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[求助]接种96孔板的肿瘤细胞药物筛选练习，怎样才能平行
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鄙人做的是肿瘤细胞药物筛选练习（选用的是hela细胞），步骤是：
1.取哦诶样的hela细胞，倾去旧的培养基，PBS清洗2-3次
2.加入适量的0.25%胰蛋白酶消化一段时间
3.倾去胰酶，加入2mL左右培养基终止消化，吹打培养瓶壁，使细胞悬液均 匀
4.移入10mL玻璃离心管中，平衡后，离心5min，1500rpm
5.倾去上清液，加入4mL-5mL新培养基，吹打均匀，计数
6.取新的10mL玻璃离心管加入所需量的细胞细胞悬液及培养基（使得细胞悬液，细胞的密度为2*104），混匀
7.将混合均匀的细胞悬液转移到加样的凹槽中，再摇一摇
8.96孔板用八道枪平行加样，每孔90微升，二氧化碳培养箱中过夜
9.次日，加PBS每孔10微升，二氧化碳培养箱培养
10.培养44h，加MTT每孔10微升，二氧化碳培养箱培养
11.再过4h，二氧化碳培养箱中取出，倒板，甩去上清液，加DMAOMTT每孔10微升,震荡，酶标仪570nm测OD值。
问题是：鄙人是新手，可做了两个月了还是不平行，附图，我觉的步骤没有多大的问题吧（老板指导的），不知是不是什么小细节没有把握好呢？还有就是细胞悬液混匀时总是出现许多的泡泡，计数板中细胞也不是很均匀，请各位高手指点迷津，看看可能是什么地方的问题。 查看完整版本请点击这里：
园丁## ( 17:42:27)
有没有注意到周围边上的数值普遍比中间的高？
最外层的孔水蒸气挥发的快，而且细胞容易分布不均匀（靠外边的温度降低速度快，细胞容易沉下来），所以周边的一排孔最好不要用，而且要加PBS保持周围的湿度一致。
细胞计数这一步非常关键，一定要混匀了才能吸细胞悬液计数，而且要保证四个中方格的细胞数差不多，中方格细胞数量少于30的算出来的结果不准确。我一般是用1ml的枪混匀，然后用200ul的枪吸一滴出来加在盖玻片边缘让它吸附过去。
种板的时候细胞混匀也很重要，我一般种一块板都用巴氏吸管吹几下，才接着种下一块板；因为有血清，所以有气泡是正常的，当然能减少气泡是最好的
细胞如果贴壁不牢，倒板的方法容易使带有结晶的细胞脱壁，造成数值不均，我一般是用排枪吸掉一半，另一半用200ul的枪小心的吸干净，再加DMSO
个人意见，仅供参考，^_^
zranqi_1 ( 17:42:51)
你的结果已经相当不错呢！
应该给我传授一下你做MTT的经验，
我现在真的是不知道自己该怎么办呢！
vcve ( 17:43:17)
请问一下，你用的这是什么分析软件啊？可以告诉我吗？我也马上要做MTT了。可是现在还无从下手。谢谢！
dongdongqiang ( 17:43:41)
不是什么分析软件
就是酶标仪自带的输出方式
guagua ( 17:44:01)
我最近也在做MTT，做了几次结果不平行，总结了一下，可能有一下的原因，大家可以讨论一下：
首先种板子的时候，细胞一定要均匀，如果一开始就不均匀，到后面细胞分裂的总数就不同；我用的96孔板的四周都是各加100 ul的灭菌水，这样细胞孔的培养液就不会大量的挥发，即使挥发，也比较平行；
加上MTT，吸走上清的时候，一定要小心，否则会把生成的紫色结晶给吸出来，自然会导致结果的不平行；
用酶标测定的时候，建议振荡15秒后测一遍，之后再不振荡测一遍，结果以不振荡测定的为准；振荡后马上测定，有可能液面还不平稳，导致吸光度的误差；
Ao7 ( 17:44:22)
呵呵，我最近也在做，lz的结果非常号了
给大家建议：最好不要用排枪，组间差太大……
不该偷懒啊
wmp1234 ( 17:44:47)
各位好啊，我也在做MTT，想请问一下做悬浮细胞的MTT时加入DMSO去除上清液一定要离心吗？
为什么空白对照孔（单纯培养基）加入DMSO后有颜色？镜下见细胞死光光了但MTT所测的OD值却很高，而有较多活细胞的孔OD值却很小有时为负数呢？有什么原因会导致这种结果？MTT结果与培养基的PH值有关吗？除与活细胞数量有关外，还与哪些因素有关呢？
我还是新手身边没有人指导，望各位帮帮忙吧，谢谢！
kswl870 ( 17:45:19)
避免气泡的方法：吹打细胞悬液时不要把滴管里面的悬液全部挤掉，留一点在里面在进行下一次的吸取，这样能有效避免气泡的产生，师姐传授的方法，很好用，大家可以试试！
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供 应 地：江苏省苏州市
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产品型号：75cm
品 牌：NUNC
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产品说明Explain
75cm细胞培养瓶,密封盖—细胞培养板&&NUNC
75cm细胞培养瓶,密封盖的产品信息：
产品名称：75cm细胞培养瓶,密封盖
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细胞培养板
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规格/：1EA,5个/包
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