有弱的正吸收峰，呈现出典型的无规卷曲的构象。‘（４）粘度法测定胶原溶液和ＤＳＣ法测冻干胶原样品的热变性温度分别为３７．５１２ 和４４．３℃，明胶和胶原水解物没有明显的热变性温度。在热变性过程中，胶原 经历了螺旋．无规卷曲转变，完整的胶原三聚体臼）变成单根的旺链或者二聚体 （ｐ），而明胶和胶原水解物没有呈现出明显的螺旋．无规卷曲的转变。 （５）胶原的三股螺旋稳定结构使得胶原有着许多不同于明胶和胶原水解物的物 理化学性能：胶原具有独特的成纤维性质，而它的变性产物明胶和降解产物胶 原水解物则不具有这样的性质；胶原比明胶和胶原水解物更加耐蛋白酶的水解； 胶原膜的机械性能优于明胶膜，且胶原膜有较明显的网状纤维结构存在，而明 胶膜网状纤维结构不明显。 （６）改性后的胶原许多基本物理化学性能发生了变化：由改性前的酸溶性胶原 变成改性后水溶性胶原，等电点从碱性范围变成酸性范围，相对粘度和特性粘 数分别为未改性胶原的１．６倍和１．８倍，改性后胶原的赖氨酸含量减少，而缬氨酸增加。，（７）改性后胶原的亚基（１３、ａｌ和睨）组成与未改性胶原相似，只是电泳迁移 小于未改性胶原，很可能是由于相对分子质量增加和分子结构的改变造成的。 （８）改性后胶原保持了胶原一级结构和典型胶原三股螺旋构象结构，而且变性四川大学硕士学位论文后仍然有一定复性的能力。 （９）改性影响了冻干的胶原海绵的结构，由改性前规则的蜂窝状均匀的多孔结 构变成改性后长条状的多孔结构。 （１０）改性后的成纤维条件及所形成的纤维不同于未改性的胶原，其纤维呈现 一定取向且不规则，纤维的直径略小于未改性胶原。 （１１）与明胶和胶原水解物比较，胶原亲水基团含量相对较小，但是胶原具有 天然的三股螺旋结构，因而在吸湿和保湿实验中都表现出了良好的吸湿和保湿 性能。从荧光显微图片看出：１２ｈ后，胶原在大白鼠皮肤表面仍然均匀分布，并 且部分渗透到皮肤和毛囊中；明胶和胶原水解物在大白鼠皮肤表面分布不均匀， 部分也渗透到皮肤和毛囊中。均匀分布于皮肤表面的胶原样品可以维持皮肤的 正常水分，起到良好的保湿作用。 （１２）角质形成细胞培养实验结果证明只有渗透到大自鼠皮肤和毛囊中的胶原 样品，能够明显促进角质形成细胞的生长，而明胶和胶原水解物无明显促进角 质形成细胞生长的生理功能。因此，渗透到皮肤中的胶原样品具有增强表皮重 建能力的生物活性，表现出良好的护肤功效。四川大学硕士学位论文参考文献【１１李国英，张忠楷，雷苏，等．胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异【Ｊ】．四川大学学报（工程版），２００５，３７（４）：５４－５８． 【２】ＨｏｌｍｄａｈｌＲ，Ｂｏｅｋｅｒｍａｎｎ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎＲ，Ｂａｃｌｄｕｎｄ Ｊ。ｃｔ ａＬ Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｉｃｅ―ａｍｏｄｅｌ缸ｒｌｉｅｌｌｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ们．ＡｇｅｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗｓ，２００２。ｌ：１３５－１４７．【３】ＴａｍｂｙＭＣ。ＣｈａｎｓｅａｕｄＹ，ＧｕｉｌｌｅｖｉｎＩ＾ｅｔａＬＮｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｓｙｓｔｅｍｉｃｓｃｌｅｒｏｓｉｓ川．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００３。２：１５２－１５７． 【４】李国英．胶原的类型及其结构特征川．中国皮革，２００２，３１（１７）：２０－２１．【５】徐润，粱庆华．明胶的生产及应用技术眦】．中国轻工业出版社，２０００．１５．１６【６１李国英．胶原的生理作用【Ｊ１．中国皮革，２００２，３１（１９）：２０－２１．【７】ＬｅｅＣ ＩＩ．ｓｉｎｇｈＡ＆ｋ Ｙ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ［Ｊ１．Ｉｎｔ．Ｊ．ｐｈａｒｍ．。２００１。．２２１：１－２２．【８１武继民。李荣，王岩．胶原海绵作为止血和创面敷料的临床实验讲．生物医学工程与临 床，２００３，７（３）：１５２－１５４．［９１Ｈｉｅｋｍａｎ Ｄ，Ｓｉｍｓ ＴＪ＇Ｍｉｌｅｓ Ｃ气ｅｌ ａ１．Ｉｓｉｎｇｌａｓｓ／ｃｏｌｌａｇｅｎ：ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｄｏｎａｌｉｔｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ。２０００，７９：２４５－２５７．［１０ｌ陈秀金，曹健，汤克勇．胶原蛋白和明胶在食品中的应用硼．郑州工程学院学报，２００３，２３（１）：６６－６９．［１ｌｌ唐传核，彭志英．胶原的开发和利用叨．肉类研究，２０００，（３）：４１－４３．１１２］ｌ耐ｅｓｓ Ｗ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ－５ｉｎｎ口ｍ．ｔｃｒｉａｌ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ们．Ｅｃｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．。１９９８。４５：１１３一１３６．［１３１Ｐａｅｈｅｎｅｅ Ｊ Ｍ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｓｏｆｔ ＴｉｓｓｕｅＲｅｐａｉｒ们．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｍａｔｅｄａｌｓ），１９９６，３３：３５－．４０． 【１４１ ＬｉＧＹ，Ｆｌ｜ｈ姐ｇａＳ，Ｔａｋｅｎｏｕｅｈｉ Ｋｅｌ ａＬＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｌｏｐｅｌｔｉ嚣ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ∞ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ们．ＩｎｔｅｍａｔｉｎｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｓｍｅｔｉｃ ｓｃｉ％∞。２００５．２７：１０１．１０６．Ｎ【１５】Ｅ铀甜ｓ∞ａＪ．ＳｔｅｖｅｎｓａＫ Ｒ＆ＫａｏＷＪ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ 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