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原辅料包材
体外检测试剂
实验方法原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 　
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、用于检测未知抗原的双抗体夹心法 1.
用0.05 M PH9 牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 ml，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
加一定稀释的待检样品0.1 ml于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1 小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 　　 3.
加酶标抗体
于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 小时，洗涤。 　　 4.
加底物液显色
于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 ml，37 ℃10～30 分钟。 　　 5.
于各反应孔中加入2 M硫酸0.05 ml。
（1）可于白色背景上，直接用肉眼观察结果。
反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
（2）可测OD值
在ELISA检测仪上，于450 nm（若以ABTS显色，则410 nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
二、用于检测未知抗体的间接法
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10 μg/ml，每孔加0.1 ml，4 ℃过夜。次日洗涤3 次。
　　　　　　　　　　　　　　
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1 ml于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
　　　　　　　　　　　　　　
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗体）0.1 ml，37 ℃孵育30-60 分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。
　　　　　　　　　　　
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 　　 2.
在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括 　　 （1）固相载体的选择
许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。 　　 （2）包被抗体（或抗原）的选择
将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4 ℃18～24 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10 μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10 μg/ml。 　　 （3）酶标记抗体工作浓度的选择
首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定。然后再固定其它条件或采取“方阵法“（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。 　　 （4）酶的底物及供氢体的选择
对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
实验方法原理
BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素（B）与亲和素（A）间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68 kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力（结合常数高达1015M-1）。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、用于检测未知抗原的BA-ELISA 1.
用0.05 M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml，4 ℃过夜（18-24小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 分钟（简称洗涤，下同）。 　　 2.
加入待检样品（未知抗原）或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔，阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 小时，洗涤。 　　 3.
已作适当稀释的生物素化抗体（B-Ab），加于每孔0.1 ml，37 ℃孵育30～60 分钟。洗涤。
已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素（A-HRP），于每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～45 分钟。洗涤4 次。
于上述各反应孔中加入临时配制的TMB（或OPD）底物应用液0.1 ml，于37 ℃10～30 分钟。再加2 M H2SO4 0.05 ml以终止反应。
目测或在ELISA比色仪上测OD值。
二、检测未知抗体的BA-ELISA程序
用0.05 M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1 ml，4 ℃18-24 小时。用洗涤缓冲液洗3 次，每次3 分钟。
　　　　　　　　　　　　　　　
加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、阴性和阳性对照孔。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
　　　　　　　　　　　　　　　　
加稀释过的生物素化抗抗体（抗人或鼠等的IgG），每孔0.1 ml， 37 ℃30-60 分钟，洗涤。
　　　　　　　　　　　　　　　
余下步骤同测未知抗原的BA-ELISA。
反应物的浓度及比例由于本法敏感性很高，牥括所用抗原或抗体均较ELISA法为少，对生物素标记的抗体（或第二抗体）的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。 　　 2.
生物素的稳定性
生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，宜长期保存，加入等量60 ％甘油于-20 ℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融会使制剂的活性受到损害。 　　 3.
亲和素的稳定性
亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4 ℃置2 个月或在-30 ℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。 　　 4.
亲和素的非特异性吸附
亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。 　　 5.
反应物的作用时间及温度
由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般于37 ℃以20-30 分钟为宜。
实验方法原理
硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而，将抗原吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后（即可与膜上的抗原结合），然后再加入带有标记物的抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而判定结果。根据所用的标记物不同，可分为：辣根过氧化物酶免疫斑点试验（使用辣根过氧化物酶作为抗抗体的标记物），碱性磷酸酶免疫斑点试验（使用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物作为酶标记物）和金银染色免疫斑点试验（使用胶体金作为抗抗体的标记物）等。其中，最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免疫斑点试验。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、辣根过氧化物酶免疫斑点试验 　　　　　　　 1.
将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl点于硝酸纤维素膜（或醋酸纤维素膜）上 　　　　　　　　　　　　　　　 2.
置37 ℃温箱中干燥20～30 分钟 　　　　　　　　　　　　　　　
滴加封闭液37 ℃温盒中封闭10 分钟
　　　　　　　　　　　　　　　
用洗涤液洗1～2 次，滤纸吸干
　　　　　　　　　　　
加用稀释液稀释的抗体或待检标本，置37 ℃湿盒中30 分钟
　　　　　　　　　
用洗涤液震洗3 次×3 分钟、吸干
　　　　　　　　　　　
水洗终止反应，观察结果。出现明显综色斑点者为阳性
二、碱性磷酸酶免疫斑点试验
　　　　　　　
将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl点于硝酸纤维素膜上
　　　　　　　　　　　　
置37 ℃温箱中干燥20～30 分钟
　　　　　　　　　　　　　　　
用封闭液37 ℃湿盒中封闭10 分钟
　　　　　　　　　　　　　
用洗涤液震洗1～2 次，滤纸吸干
加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本，置室温湿盒中30 分钟
　　　　　　　　　　　　　　　
用洗涤液震洗3 次×3 分钟，吸干
　　　　　　　　　
加1∶50稀释的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清，置室温湿盒中30 分钟、洗同前、吸干
　　　　　　　　　　　
加APAAP复合物于膜上、室温湿盒中30 分钟，洗同前、吸干
　　　　　　　
加1∶50稀释的抗鼠IgG血清，置室温湿盒中10分钟，震洗1次、吸干
　　　　　　　　　　　
加APAAP复合物，温育、洗涤同“9”
　　　　　　　　　　　　　　　
重复“9”和“10”1～3次
　　　　　　　　　　　　　　
洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
滴加新配底物溶液显色5～10分钟，水洗中止反应，观察结果
一、免疫斑点试验的影响因素　1.
包被N、C膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500～1000 μg/ml为宜。浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。 　　 2.
酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。 　　 3.
显色时间，一般认为5-10 分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。 　　 4.
用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般5～10 μl即可。
实验方法原理
尽管辣根过氧化物酶（HRP）可以催化Luminol-H2O2反应体系产生化学发光，但由于该体系的检测灵敏度不够高，不能满足酶联免疫测定的要求。因此，为了提高体系的检测灵敏度，可将HRP催化H2O2氧化曙红（Eosin）的反应与该反应产物增强HRP催化luminol-H2O2的化学发光反应相偶合，建立偶合放大化学发光酶联免疫分析法。这里，酶的活性是基于下列发光反应进行检测的 　　　　　　　　HRP luminol＋H2O2───→产物＋hν 　　　　　　　
↑　　　　　　　　　　　　　　　　 Eosin＋H2O2 ────┘
血清中HBsAg含量越高，结合的酶标抗体越多,则偶合放大化学发光强度越强；反之亦然。因此，可以根据检测到的化学发光光强度来间接定量人血清中HBsAg的水平。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
包被抗体　在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300 μl用0.05 M，PH9.6 碳酸盐缓冲液稀释的抗HBsAg抗体，同时设空白对照，置4 ℃过夜。 　　 2.
用抽滤针头吸干管内液体，加入Tris-HCl-Tween20洗涤3 次，每次加2 ml，放置3～5 min，用抽滤针头吸干管内液体。 　　 3.
加待检血清和阳性标准品　
用PBS-Tween20缓冲液不同倍数稀释HBsAg阳性标准品或待检血清，每管加入300 μl。同时设阴性对照，空白对照管只加抗体稀释液。置37 ℃孵育2 h。 　　 4.
同2。 　　 5.
加酶标抗体　
用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg抗体，每管加入300 μl，空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37 ℃孵育2 h。 　　 6.
同2。 　 7.
化学发光测定　
给每管加入300 μl底物溶液，置37 ℃保温20 min。然后将小试放入LKB-1250 lumimeter中，并置于测量位置，加入300 μl 5.0×10－4 M luminol。记录仪记录化学发光强度。 　　 8.
同时用ELISA方法进行对照，结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。
洗涤要彻底，以免因血清中其他来源的过氧化物酶类物质所产生的非特异性反应，而影响测定结果。 　　 2.
实验中，应分别设置阳性、阴性、空白对照来控制实验条件，且每份样品均应做三个复管，以保证实验结果的准确性。 　　 3.
为了克服酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，可用适量小牛血清加以抑制。 　 4.
当加入luminol后，迅速产生化学发光并使发光在一秒钟内达到峰值，然后很快衰减到基线水平。因此，只有当小试管置于仪器的测量位置时，方可加入luminol。 　　 5.
底物的加入，是为了增强化学发光强度。但只有当底物分子与酶催化活性中心充分接触时，反应速度才能加快。当反应进行15 min达到平衡时，牷学发光强度则不再随时间的延长而变化，且在1 h内保持稳定，因此，控制底物与酶反应15 min后加luminol进行化学发光测定。 　
一、结果判定 1.
按下列公式判别阴、阳性
　　　L样品－L空白　　
┌≥2.1　为阳性
S/N ＝ ────────　＝　商│
L阴性对照－L空白
　 └＜2.1　为阴性
以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标，不同稀释倍数为横坐标，作出剂量反应曲线（标准曲线），待测样品中HBsAg的含量就可由测量的化学发光强度换算得到。
实验方法原理
125I标记的单克隆抗体能与具有相应抗原的细胞结合，有数百倍以上未标记的特异性抗体同时存在的条件下，则标记抗体的结合受到竞争性抑制。根据不同稀释度抗体分别与相同数量细胞结合后所测得的特异性计数值，可以计算出每个细胞表面的平均抗原密度以及抗原和抗体的亲和力。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
硅化规格相同的5 ml玻璃管，双蒸水冲净后烤干，每次实验分6～12组，每组5支试管 　　　　　　　　　　　　　　　　 2.
将125I标记抗体和非标记抗体分别用结合缓冲液作倍比稀释 　　　　　　　　　　　　　　
在同一组5个试管中每管加入10 μl标记抗体，4、5管加入10 μl未标记抗体（浓度高于同组标记抗体100倍以上），1、2、3管补加10 μl结合缓冲液
　　　　　　　　　　　　　　　
洗涤分离或培养的细胞，用结合缓冲液调整细胞浓度为5×105～1×106/80 μl，每管中加入80 μl细胞悬液
　　　　　　　　　　　　　　　　
轻轻振摇后在4 ℃条件下（冷室或冰浴上）孵育30 min
　　　　　　　　　
将孵育后的细胞悬液叠加于预先置小塑料管内的200 μl分离液上
　　　　　　　　　　　　　
台式高速离心机10000 g
　　　　　　　　　　　　　　　　　
切下位于管底细胞小团
　　　　　　　　　　　　　　　　
特异性计数值＝总计数值（每组1、2、3管平均cpm值）—非特异性计数值（每组4、5管平均cpm值）。
结果用LIGAND和EBDA微机程序进行Scatchad分析，计算出细胞表面抗原密度以及抗原与抗体结合的亲和力。
每管所需要细胞数根据细胞种类而定，一般在5×105～1×106 /管，若用血小板可用1×108 /管。 　　 2.
所用McAb要求纯度好、活性高。用氯胺-T法标记抗体时，氯胺-T作用时间不要超过30 秒，比活性以3～6 μci/μg McAb为宜，标记率在50～70 ％，保持125I标记后McAb的结合活性。 　　 3.
细胞、抗体等计数、取样要精确。 　　 4.
孵育时间和温度视竞争结合试验所用细胞和抗体的不同有所差别，可在室温或37 ℃条件下进行，孵育时间30 min～4 h不等。 　　 5.
在整个操作过程中防止未标记抗体对只加标记抗体管的污染，否则会使整个实验失败。 　
(共1个问题)
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兔、小鼠、羊
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HLA CDA12; HLA G histocompatibility antigen class I G; HLA-6.2; HLA-A; HLA-B; HLA-C; HLA-F; HLA-G; HLAF; Major histocompatibility complex class I A; major histocompatibility complex class I; Major histocompatibility complex class I E; Major histocompatibility complex class I F; MHC; MHC Class I MHC G.; B2 HLA 6.0; HLA 60; HLA class I histocompatibility antigen alpha chain G; HLA class I histocompatibility antigen alpha chain G HLA-G; HLA G HLA G histocompatibility antigen class I G; HLA G HLA G2.2; HLA G3; HLA60; HLAG; Human Leukocyte Antigen G Histocompatability Antigen Class 1; L Major histocompatibility complex class I G; MHC class I MHC class I MHC G; Murine homolog of Qa; T Cell A L TCA.
英文名称：Anti-HLA G(C-terminal)产品编号：HK8599抗体来源：Rabbit Or Mouse性
状：Lyophilized or Liquid（冻干粉或液体）浓
度：1mg/1ml亚
型：IgG产品规格：0.1ml/0.2ml研究领域：心血管，免疫学，新陈代谢等交叉反应：人，大鼠，小鼠，犬，猪，羊等（Human, Mouse, Rat, Dog, Pig, Cow）产品应用：WB=1:100-500 ELISA=1:500-1000 IHC-P=1:100-500 IHC-F=1:100-500 IF=1:100-500（石蜡切片需做抗原修复）not yet tested in other applications. Optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user. 类白细胞抗原G抗体（C端）,Anti-HLA G(C-terminal)优势：1. 抗体纯化方面，我们采用亲和层析技术，亲和层析是一种吸附层析，一步亲和层析就可达到超过99%的纯度。在抗体的检测方面我们执行严格的检测标准，为您提供高品质抗体。我们的每一个抗体都经过严格检测和稳定性测试，保证了结果的准确性，敏感性，特异性。 2.该抗体适用于多种科研实验，包括BCIP/NBT,AP（Affinity Purification），B/N（Blocking/Neutralize），CD（Cell Depletion），ELISA(Cap)，ELISA(Det)，ELISA(Comp)，FC(Flow Cytometry)，WB（Western Bolt）等。 3.公司抗体种类齐全，包括一抗，标记一抗，二抗，标记二抗，酶标记二抗，生物素二抗，荧光色标记二抗，胶体金标二抗，亲和纯化二抗IgG，免疫球蛋白抗原，免疫血清等，满足不同客户的不同实验需求。 类白细胞抗原G抗体（C端）,Anti-HLA G(C-terminal)注意事项：1.重复冷冻/融化循环可使抗体变性，导致其形成使抗体结合能力降低的聚集物。保存于-20℃对于大多数抗体是适当的；保存于-80℃无明显优势。冰箱不能为无霜型。这些冷冻和融化之间的循环（以减少结霜）恰恰是应该避免的。 2.抗体试剂瓶应置于具有最小温度波动的冰箱区域，例如朝冰箱后部放置而不是置于门架上。有些研究人员加入冷冻保护剂甘油达到50%的终浓度以防止冷冻/融化损伤；甘油可将凝固点降低至低于-20℃。虽然这对于很多抗体是可接受的，但是只有一小部分我们提供的抗体测试了在该保存条件下的稳定性，并且我们的保证仅使用于按数据表上推荐的方式保存的抗体。不建议将包含甘油的溶液保存于-80℃，因为该温度低于甘油的凝固点。请注意甘油可被细菌污染，如果加入甘油或任何冷冻保护剂，则应当小心操作，以得到无菌制备物。 3.应避免抗体在稀释至工作浓度后在4℃下保存超过一天。蛋白质在高浓度下保存时一般不易降解，理想的浓度为1mg/ml或更高。这是在抗体溶液中加入蛋白质例如BSA作为稳定剂的理论基础。加入的蛋白质也有助于减少抗体因结合于容器壁上而造成的损失。对于打算进行偶联的抗体而言，由于稳定蛋白质会与抗体竞争，降低了偶联的效率，所以不应加入稳定蛋白质。 类白细胞抗原G抗体（C端）,Anti-HLA G(C-terminal)温馨提示：在实验后，请注意回收稀释的抗体。回收的抗体在进行Western实验时至少可以重复使用10次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4℃保存。回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 类白细胞抗原G抗体（C端）,Anti-HLA G(C-terminal)等相关热销产品：HK7209
磷酸化肌原调节蛋白抗体
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MAPK调控蛋白TRB2抗体
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神经丛蛋白B3抗体
Anti-Plexin B3HK8613
硫酸乙酰肝素6脑苷脂转硫酸酶1抗体
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Anti-Phospho-cdc25C (Ser216)HK3176
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5-氨基乙酰丙酸合酶1抗体
Anti-ALAS2/ALAS-E
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