PCR产物克隆方法
导读： PCR产物克隆方法： 1. 平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子
PCR产物克隆方法：
1. 平端连接
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
2. 粘端连接
&引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成3-4个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5'端改变1个或几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的长度，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法更为适宜。 T4DNA聚合回切产生粘端：如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'&5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需在PCR引物的5'端加2-4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。
3. T－vector法 　　TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3'端突出一个胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸苷。因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时，用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾载体，称为T－vector。用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物，使平端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备的T－vector的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接，仅5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。
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------分隔线----------------------------产生平末端的PCR产物可以进行TA克隆吗对于用高保真TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物，如何进行克隆？还有PCR产物的T-vector克隆方法，应注意哪些操作环节？
星映瞳0418
1 平末端的PCR产物,首先需要用普通的taq酶让其末端加上A（一般跑完PCR,直接加少量普通taq,72度继续20-30min,就行了,如果你不放心,可以纯化一下,然后按PCR体系加入taq,dATP,buffer等,72度,30min）,然后和普通PCR产物一样进行TA克隆；2 具体的克隆方法,参考所用T载体的说明书.比如TAKARA的pMD-19T,里面有详细的介绍和注意事项.最重要的就是要注意目的片段和载体间的摩尔比要合适（一般3-8:1）
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不行，除非在3‘端加a 直接在引物中引入酶切位点，pcr产物纯化后酶切连接。pcr产物纯化后连接，再进行转化。如果出问题多半在转化步骤
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