& 【求助】 293T细胞用lipo2000转染后死亡很多
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【求助】 293T细胞用lipo2000转染后死亡很多
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【求助】 293T细胞用lipo2000转染后死亡很多
我的293T细胞状态不算差，但是连续进行了2次试验，lipo2000转染后细胞都大量死亡，飘起来的很多，不知道大家有啥好的建议？先说说我的具体过程。我用12孔板种的，汇合度达到了90%，质粒1.5ug，lipo20003.75uL（1:2.5）溶于opti-MEM200ul，在转染6h后拿出来看，细胞贴的还是较多，可是一换正常培养基，细胞就出现大量飘起，（我加的很温柔的啊）第二天拿出来看发现飘起的更多了，一团一团的全都浮着。在荧光显微镜下看却发现GFP是转进去了的。目前怀疑是不是含血清培养基要先预热，但是之前师兄做也没预热啊，他都没事。不知道是何缘故，明天还要再做一次，希望各位能给点指点，O(∩_∩)O谢谢！
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脂质体的转染毒性是最大的，很明显，那么多的细胞死亡是由于转染的细胞毒性导致的。对于这一点我有两个建议，一个是减少DNA的用量，我一般做转染，对于任何细胞，只要是12孔板，一般都是用1ugDNA，这个量绝对够了。,因为质粒转染进入细胞的本质，和病毒感染没区别，质粒的各种元件会从宿主细胞内抢夺细胞机器大量开始转录翻译你的目的蛋白，在这个过程中会产生大量的没有正确折叠蛋白，这些异常折叠蛋白进一步引起ER stress导致细胞凋亡。因此你用DNA太多，本身就有细胞毒性。另外就是脂质体本身的毒性。事实上，对于293系的细胞系，最好用的是PEI这种东西。毒性小，转染效率高，一般对293系列的细胞系可以轻易达到80%。polyscience有粉末买，买回来后直接在分子纯度的水里配置成1ug/uL的溶液，和你的质粒按照1ug DNA/6ug PEI对293进行转染。
而且直接使用自制的PEI非常便宜，在293上远比商品化的脂质体要好。
另外，如果你们实验室确实钱多，不怕花钱，建议你取用Promega的FugenHD,那个转染效率比脂质体更好，而且毒性小，至于价格。。。。。。。。。。。也更高。。。。。。。。。
另外，你说漂浮的细胞有表到GFP，那个不一定是真的GFP，很多时候细胞死亡后会在荧光显微镜下有非特异性荧光。
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293T本来贴壁就不紧，很有可能是吹起来的
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更正一下，是293FT细胞。虽然它本来就贴不紧，也不至于几乎全部都吹起来了呀。con就是没转染的孔就没事哦。
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我们实验室转染后换液一般都预热，而且我也用脂质体2000转染，死亡细胞很少，所以建议你换液前将培养液预热30min-1h。我们还用另一种转染试剂，invitrogen公司的lipofectamine reagent 和Plus Reagent，这两个试剂必须搭配使用，我们做过预实验，它对细胞的毒性要比脂质体2000小的多，转染效率也高，你可以试试
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谢谢你，给了这么详细的解答。我已经做完了，也成功了，主要改进了两个地方，第一，换液时一定要用预热过的培养基，第二，细胞铺板的密度要够高，至少90%。呵呵，很感谢你。
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我已经做完了，也成功了，主要改进了两个地方，第一，换液时一定要用预热过的培养基，第二，细胞铺板的密度要够高，至少90%。呵呵，很感谢你。
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我也要做转染了，不知道转染效率会怎么样。保佑！
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我也要做转染，可是也是老是容易飘
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求教，293,293T细胞染色体数目是多少，一样吗下载丁香园 App
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【求助】Hela细胞 lipo2000 lipo3000 pEGFP-C1载体
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最近在做GRP75质粒转染hela细胞，然后加药流式分析的实验，实验过程中转染效率一直不高（从lipo2000换到lipo3000），导致流式数据很难分析。我用的质粒载体是pEGFP-C1，转染时细胞密度70-80%，introvigen网站上说lipo2000转染hela效率可以很高，而lipo3000在hela上转染效率是lipo2000的3倍，那为什么我的转染效率只能达到6-8%？求各位大神解惑啊！！！卡在这里一个月了。。。
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pEGFP-C1是带荧光的吗？你是通过看荧光表达来判定转染效率吗？看着你这个是瞬时转染，那么她维持的时间很短，最多72h，所以，可以考虑转染6h后加药12、24、36h收集细胞去检测。再者注意lipo2000与DNA的加入比例为2:1，转染时细胞的满度最好在50%-70%。再就是质粒的纯度要高。和Lipofectamine 2000DNA和Lipofectamine 2000
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pEGFP-C1载体上有EGFP基因,能表达GFP蛋白，荧光显微镜下，流式看FL1荧光信号都能判定转染效率很低。我转染的时候DNA：lipo,48h后收样。质粒的A260/A280 1.7-2.0左右，以前用它转染3T3细胞，效率还好。不知你做过Hela的转染没？Hela的瞬转xiaolv很低吗？
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我也在做hela的转染，用过lipo，我做的转染效率在20-30%左右，没有文献中说的那么高，毕竟国内实验室的条件没法和国外相比。个人觉得hela对lipo很敏感，哪怕是毒性更小的lipo3000，在加入转染试剂后会死掉一片，建议缩短转染时间（lipo2000就4h，lipo3000控制在24h）；
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Red_Shoulder edited on
Hela对lipo是很敏感，特别是lipo2000，lipo3000还好，倒是没有说的死掉一片，我的是细胞状态还行转染效率还没你的一半呢！我用lipo2000是转染6h后换液的
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我的质粒长度约8k
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Red_Shoulder 我的质粒长度约8k是不是质粒太大了，难以被细胞吞噬呢
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关于丁香园还在用Lipo2000转染试剂？还在为毒性担忧？试试TS3000纳米微粒转染试剂吧！
纳米微粒转染试剂--DNA
Transfectin---TS3000促销活动
活动期间：即日起至
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1. 对于第一次购买TS3000的客户，我们将给予首次体验超级优惠价2200元/支，同时立即赠送100元面值的超市OK卡；
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DNA&Transfectin-转染试剂&
产品型号：TS3000&
产地：USA&&&
品牌：Herogen&
&&&&&&&&&&&&&&&&
产品特点：&&&&&
1. 阳离子纳米微粒，非脂质体，容易被细胞吸收，排斥少
2. 每μg DNA 用量少，转染效率高，成功率高
3. 毒性低，细胞存活率高，广泛用于瞬时和稳定转染
4. 不但适用于多种常用类型的细胞系，也适合原代细胞及其他难转染的细胞
5. 操作简便，一管化，转染后无介质变化要求，血清和抗菌素不影响转染效果
6. 增加基因表达及蛋白质表达
7. 适合转染动物细胞和昆虫细胞等
配置DNA转染复合物时，需要使用无血清无抗生素培养基，如Opti-MEM&medium等
2.选择最优的转染试剂-DNA用量比例
3.转染后无需更换培养液，不包括某些特殊的毒性敏感的细胞系
Table1. Comparsion of TS
3000 and other Transfectins
阳离子脂质体
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物进入细胞。
稳定转染，瞬时转染，所有细胞。
使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。
Lipofectamine&2000，Lipofectamine&Plus，&
FuGENE&6,&
阳离子聚合物
带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后通过内吞作用进入细胞。
稳定转染，瞬时转染，所有细胞。
除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。
Qbiogene（jetPEI&）
Qiagen(SuperFect，Polyfect）
阳离子纳米聚合物
带正电的阳离子纳米聚合物做成纳米颗粒，与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后通过内吞作用进入细胞。
稳定转染，瞬时转染，所有细胞。
除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。纳米阳离子细胞转染试剂的颗粒小并且均匀，故效率更高、毒性更低、适用更广。
DNA&Transfectin&3000
Table&2:&Example&of&cells&transfected&with&DNA&Transfectin&3000&.
Cell&Lines
Culture&type
Reagent:DNA(&l:&g)
Efficiency
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Adherent&cell
Suspension&cells
Primary&culture
human&brain&Vascular&endothelial&
Adherent&cell
Rat&brain&Vascular&SMC
Adherent&cell
Table&3:&Cell&number,&DNA&amount&and&DNA&Transfectin&3000&volume.
Culture&dish&&&&
Cell&number
Suspension&
Cell&number
DNA&Quantity
DNA&Transfectin&3000&
Opti-MEM&Volume
96&well&&&&&&&&&&
0.05-0.2x105
see&table&1
1.25-5x105
see&table&1
2.5-10x105
see&table&1
see&table&1
see&table&1
2.5-10x106
see&table&1
T-75&flask&&&&&&&
see&table&1
TS3000与Lip2000转染效率的比较！
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本人前两天进行Hela细胞转染，细胞于6孔板，约80%的覆盖度。用的是脂质体lipo2000。转染的是miRNA表达质粒，质粒自带EGFP绿色荧光基因。之前转MCF7细胞能够达到70%左右的转染效率。但这次转Hela细胞发现效率很低，只有3%左右效率，一般一个视野内只能看到4-5个被转细胞。请问有没有哪位高手转过这类细胞，用的什么方法？可以告诉我转染效率低的原因以及如何改善吗？
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回复 - H! F. y6 C. D
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能说的具体些吗？
奋勇拼搏，努力做事，认真做人！
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不同的细胞系转染的最佳条件不一样，建议优化一下。还有转染用质粒纯化了吗？我们实验室有质粒不纯化就转染效率低的！
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转染没啥技巧，根据我的经验，我感觉对于转染效率，脂质体质量、细胞种类状态、操作水平各占45%、45%、10%的权重。
脂质体假货很多，三支中可能只有一支给力。呵呵，买试剂的都是奸商。: V0 I! @- M7 j0 I% e3 _
海拉细胞的转染效率正常情况下不会低于60%，你最好先在脂质体质量、细胞状态上找原因。
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多一份坚持，多一分挚爱。
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hela细胞是比较好转的，你得看看细胞状态，质粒纯度，还有就是楼上说的脂质体是不是有问题。
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HeLa是常用的工具细胞，应该是非常好转的，同样的lipo2000，同样的质粒，同样的操作，结果竟然是3%？
确定所有试剂，所有步骤没问题，再做一次！！！
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找准方向，不能飞就走，不能走就爬
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本帖最后由 张也行 于
19:57 编辑 2 d! ^' ~) Q5 a4 d) b, ~
你的细胞怎么样？脂质体只能转染分裂的细胞，如果你的细胞状态差，分裂速度慢，转染效率会比较低。' a8 d3 V/ m7 z+ `
可以用同样的质粒转其他好转的细胞，比如293细胞，看看是不是你的质粒，转染试剂有问题。&&F. D4 w7 j9 t5 U* J, {
还有下次做的时候最好有一个阳性对照，不然像你这样出现了问题也不知道为什么。Good Luck！
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