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第三章 色谱分离原理
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高效液相色谱手性冠醚固定相拆分丙氨酸、正缬氨酸和犬尿氨酸对映体
□ 李齐 林琳 唐民华 许旭
中国科学院上海有机化学研究所,上海200032
摘　要:采用高效液相色谱法在手性冠醚柱上拆分丙氨酸、正缬氨酸和犬尿氨酸3种对映体。使用CROWN—PAKCR（＋）柱（150mm×4mm，5μm），以HClO4溶液（pH1．0）为流动相，柱温20℃，流速1．0mL／min，丙氨酸、正缬氨酸和犬尿氨酸的检测波长分别为200、220和254nm，3种氨基酸都得到手性拆分。考察了流动相流速、温度及pH对分离的影响，并通过对选择性、保留时间和柱效的考察判断影响分离度的因素。结果表明：降低温度有助于提高手性选择性，但会降低柱效，从而影响分离度。在0～20℃柱温范围内研究了Ink’、lnα与1／T的关系，计算了3种氨基酸对映体与固定相相互作用的热力学函数。
作者单位：中国科学院上海有机化学研究所，上海 200032【摘要】&
采用高效液相色谱法在手性冠醚柱上拆分丙氨酸、正缬氨酸和犬尿氨酸3种对映体。使用crownpak cr(+)柱(150 mm×4 mm, 5 μm)，以hclo4溶液（ph 1.0）为流动相，柱温20 ℃，流速1.0 ml/min，丙氨酸、正缬氨酸和犬尿氨酸的检测波长分别为200、220和254 nm，3种氨基酸都得到手性拆分。考察了流动相流速、温度及ph对分离的影响，并通过对选择性、保留时间和柱效的考察判断影响分离度的因素。结果表明： 降低温度有助于提高手性选择性，但会降低柱效，从而影响分离度。在0～20 ℃柱温范围内研究了lnk′、lnα与1/t的关系，计算了3种氨基酸对映体与固定相相互作用的热力学函数。
【关键词】& 高效液相色谱法，手性冠醚柱，对映体拆分，丙氨酸，正缬氨酸，犬尿氨酸
&& 1& 引& 言
&&& crownpak cr（+）柱[1,2]以硅胶涂敷手性冠醚为手性固定相，该冠醚含有手性联萘基，不仅能拆分色氨酸等氨基酸[3]，也能拆分手性中心附近有伯胺基团的其它化合物[4]。通常认为它的手性识别机理是冠醚与手性样品中胺离子之间形成立体配位络合物。
&&& l?丙氨酸和l?正缬氨酸是合成手性药物的常用中间体；l?犬尿氨酸是具有多种特殊生理作用的活性分子，其代谢状态与人体生理机能密切相关。为简便高效地拆分这些氨基酸，需要发展与之相应的分析方法。目前仅见衍生化的芴甲氧羰基丙氨酸在 chirobiotic t 手性大环糖肽抗生素固定相上的拆分[5]，以及用自制的冠醚键合相简单拆分丙氨酸[6]的报道。本实验采用crownpak cr（+）柱对d,l?丙氨酸、d,l?正缬氨酸和d,l?犬尿氨酸进行了分离，并研究了流速、温度和ph对分离度（rs）、选择因子、容量因子和柱效的影响，计算了3种氨基酸对映体与固定相相互作用的热力学函数。
　　2& 实验部分
&&& 2.1& 仪器与试剂
&&& series 200型液相色谱仪（美国perkin elmer公司）；fa1004天平（上海天平仪器厂）；dc?1006型低温水浴槽（上海衡平仪器仪表厂）；crownpak cr（+）手性色谱柱(150 mm&4 mm，5 &m，daicel chemical industries）。hclo4（70%，优级纯，上海金鹿化工有限公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；d,l?丙氨酸（纯度＞99.0%， 国药集团化学试剂有限公司），d,l?正缬氨酸（上海百泰化学科技有限公司），d，l?犬尿氨酸(纯度＞95.0%， sigma?aldrich公司)。
&&& 2.2& 流动相和样品的配制
&&& 流动相的配制： 取10 ml 70% hclo4定容至1 l即得ph 1.0的hclo4流动相；取316 ml ph 1.0 hclo4定容至1 l 即得ph 1.5 hclo4流动相；取100 ml ph 1.0 hclo4定容至1l 即得ph 2.0 hclo4流动相。
&&& 样品的配制：分别称取10 mg d,l?丙氨酸，30 mg d,l?正缬氨酸及2 mg d,l?犬尿氨酸，用1 ml蒸馏水溶解。
&&& 2.3& 色谱分离条件
&&& 将配制好的样品溶液分别在不同的ph、温度和流速的条件下进行hplc分析，丙氨酸、正缬氨酸和犬尿氨酸的检测波长分别为200、220和254 nm。
　　3& 结果与讨论
&&&& 3.1& 流速对分离的影响
&&& 考察流速对分离度rs、选择因子&、容量因子k&和理论塔板数n的影响，结果见表1。表1& 流速对3种氨基酸分离的影响 由表1可见, 在拆分d,l?丙氨酸、d,l?犬尿氨酸时流速升高使分离度rs降低。改变d,l?正缬氨酸流速,并未对分离度rs、选择因子&和容量因子k&产生明显影响；而在拆分d,l?丙氨酸、d,l?犬尿氨酸时流速升高使理论塔板数（n）降低，在拆分d,l?正缬氨酸时流速的改变对理论塔板数没有明显影响。可以认为，本实验中流速主要通过影响柱效来改变分离度rs。
&&& 3.2& 温度对分离的影响
&&& 考察温度对分离度rs、选择因子&、容量因子k&和理论塔板数n的影响，结果见表2。表2& 温度对3种氨基酸分离的影响色谱条件同表1(hplc conditions are the same as table 1)。&&& 由表2可见,在拆分d,l?丙氨酸、d,l?正缬氨酸时，温度升高使分离度rs降低。对于d,l?犬尿氨酸，温度在0～10 ℃范围内改变对分离度rs没有明显影响；而在10～20 ℃范围内分离度rs下降；温度的升高使选择因子&和、容量因子k&降低，理论塔板数n升高。可以认为，本实验中分离度的变化是三者共同影响的结果。
&&& 3.3& ph对分离的影响
&&& 在使用ph 2.0和ph 1.5的hclo4溶液为流动相时，d,l?丙氨酸、d,l?正缬氨酸未能分离，在ph 1.0时可完全分离，说明降低ph有利于这2种氨基酸的拆分。对于d,l?犬尿氨酸，ph对选择因子&影响不大。
&&& 3.4& 分离结果
&&& 图1为3种氨基酸在ph 1.0、温度为20 ℃、流速为1.0 ml/min条件下的分离色谱图。由图1可见，3种氨基酸均能达到基线分离。经标准品比对，丙氨酸和正缬氨酸均为d型先出峰。
　　3.5& 3种氨基酸对映体与固定相相互作用的热力学函数
&&& 在分离机理没有发生变化时，色谱分离过程中容量因子k&和分离因子&的热力学关系式分别如下[6～8]：
&&& lnk&=－&&&／ｒｔ＋&ｓ&／ｒ＋ln&&&&&&&& ln&=－&ｄ，ｌ&&&／ｒｔ＋&ｄ，ｌ&ｓ&／ｒ
&&& 其中，&h&和&s&分别表示相转移的焓变和熵变，&表示相比率，&d,l&h&和&d,l&s&分别表示d型和l型从流动相到固定相分配过程焓变和熵变的差值，r为气体常数（8.314 j/（mol&k）），t为绝对温度（k）。根据公式分别用lnk&、ln&与1/t作图。由图2和图3可见，在0～20 ℃柱温范围内，lnk&、ln&均与1/t呈线性关系，且随1/t的升高而增大。说明3种氨基酸的手性拆分机理在此温度范围内没有变化。由ln&的热力学关系式和ln&与1/t的线性关系式可知，&d,l&h&和&d,l&s&均为负，所以在使用手性冠醚固定相拆分d,l?丙氨酸、d,l?正缬氨酸和d,l?犬尿氨酸时都为焓驱动过程。温度的降低有利于对映体的分离。
&&& 4& 结& 论
&&& d,l?丙氨酸、d,l?正缬氨酸和d,l?犬尿氨酸在手性冠醚柱crownpak cr（+）上都可得到拆分。通过对分离度rs、选择因子&、容量因子k&和理论塔板数ｎ的详细考察，可以得到以下结论：在本实验中，流速主要通过影响柱效而改变分离度，流速的降低有利于样品的拆分；降低温度在提高选择性的同时降低柱效，总体上温度的降低有利于样品的拆分；降低ph有助于冠醚固定相对样品的拆分。对色谱分离过程中热力学函数的研究显示，在0～20 ℃柱温范围内，lnk&、ln&均与1/t呈线性关系，且随1/t的升高而增大。说明3种氨基酸的手性拆分机理在此温度范围内没有变化，温度的降低有利于对映体的分离。
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