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荧光原位杂交技术在临床病埋中的应用
荧光原位杂交技术(FISH)在 荧光原位杂交技术(FISH)在 (FISH) 临床病理中的应用与质控广西至科大学一附院病理科 王华? 荧光原位杂交技术(FISH): 荧光原位杂交技术(FISH):用带有荧光素标记的核酸探针与组织细 用带有荧光素标记的核酸探针与组织细 荧光素标记的核酸探针 胞中待测的核酸(DNA、RNA)按碱基配对 胞中待测的核酸 、 按碱基配对 的原则进行特异性结合， 的原则进行特异性结合，在荧光显微镜下 显示细胞基因状态的方法。 显示细胞基因状态的方法。FISH在临床病理中的应用 FISH在临床病理中的应用辅助病理诊断、判断预后、 辅助病理诊断、判断预后、指导临床治疗一、常用荧光素及滤光片类型荧光素颜色 Red(红色) Red(红色) 红色 Orange(橙色) Orange(橙色) 橙色 Green(绿色) Green(绿色) 绿色 Aqua(青蓝色) Aqua(青蓝色) 青蓝色 DAPI(蓝色) DAPI(蓝色) 蓝色 激发波长 发射波长 常用滤光片 592 559 497 433 367 612 588 524 480 452Red单通道 Red单通道 Orange单通道 Orange单通道 G/O双通道 G/O双通道 Green单通道 Green单通道 G/O双通道 G/O双通道 Aqua单通道 Aqua单通道 Blue单通道 Blue单通道二、常用探针种类? ? ? ? ? 单色探针(single color probe, SC) 双色探针(dual color probe, DC) 三色探针(triple color probe, TC) 双色分离探针(dual color, break apart probe. DC,BCR) 双色单融合探针(dual color, single fusion. DC, SFTrans)? 额外信号探针(extra signal. ES) ? 双色双融合探针(dual color,dual fusion probe. DC,DF Trans)单色探针(SC)CEP8正常异常双色探针(DC)正常 HER2 CEP17异常三色探针(TC)正常 X Y CEP18异常双色分离探针(DC,BCR)MYCMYC14正常1814异常18双色单融合探针(DC, SF Trans)BCRBCRABLABL9正常229异常22额外信号探针(ES)ABLBCRABLBCR9正常229异常22双色双融合探针( DC,DF Trans)IGHBCL2IGHBCL214正常1814异常18三、FISH检测 FISH检测 在常见肿瘤中的应用与意义乳腺癌? 探针: HER2/CSP17（双色探针） 探针: 双色探针）? HER2基因检测意义： HER2基因检测意义： 基因检测意义HER2基目扩增的患者预后差: HER2基目扩增的患者预后差:无病生存和总生存期缩 基目扩增的患者预后差 淋巴结转移几率高，复发凤险高。 短，淋巴结转移几率高，复发凤险高。 指导内分泌冶疗：HER2基因扩增患者对内分泌治疗产 指导内分泌冶疗：HER2基因扩增患者对内分泌治疗产 生耐药。 生耐药。 指导合理选择辅助化疗方案：HER2基因扩增患者宜采 指导合理选择辅助化疗方案：HER2基因扩增患者宜采 用紫杉醇化疗和高强度的蒽环类药物方案。 用紫杉醇化疗和高强度的蒽环类药物方案。 筛选分子靶向药物的适用者：HER2基因扩增患者适合 筛选分子靶向药物的适用者：HER2基因扩增患者适合 使用曲妥珠单抗药物。 使用曲妥珠单抗药物。Her2 (-) 2G + 2R Ratio: 1/1 &2.2/1, Her2 FISH (-)Her2 (+++) Ratio: &2.2/1, Her2 FISH (+)? 探针：TOP2A/CSP17（双色探针） 探针： 双色探针）TOP2A基因两种异常：扩增和缺失。 基因两种异常：扩增和缺失。 基因两种异常? TOP2A基因检测的意义： TOP2A基因检测的意义： 基因检测的意义存在TOP2A基因异常的患者预后差，尤其是基因缺失 基因异常的患者预后差， 存在 基因异常的患者预后差 的患者预后更差。 的患者预后更差。 TOP2A基因异常患者对于含蒽环类药物的治疗方案更 基因异常患者对于含蒽环类药物的治疗方案更 敏感。 敏感。非小细胞肺癌? 探针：EGFR/CSP7（双色探针） 探针： 双色探针）EGFR基因异常：扩增和拷贝数增加。 基因异常：扩增和拷贝数增加。 基因异常? EGFR基因检测的意义： EGFR基因检测的意义 基因检测的意义：常. 30%~40%非小细胞肺癌存在 非小细胞肺癌存在EGFR基因异 非小细胞肺癌存在 基因异 筛选酪氨酸激酶抑制剂适用者： 筛选酪氨酸激酶抑制剂适用者：EGFR基因 基因 增多的患者，应用Iressa/Tarceva治疗的有效率为 增多的患者，应用 治疗的有效率为 35%，疾病控制率高达 ，疾病控制率高达70%。 。EGFR (-) 2G + 2R Ratio: &2.0, EGFR FISH (-)EGFR (+) Ratio: &2.0, EGFR FISH (+)滤泡性淋巴瘤? 探针: BCL2/IGH （双色双融合探针） 探针: 双色双融合探针）BCL2基因位于18q21， IGH基因位于 基因位于14q32. BCL2基因位于18q21， IGH基因位于14q32. BCL2/IGH 基因位于18q21 融合基因导致BCL2蛋白的过度表达，从而抑制B细胞凋亡， 融合基因导致BCL2蛋白的过度表达，从而抑制B细胞凋亡， BCL2蛋白的过度表达 细胞持续增殖引发肿瘤。 使B细胞持续增殖引发肿瘤。? BCL2/IGH融合基因检测意义: BCL2/IGH融合基因检测意义: 融合基因检测意义辅助诊断FL BCL2/IGH重排发生在约80%-85%的FL患 重排发生在约80% 辅助诊断FL ：BCL2/IGH重排发生在约80%-85%的FL患 者中。 者中。 BCL2/IGH持续阴性的FL患者 年生存率为100% 持续阴性的FL患者3 100%， BCL2/IGH持续阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳 性者3年生存率只有54% 阴性者3 54%； 性者3年生存率只有54%；阴性者3年疾病无进展的患者 87.5%，而阳性者只有13% 13%。 87.5%，而阳性者只有13%。BCL2/IGH 正常BCL2/IGH断裂、平衡易位弥漫性大B细胞淋巴瘤? 探针：BCL6（双色分离探针） 探针： 双色分离探针）BCL6基因位于3q27，主要有t(3;14)，t(3;22)和 BCL6基因位于3q27，主要有t(3;14)，t(3;22)和 基因位于3q27 t(3;14) t(2;3)3种易位 分别是BCL6与免疫球蛋白Ig的重链(IGH) 种易位， BCL6与免疫球蛋白Ig的重链(IGH)、 t(2;3)3种易位，分别是BCL6与免疫球蛋白Ig的重链(IGH)、 轻链(IGL) (IGL)、 轻链(IGK)区域易位。 (IGK)区域易位 λ轻链(IGL)、κ轻链(IGK)区域易位。? BCL6 基因断裂检测意义目前研究确定至少40%的DLBCL涉及3q27染色体易位或 目前研究确定至少40%的DLBCL涉及3q27染色体易位或 40% 涉及3q27 BCL6基因重排 基因重排。 者BCL6基因重排。 BCL6阳性患者诊断治疗36个月后 阳性患者诊断治疗36个月后， BCL6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停止发展的比 率为82% 携带有BCL6重排的病例预后较好。 82%， BCL6重排的病例预后较好 率为82%，携带有BCL6重排的病例预后较好。BCL6正常 正常BCL6断裂 断裂套细胞淋巴瘤? 探针：CCND1/IGH（双色双分离探针） 探针： 双色双分离探针）CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32。 CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32。 基因位于11q13 基因位于14q32 CCND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达 融合基因导致CCND1蛋白过度表达， CCND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达，可促进细胞 增生。 增生。? CCND1/IGH融合基因检测意义 CCND1/IGH融合基因检测意义CCND1基因重排和( CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，FISH探 基因重排和 高表达是MCL的特征，FISH探 MCL的特征 针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96% CCND1/IGH的阳性率可以达到96%。 针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96%。CCND1/IGH正常 正常CCND1/IGH断裂易位 断裂易位伯基特淋巴瘤? 探针:C-MYC（双色分离探针） 探针: 双色分离探针）8号染色体上 号染色体上C-MYC基因最常见的是 ；14)，导致 基因最常见的是t(8； ，导致8 号染色体上 基因最常见的是 号染色体上C-MYC基因和 号染色体上 基因和l4号染色体上 增强子元件并列, 号染色体上 基因和 号染色体上IGH增强子元件并列 增强子元件并列 也可发生t(2； 也可发生 ；8)(p12；q24)，或t(8；22)(q24；ql1) ； ， ； ；? C-MYC基因断裂检测意义 MYC基因断裂检测意义的伯基特淋巴瘤病例发生t(8； （ 约80%的伯基特淋巴瘤病例发生 ；14)（q24;q32）； 的伯基特淋巴瘤病例发生 ）； 的伯基特淋巴瘤病例发生t(2； 约15%的伯基特淋巴瘤病例发生 ；8)(p11;q24)； 的伯基特淋巴瘤病例发生 ； 发生t(8； （ 约5%发生 ；22)（q24;q11）。 发生 ）。 C-MYC基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志， 基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志， 基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志 可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。 可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。C-MYC正常 正常C-MYC断裂 断裂MALT淋巴瘤? 探针： MALT1（双色分离探针） 探针： 双色分离探针） API2/MALT1（双色双融合探针） 双色双融合探针）API2（11q21）MALTI（18q21）易位形成 （ ） （ ） API2/MALTI融合基因，产生 融合基因， 融合蛋白， 融合基因 产生API2/MALTI融合蛋白，导致细 融合蛋白 胞增殖，引起肿瘤。 胞增殖，引起肿瘤? MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义 融合基因检测意义10%-20%的粘膜性淋巴组织淋巴瘤中会存在 的粘膜性淋巴组织淋巴瘤中会存在MALT1 基 的粘膜性淋巴组织淋巴瘤中会存在 因的断裂重组，辅助诊断MALT淋巴瘤。 淋巴瘤。 因的断裂重组，辅助诊断 淋巴瘤 指导针对胃API1/MALT1淋巴瘤患者的抗幽门螺旋菌治 指导针对胃 淋巴瘤患者的抗幽门螺旋菌治 存在MALT1 基因的断裂重组的患者不适合用抗生素治 疗： 存在 疗。 预后判断：存在 预后判断：存在MALT1 基因的断裂重组的节外胃淋巴瘤 患者更容易出现局部进展期病变。 患者更容易出现局部进展期病变。MALT正常MALT断裂API2/MALT正常API2/MALT断裂易位滑膜肉瘤? 探针：SYT 探针：SYT基因位于18q11．2,又称SSl8或SSXT基因 SYT基因位于18q11．2,又称SSl8或SSXT基因 。 基因位于18q11 又称SSl8? SYT基因检测意义 基因检测意义辅助诊断滑膜肉瘤。 辅助诊断滑膜肉瘤。 文献报道，90％ 文献报道，90％以上的滑膜肉瘤中存在染色体易位 t(X；18)(p11． q11．2)，导致位于18q11 18q11． SYT基 t(X；18)(p11．2；q11．2)，导致位于18q11．2的SYT基 因和位于Xp11 Xp11． SSX基因融合 基因融合。 因和位于Xp11．2的SSX基因融合。脂肪肉瘤? 探针：MDM2/CEN12 探针： ? MDM2基因检测意义： MDM2基因检测意义： 基因检测意义辅助诊断高分化脂肪肉瘤。 辅助诊断高分化脂肪肉瘤。 文献报导： 高分化脂肪肉瘤中MDM2基因存在扩 文献报导：90%高分化脂肪肉瘤中 高分化脂肪肉瘤中 基因存在扩 增。胃肠道间质瘤? 探针：CCND1/CEN11 探针： MDM2/CEN12? 检测意义： 检测意义：CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、 基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、 基因为重要预后因子 复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等 中扩增， 复发等相关。在高凤险们 中扩增 风险GIST中无扩增，其表达与 中无扩增， 有预后相关性。 风险 中无扩增 其表达与GIST有预后相关性。 有预后相关性 MDM2基因扩增宣 基因扩增宣GIST患者有预后相关性。 患者有预后相关性。 基因扩增宣 患者有预后相关性前列腺癌? 探针：PTEN/CEN10 探针： FGFR1/CEN8 ERG ? 检测意义： 检测意义：PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。 基因缺失，前列腺癌患者预后差。 基因缺失 FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重 基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重 要过程。 要过程。 没有ERG基因改变的前列腺癌患者 年生存期达 基因改变的前列腺癌患者8年生存期达 没有 基因改变的前列腺癌患者 年生存期达90%。 。神经母细胞瘤、神经胶质瘤? 探针：1p36/1q25 探针： 19q13/19p13 NMYC/2q11 ? 检测意义： 检测意义：在神经母细胞瘤患者中， 丢失是强烈的预后差因子 丢失是强烈的预后差因子， 在神经母细胞瘤患者中，1p丢失是强烈的预后差因子， 提示临床应采取积极主动的治疗策略； 提示临床应采取积极主动的治疗策略； 结合1p， 结合 ，19q基因状态可辅助治疗和预测退行性少突 基因状态可辅助治疗和预测退行性少突 神经胶质瘤的预后效果。 神经胶质瘤的预后效果。 NMYC基因扩增为预后差因子，指导个性化治疗。 基因扩增为预后差因子， 基因扩增为预后差因子 指导个性化治疗。黑色素瘤? 探针：PTEN/CEN10 探针： ? 检测意义：PTEN基因缺失导致 基因缺失导致PI3K/AKT（磷酸肌醇 激酶 /丝 基因缺失导致 （磷酸肌醇3激酶 丝 途经激活，指导抗PI3K/AKT通路 氨酸苏氨酸蛋白激酶 ）途经激活，指导抗 通路 药物。 药物。 PTEN基因缺失的患者预后差。 基因缺失的患者预后差。 基因缺失的患者预后差宫颈CIN、宫颈癌? 探针：TERC/CSP3 探针：? 检测意义：病埋分级 TERC扩增率 扩增率正常/炎症 正常 炎症CIN1CIN2CIN3原位癌 95.7%4.2%7.3% 69.2% 85.1%对于CIN1/CIN2的患者，TERC基因扩增的患者发 的患者， 对于 的患者 基因扩增的患者发 生进展/恶变的可能性超过 生进展 恶变的可能性超过50%，需要及时治疗。 ，需要及时治疗。 恶变的可能性超过 辅助明确宫颈CIN分级，选择合理的治疗方案。 分级， 辅助明确宫颈 分级 选择合理的治疗方案。膀胱癌? 探针：CSP3/CSP7 P16/CSP17 探针： ? 检测意义：膀胱癌9号染色体部分(P16位点)缺失或全部丢失是最 膀胱癌9号染色体部分(P16位点) (P16位点 常见的遗传学异常之一， 常见的遗传学异常之一，这一异常与膀胱癌的旱期发望密 切相关。 切相关。 膀胱癌的发展与染色体不稳定性( 17号 膀胱癌的发展与染色体不稳定性(如3号、7号、17号 染色体的非整倍性)紧密相连。 染色体的非整倍性)紧密相连。 早期无创性诊断泌尿系统移行上皮癌。 早期无创性诊断泌尿系统移行上皮癌。 泌尿系统移行上皮癌术后复发监测。 泌尿系统移行上皮癌术后复发监测。四、FISH操作流程? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 石蜡切片58-60℃过夜 石蜡切片58-60℃过夜 58 二甲苯脱蜡，酒精脱二甲苯， 二甲苯脱蜡，酒精脱二甲苯，水化组织 高压处理组织切片 胃蛋白酶处理组织 干燥组织切片后滴加探针， 干燥组织切片后滴加探针，加盖玻片与封固剂 高温（73℃~95℃） 高温（73℃~95℃）变性 杂交16小时（过夜） 16小时 杂交16小时（过夜） 揭去橡胶水泥和盖玻片, 揭去橡胶水泥和盖玻片,进入杂交后洗涤 酒精脱水、晾干。 酒精脱水、晾干。 滴加DAPI DAPI荧光封片剂 滴加DAPI荧光封片剂 荧光显微镜下观察五、FISH判读标准 FISH判读标准? 乳腺癌HER2基因检测: 乳腺癌HER2基因检测: HER2基因检测20个肿瘤细胞 个肿瘤细胞HER2基因（红信号）点数总 基因（ 个肿瘤细胞 基因 红信号） 和与CEN-17（绿信号）点数总和的比值。 和与 （绿信号）点数总和的比值。 HER2/CEN-17≥2.2 HER2基因有扩增 基因有扩增 HER2/CEN-17＜1.8 HER2基因无扩增 ＜ 基因无扩增 HER2/CEN-17 1.8~2.2 定为不确定结果。 定为不确定结果。 需重新再进行另外20个的细胞计数或重复 需重新再进行另外 个的细胞计数或重复 FISH检测，如仍不确定，则建议临床结合 检测， 检测 如仍不确定，则建议临床结合IHC检 检 测HER2蛋白表达情况决定是否使用靶向治疗。 蛋白表达情况决定是否使用靶向治疗。 蛋白表达情况决定是否使用靶向治疗?CEN-17多体性：计算以上计数的20个细 多体性：计算以上计数的 个细 多体性 胞的绿信号点数均值。 胞的绿信号点数均值。 CEN-17均值 ＜1.75 亚二体性 均值 CEN-17均值 1.76~2.25 二体性 均值 CEN-17均值 2.26~3.75 低多体性 均值 CEN-17均值 ＞3.76 高多体性 均值? 非小细胞肺癌EGFR基因检测: 非小细胞肺癌EGFR基因检测: EGFR基因检测50个肿瘤细胞 个肿瘤细胞EGFR基因（红信号）点数总 基因（ 个肿瘤细胞 基因 红信号） 和与CEN-7（绿信号）点数总和的比值。 和与 （绿信号）点数总和的比值。 EGFR基因扩增阳性： 基因扩增阳性： 基因扩增阳性 EGFR基因簇状扩增 基因簇状扩增 EGFR/CEN-7≥2.0 40% 肿瘤细胞红色信号 个 肿瘤细胞红色信号&4个六、FISH检测规范与质控 FISH检测规范与质控? 影响FISH制片质量的因素 影响FISH FISH制片质量的因素组织处理的规范化: 组织处理的规范化: 及时固定:冷缺血时间&1h 及时固定:冷缺血时间&1h 4%中性缓冲甲醛 中性缓冲甲醛6 4%中性缓冲甲醛6-48h 不推荐微波固定 乙醇脱水 浸蜡温度&68℃ 浸蜡温度&68℃ 不使用快速石蜡组织做FISH FISH检测 不使用快速石蜡组织做FISH检测脱蜡、 脱蜡、脱二甲苯 组织消化 变性、 变性、杂交的温度 杂交后洗涤液PH PH值 杂交后洗涤液PH值 &6周的组织切片不应再用于 周的组织切片不应再用于FISH检测 周的组织切片不应再用于 检测? 影响FISH判读的因素 影响FISH FISH判读的因素采用正确的滤光片观察 Orange/red 正确判定肿瘤细胞(HE→IHC→FISH) 正确判定肿瘤细胞(HE→IHC→FISH) 肿瘤异质性表达 导管内癌/ 导管内癌/浸润性癌 浸润性癌不同部位 至少两位阅片者
导管内癌浸润性导管癌免疫组化技术、 免疫组化技术、蛋白组学技术的发展 ↓ 21世纪初蛋白质指纹图谱技术建立 21世纪初蛋白质指纹图谱技术建立 ↓ 新蛋白质种类的发现 ↓ 10年时间 年时间 免疫组化抗体种类 ↓ 对临床病理的影响DNA测序技术的进步 DNA测序技术的进步 ↓ 人类基因组计划初步完成于2000年完成测定人体23对染色体全部DNA序列，完成人类基因组“工作框架图” 。年完成测定人体23对染色体全部DNA序列，完成人类基因组“工作框架图” 年完成测定人体23对染色体全部DNA序列 年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。 年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。↓ 人类基因组研究进入规模化 荧光原位杂交技术的发展 ↓ FISH探针的种类 FISH探针的种类 ↓ 对临床病理的影响
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文档资料库内容来自网络，如有侵犯请联系客服。跨膜型TNF-α-白血病细胞的标志物和抗体治疗靶点Tim-3未知配体的寻找及其功能的初探--《华中科技大学》2012年博士论文
跨膜型TNF-α-白血病细胞的标志物和抗体治疗靶点Tim-3未知配体的寻找及其功能的初探
【摘要】：我们报道了一个病例，根据流式细胞仪及免疫荧光杂交技术检测该病例淋巴结，发现其含有50.26%恶性淋巴细胞和50%IGH/BCL-2阳性肿瘤细胞。为了确定肿瘤内皮细胞是否具有肿瘤的恶性特征，我们利用免疫磁珠法和CD31单克隆抗体从肿瘤组织中分离内皮细胞,其形态学上呈扁长型的细胞形态，胞浆中具有Weibel-Palade小体；流式细胞术的结果显示，分离的内皮细胞高表达vWF和CD34，其纯度超过90%。随后，我们利用荧光原位杂交技术检测纯化的内皮细胞染色体状况，结果发现绿色IGH探针和红色BCL-2探针的单融合信号，与标准的滤泡型淋巴瘤14、18号染色体双融合信号不同。这一独特现象也在淋巴瘤细胞中观察到。这可能因为IGH位于的14号染色体断裂点不同导致失去一个绿色融合信号。从肿瘤中分离的内皮细胞，其染色体异常的比例达到18%，提示滤泡型淋巴瘤的一部分内皮细胞具有与肿瘤细胞相同的染色体异常等恶性特征。
TNF-α对肿瘤有双刃剑的作用：一方面TNF-α能杀伤肿瘤细胞而无碍于正常细胞，另一方面TNF-α也利于肿瘤生长，因为TNFR基因敲除小鼠的肿瘤生长较野生型小鼠缓慢，肿瘤自身表达TNF-α，可以促进肿瘤细胞存活，抵抗凋亡。本研究检测跨膜型TNF-α（TM-TNF-α）在白血病中的表达，并初步探讨TM-TNF-α在白血病中的作用，观察TM-TNF-α抗体体内外对白血病细胞的杀伤效应。其主要结果如下：
1.TM-TNF-α在急性白血病中广泛表达：我们采用流式细胞术对10例健康供者、33例AML及22例ALL病人的骨髓单个核细胞进行TM-TNF-α表达的检测，其中ALL患者TM-TNF-α强阳性者约占86.36%，AML强阳性患者约占72%，其中15例M5强阳性者占86.67%。提示部分白血病患者（约2/3）的白血病细胞高表达TM-TNF-α。
2.比较正常干细胞和白血病干细胞对TM-TNF-α的表达：AML的CD34+CD38-干细胞TM-TNF-α强阳性者占88.89%，而ALL的CD34+CD7-（CD19-）干细胞强阳性者占85.71%，但正常人CD34+CD38-干细胞则几乎不表达TM-TNF-α。白血病干细胞和白血病细胞表达TM-TNF-α呈正相关。
3.ALL表达TM-TNF-α与髓外浸润相关：有髓外浸润的ALL细胞TM-TNF-α表达率较无髓外浸润者高（p0.05），提示TM-TNF-α表达越高，越易出现白血病细胞的髓外浸润。
4.干扰白血病细胞表达TNF-α，可抑制其增殖，促进其凋亡：沉默TNF-α表达后THP-1增殖减缓，并且凋亡稍有增高。
5.TM-TNF单抗诱导CDC和ADCC效应：与阴性对照美罗华相比，抗TM-TNF-α抗体有一定CDC（30%-35%）和ADCC效应（40%-45%），与上市抗S-TNF单抗类克的效应之间无明显差异。
6.抗TM-TNF-α抗体体内杀伤效应：TM-TNF-α抗体治疗组较美罗华对照组小鼠肿瘤发病率低，且成瘤体积减小，与类克治疗组无明显差异。
结论：TM-TNF-α在部分白血病中高表达，且与白血病细胞增殖、浸润密切相关。单独使用TM-TNF-α抗体减少肿瘤发病率，并抑制肿瘤生长。本研究结果为以TNF-α为靶点靶向治疗白血病提供了实验依据和新线索。
迄今为止，Tim-3分子发现的唯一配体是galectin-9，本实验室前期工作证实淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3可抑制T细胞活化和增殖，从而导致肿瘤免疫逃逸。为全面了解Tim-3的信号途径，本研究成功构建表达sTim-3的原核和真核蛋白，并发现THP-1单核肿瘤细胞株表达galectin-9以外的配体。通过免疫共沉淀的方法和液相质谱钓取与sTim3共沉淀的膜受体，并初步探讨Tim3对其功能的影响。其主要结果如下：
1.人sTim3原核表达及检测：我们采用分子克隆技术，将人Tim3胞外段基因序列按照细菌嗜好密码修改，插入原核表达载体pet28a+中，成功进行原核表达。其表达sTim3可与两种淋巴瘤细胞系Su及Hut78表面结合。
2.人sTim3-IgG1CH融合蛋白真核表达载体构建与表达：利用重叠PCR技术将Tim3的信号肽和胞外段基因序列连接（sTim3），又将sTim3与IgG1重链恒定区基因序列连接（sTim3-IgG1CH），并插入真核表达载体pIRES2-EGFP。将该质粒稳转CHO细胞，经流式和免疫印迹证实CHO细胞表达并分泌sTim3-IgG1CH融合蛋白。
3.用sTim3-IgG1CH融合蛋白筛选表达Tim3未知配体的细胞株：用流式分别检测八种白血病细胞系，其中HL-60、Kassumi、RS4-11、Raji、Su的galectin9的表达率与sTim-3-IgG1CH同细胞的结合率基本一致；而THP-1表达galectin-9仅55%，但sTim3-IgG1CH与细胞的结合率则达到99%，提示THP-1可能表达Tim3未知配体。
4.免疫共沉淀钓取Tim3未知配体：用免疫共沉淀和和液相质谱钓取与sTim3-IgG1CH共沉淀的膜受体，证实除了galectin-9外，还有galectin-1及galectin-8，同时还获得Tim3信号途径中T细胞活化抑制分子1。
5.sTim3-IgG1CH融合蛋白对THP-1细胞的作用：利用CBA试剂盒观察sTim3-IgG1CH对THP-1分泌细胞因子的影响，证实sTim3可明显抑制THP-1细胞分泌TNF-α，对IL-10分泌有轻度促进作用。
结论：本研究初步证实Tim3结合的未知受体可能是galectin家族成员；sTim3明显抑制单核细胞分泌TNF-α，提示Tim3有可能促进巨噬细胞向M2型转化。但是，这些结论还需用大量实验进一步证实。本研究结果为Tim3抑制免疫机制提供了新线索。
【学位授予单位】：华中科技大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：R733.7
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中国重要会议论文全文数据库
胡欢开;刘彦信;郑德先;;[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
陈信义;高智捷;刘江涛;李自全;王玉芝;;[A];第六届全国中西医结合血液病学术会议论文汇编[C];2002年
钱文斌;金洁;童茵;徐伟来;;[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
殷红;陈子兴;岑建农;王玮;傅建新;姚利;;[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
祝毓琳;张英;杨英;杜金伟;朱平;;[A];第四届全国RNA进展研讨会论文集[C];2005年
岑建农;陈子兴;李振江;邱桥成;;[A];2005年华东六省一市血液病学学术会议暨浙江省血液病学学术年会论文汇编[C];2005年
谢晓宝;邱国强;盛立霞;;[A];2005年华东六省一市血液病学学术会议暨浙江省血液病学学术年会论文汇编[C];2005年
王大刚;种靖慧;刘淑艳;马翠花;林永敏;吴克复;郑国光;;[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
兰志建;汤永民;宁铂涛;张玲燕;沈红强;钱柏芹;;[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
张群岭;张梅;贺鹏程;蔡瑞波;郭桂丽;关虹;刘亚琳;;[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
中国重要报纸全文数据库
汪敏　仇逸;[N];中国高新技术产业导报;2003年
仇逸;[N];新华每日电讯;2003年
汪敏 仇逸;[N];中国医药报;2003年
卢晶、余宁宁;[N];人民日报;2005年
顾介铸　本报通讯员
袁开建;[N];新华日报;2011年
市二院血液内科副主任医师 王智;[N];无锡日报;2006年
张乐 余宁宁;[N];大众科技报;2005年
米力汪;[N];科技日报;2006年
卢勤;[N];中国医药报;2004年
刘燕玲;[N];健康报;2007年
中国博士学位论文全文数据库
王钦红;[D];复旦大学;2004年
宋满根;[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2005年
赵芳;[D];山东大学;2005年
靖彧;[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
张鹏霞;[D];吉林大学;2008年
王伟佳;[D];重庆医科大学;2009年
宋宁霞;[D];第二军医大学;2010年
周晓曦;[D];华中科技大学;2012年
周晓曦;[D];华中科技大学;2012年
仇灏;[D];苏州大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库
乔斌;[D];天津大学;2004年
翁春岚;[D];重庆医科大学;2007年
张翔;[D];扬州大学;2005年
于杜娟;[D];吉林大学;2007年
詹昱;[D];南方医科大学;2008年
蔚利纳;[D];郑州大学;2010年
盛立霞;[D];苏州大学;2005年
古莹;[D];浙江大学;2007年
宋宁霞;[D];第二军医大学;2007年
宋洋;[D];大连医科大学;2008年
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