双荧光素酶实验中的问题(荧光素酶,转染,脂质,报告基因) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 双荧光素酶实验中的问题(荧光素酶,转染,脂质,报告基因)
摘要: [双荧光素酶实验中的问题(荧光素酶,转染,脂质,报告基因)] 最近在做双荧光素酶报告基因实验，前几次做的结果还好，FLUC酶活和RLUC酶活值都在十几万左右，现在连续做了三次，转染后，酶活测定，FLUC和RLUC酶活值都只有几千，不知道到底为什么？转染的细胞一样，也还是用lip2000转染的，转染质粒量和脂质体量比例未改变。请大家帮忙， 关键词:[转染 荧光素酶 脂质 报告基因 质粒]……
最近在做双荧光素酶报告基因实验，前几次做的结果还好，FLUC酶活和RLUC酶活值都在十几万左右，现在连续做了三次，转染后，酶活测定，FLUC和RLUC酶活值都只有几千，不知道到底为什么？转染的细胞一样，也还是用lip2000转染的，转染质粒量和脂质体量比例未改变。请大家帮忙，
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电话：021-利用荧光素酶报告基因检测启动子的转录效率 - 实验交流 - 生物秀
标题: 利用荧光素酶报告基因检测启动子的转录效率
摘要: [利用荧光素酶报告基因检测启动子的转录效率]
报告基因和化学发光将基因导入培养细胞或者完整的有机体，对其转染效率的检测是涉及的基础研究的基本前提，并且有可能在医疗方面，如相关的基因治疗(gene therapy)，将会有进一步的发展和应用。在过去几年，相继报道了大量的非特异的报告基因，如
b-半乳糖苷酶，b-葡糖苷醛酸酶，萤光素酶以及最近发展出来的b-内酰胺酶和绿色荧光蛋白（GFP）。萤火虫荧光素酶报告检测系统在10年前就已经被引入（1-3），并广泛的应用…… [关键词:启动子 荧光素酶 基因 转染 质粒 转染试剂]……
报告基因和化学发光
将基因导入培养细胞或者完整的有机体，对其转染效率的检测是涉及的基础研究的基本前提，并且有可能在医疗方面，如相关的基因治疗(gene therapy)，将会有进一步的发展和应用。在过去几年，相继报道了大量的非特异的报告基因，如
b-半乳糖苷酶，b-葡糖苷醛酸酶，萤光素酶以及最近发展出来的b-内酰胺酶和绿色荧光蛋白（GFP）。萤火虫荧光素酶报告检测系统在10年前就已经被引入（1-3），并广泛的应用在学和医学等研究领域（4-8）。这些研究包括检测体内肿瘤组织的生长情况（9）；检测质粒的拷贝数（10）；重组的杆状病毒的复制（11）；检测巨噬细胞中的抗分枝杆菌试剂（12）；在活细胞或者完整的动物体中，实时检测基因的转录水平（13-15）；突变的DNA的修复（16）；以及具有相似特征的基因体外转染和基因调节的检测（17-19）。荧光素酶报告系统使得在同一细胞或者有机体中能够检测两个或者更多的转录基因成为可能（20）。而对于研究基因在一个细胞群、以及在一定时期内的转录调节，用传统的荧光分光光度计对荧光素酶报告基因进行检测显然受到技术上的制约，目前采用的荧光微孔板技术则能够打破这些制约条件。我们在这里向大家展示的是一篇有关利用荧光素酶报告系统检测启动子的转录效率的应用实例。其中把对建成细胞和初级细胞的转染效率进行了比较。这篇应用实例表明，使用多功能的
Tecan Genios Plus
使得对胞内基因的表达活性进行定量分析成为可能。
构建转基因载体
利用 PCR从BAC B.2克隆中扩增 emilin
基因（弹性纤维的胞外基质组件）的启动子，并且在5&端引物中添加了一个 Kpn I酶切位点，在3&端引物中添加了一个
I酶切位点。因此，在PCR扩增片段两端包含的限制性酶切位点将与PGL3载体的多克隆位点中的酶切位点相匹配，PGL3载体中的包含了一个萤火虫荧光素酶的cDNA。PCR扩增片段利用宝灵曼的纯化试剂盒纯化，然后用
Kpn I和 Sac
I双酶切后，再经纯化，将其连接在PGL3载体中。将重组质粒转化DH5α菌株中。简而言之，其操作过程是：lμl的质粒稀释到0.1-1
ng/ml，然后与70μl的细胞混合后，在冰上放置30分钟，在42°C热激两分钟。重悬细胞与1ml的LB培养基混合，在37°C下放置30分钟，离心沉淀，然后重悬后，将细胞涂布在琼脂糖平板上。将平板在37°C下温育，挑选克隆，然后重悬在5ml添加了30μg/ml卡那霉素的的LB培养基中，震荡培养。使用Qiagen
maxiprep试剂盒从150ml的细菌培养物中提取质粒DNA，在260nm测定吸光值对DNA进行定量。
使用通用引物RV3和GL2（反向引物），PCR鉴定含有重组质粒的阳性克隆。挑选一个阳性克隆，将其命名为 PGL3 promo
1 ，然后利用Wizard miniprep
kit（Promega）纯化质粒，对插入序列测序以验证其正确性，然后使用Maxi prep
kit（Qiagen）大量提取质粒。
测试的细胞包括建成人类细胞系
MES-SA（平滑肌肉瘤），SK-UT-1（平滑肌肉瘤），SK-LMS-1（平滑肌肉瘤），HT-1080（纤维肉瘤），A204（横纹肌肉瘤），RD-KD（横纹肌肉瘤），SW-982（滑膜鞘肉瘤）和ECV-304（内皮）；从12到14天的鸡胚胎中分离的大动脉平滑肌原细胞（ACSMC）和肌腱纤维原细胞；一个非建成细胞系DMR，它是从感染了子宫内平滑肌肉瘤的病人的循环转移细胞中衍生的。将建成细胞系，DMR细胞和初级细胞培养在添加了10%FCS的DMEM中。
按照制造商的说明书，分别采用四种不同的转染试剂，包括
DMRIE-C，脂质转染试剂（Lipofect -amine）， Lipofectamine Plus (Gibco-BRL)
和FuGene6( Boehringer
Mannheim)，将三个装载了荧光素酶报告基因的pGL3质粒（Promega）分别转染细胞：pGL3-CN中包括一个SV40启动子和一个荧光素酶的cDNA，pGL3基本载体包括一个
emilin 基因的启动子，但是不包含荧光素酶cDNA： pGL3 promo 1
包含一个荧光素酶cDNA和一个 emilin 基因的启动子。 100μl 无血清的DMEM中添加了10μl
DMRIEC或者脂质转染试剂，然后加入 2 g
质粒，混合物在室温下温育30分钟，然后补加800μl无血清DMEM，同时缓慢振荡。在一个六孔板中，接种后的转染细胞的密度为每孔30，000-12，5000细胞。将这些细胞培养大约48小时，可以达到
~ 70%-80% 的铺满度。用无血清的DMEM洗板，然后加入混合好的转染溶液，与细胞在37° C下共培育2-24小时 。最后加入
1μ l 添加了20%FCS和2%谷氨酸盐的DMEM终止转染，继而再置于37° C
下72小时。当使用FuGene转染试剂时，在加到细胞培养物之前，3μl的转染试剂与97μl无血清的DMEM，以及2g的质粒和溶液在室温下培育15分钟。转染细胞生长72小时后，检测启动子的活性（如下所示范）。
测定荧光素酶活性的方法
Promega提供的荧光素酶分析检测系统的说明，对转染细胞的荧光素酶活性进行监测，该试剂盒提供D型荧光素酶，ATP和辅酶A。后者可以加快催化反应，使之产生生物荧光发光信号，并使该信号能够持续1小时以上。简而言之，将细胞反复洗后，加入4倍体积的双蒸水和1倍体积的报告子裂解缓冲液，以裂解细胞（为达到合适的溶液体积以进行检测）。裂解的细胞被收集到Eppendorf离心管，震荡，然后在10，000转下离心15分钟，以除去细胞碎片，这些细胞碎片有可能干扰荧光信号。20μl的裂解细胞与100μl的荧光素酶检测试剂混合，将溶液分别点在96孔微孔板（Nunc）的小孔中。使用
SPECTRAFLUOR Plus 检测发出的荧光信号。
将瞬时转染 pGL3 做为对照质粒，由于缺少荧光素酶 cDNA
，因此测得的荧光信号小于最大测试信号的 1% （未显示）。对比三种转染试剂（脂质转染试剂， DMRIE-C 和 FuGene 6
）的转染效率，脂质转染试剂的效率最高，但是在含血清的培养物中， FuGene6 却是一个不错的选择。对于高效的启动子（例如 SV40
启动子），不同的细胞有着组成型的调节能力，因此可以将 pGL3-CN
转染的细胞作为一个基准。但是对于弱效启动子，不同细胞类型对内源的启动子调节能力有一定的差别，但这种差别并不是与给定的细胞类型直接相关的，所谓的细胞类型如恶性细胞和正常细胞，初级细胞和无限增殖细胞。来自于弹性组织和平滑肌肉细胞的初级纤维原细胞中，
Emilin 基因启动子的活性被加强。由于 emilin 是弹性纤维的胞外基质组件，因此这一研究发现，与
emilin 基因的组织特异性表达的特点是一致的。而由于 emilin 在内皮中不表达，因此在
ECV304 细胞中检测到的荧光素酶活性比较低，进一步表明这些细胞不能够对 emilin 启动子进行调节（
Fig.1 ）。
在平滑肌肉瘤细胞系 SK-LMS-1 中， emilin
基因启动子显示了很强的启动子活性，而在其它的平滑肌肉瘤细胞系中，如 DMR ， MES-SA （数据未显示）和 SK-UT-1
细胞（未显示）， emilin
启动子的活性则显得很低甚至检测不到。这些结果表明，经转化后，一些类型的平滑肌肉细胞失去了对 emilin
启动子的调节能力。与此不同的是，在纤维原细胞系 HT1080 中，可以检测到很高的荧光素酶活性，这种情况与在 CEF
细胞中观察到水平一致，因此暗示了，纤维原细胞的表达调节机制与平滑肌肉细胞是不同。
体外和体内外源基因的导入是研究特异基因功能的基本方法，并且它也将逐渐成为医疗尤其是基因治疗(gene therapy)的必需手段。因此，如果开发出一个非破坏性的转基因方法，将能对基因的转染效率做出迅速和可靠的评估。在微孔板中检测转基因表达将使得有可能迅速和准确的对大量的样品进行比较和检验。现在的几个报告基因检测系统（
GFP转染的应用文章）的应用，将使得能够对同一细胞进行多重转染，并且能够对转导的不同基因分别进行独立分析。在本文中，利用
Teczn Genios Plus 微孔板可以进行
荧光和化学发光联合检测，因此，有可能将开发出体外多基因转染和检测的手段
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双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意
双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意
来源：互联网
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1．报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。
2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。
3．双荧光素酶报告基因的载体选择：
a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；
b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）。
4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。
5．最适反应温度：室温（20-22℃）。各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。
6．双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差
7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年
8．裂解产物与底物混合（手动加样）：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。
9．发光半衰期：
a)单荧光素酶检测试剂盒（E1500），萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12min
b)双荧光素酶检测试剂盒（E1910），萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min
10．检测结果
检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；
样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。
(责任编辑：大汉昆仑王)
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