DNA甲基化PCR引物的设计_中华文本库
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DNA甲基化PCR引物的设计
DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[1]。目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)是研究DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。国外互联网上有1个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测CpG岛,根据实验者要求设计硫化测序PCR(bisulfate-sequencing PCR, BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)引物。本研究旨在介绍甲基化特异性PCR引物设计的原则及“MethPrimer”设计程序的使用方法和有关注意事项。
1 材料与方法
1. 1 序列的转换
DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP。
1. 2 CpG岛的预测[2]
哺乳类动物基因组中5% ~10%是CpG(二核苷酸),其中70% ~80%呈甲基化状态,称为甲基化的CpG(mCpG)。CpG的聚集称CpG岛,已知在所有管家基因和一些组织特异基因的5′端调控区均有CpG岛呈高度甲基化,基因组中平均100个bp有1个跨度为0. 5~5 kb的CpG岛。
“MethPrimer”设计程序默认的CpG岛跨度至少为200 bp,GC含量&50%,CpG出现频率&0. 6。因此,符合这些参数的区域都默认为CpG岛,我们根据任意1个CpG岛设计引物进行扩增。
1. 3 BSP的引物设计原则
标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外,“MethPrimer”应用3′端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。
DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列,设计引物。对于BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。
1. 4 MSP的引物设计原则[3,4]
对于MSP需要设计2对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基
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http://www.urogene.org/methprimer/index1.html首先在GENEBANK中找到基因的完整序列,选择其启动子区,一般作为5"端,可以先在下面的网站中预测CpG岛位置及其含量http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/将含有CpG岛的GC含量比较高的认为是启动子区的序列填入这个在线引物设计网站可以设计bisulfite sequencing PCR or restriction PCR和MSP的引物,按照需要选择即可.最后出来的引物(一般是5对,)建议都合成,扩增的时候可以同时进行,一般可以扩出来,具体还要自己去摸索实验条件.
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