流式细胞术测ros图谱怎么分析_百度知道
流式细胞术测ros图谱怎么分析
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1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔&#47，或把细胞等分成若干份后刺激细胞，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1。Rosup是一种混合物（compound mixture）：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔&#47。4;升，加入适当体积稀释好的DCFH-DA;升，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，浓度为50mg/ml。一、注意事项1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以用FITC的参数设置检测DCF。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。3、参数设置使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。4、荧光酶标仪或流式细胞仪检测、为了您的安全和健康。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。收集细胞后装载探针。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别：5000稀释DCFH-DA，请穿实验服并戴一次性手套操作。二、使用说明1、装载探针对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。37℃细胞培养箱内孵育20分钟，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。对于细胞刺激时间较长（通常为6小时以上）的细胞.、检测对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。原位装载探针;毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计。去除细胞培养液：本方法仅适用于贴壁培养细胞。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔&#47、其它说明阳性对照可以按照1。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高：按照1，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/升。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。2，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。另外：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激ROS的流式检测活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，可以自由穿过细胞膜。按照1，以确认探针的装载情况是否良好。3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA
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【求助】关于DCFH-DA探针检测细胞内ROS实验，急求帮助，非常感谢！
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新人求助，本人最近在做细胞内活性氧ROS检测实验，细胞为HEK-293细胞，采用96孔板，实验分组为control对照组（只加细胞）、损伤组（加细胞，然后用双氧水损伤）、实验组（加细胞，后加样品处理，最后加双氧水损伤）。实验结束时吸弃培养液，加入浓度为10uM的DCFH-DA荧光探针溶液，在37℃细胞培养箱内孵育20分钟，后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。最后用多功能酶标仪检测荧光强度，或用激光共聚焦显微镜观察细胞荧光强度。现主要有以下三个问题，求教有此实验经验的同学和老师，希望能和大家交流下，第一次在丁香园发帖，丁当不多，非常感谢！1、做柱状图时，纵坐标为荧光或相对荧光强度。荧光强度是以对照组的荧光强度为基准来计算吗？看了好多文献，数值范围差的很多。想请教您是如何计算这个数值的？2、按照说明书，最后一步用无血清细胞培养液洗涤细胞三次去除残余荧光探针后，是直接上酶标仪测或者上激光共聚焦显微镜观察。孔板里面一点培养液都不要的话，这样细胞不受影响吗？3、由于HEK-293细胞贴壁能力一般，虽然操作很温柔，但在最后润洗中还是会不可避免的吸掉一小部分细胞，尤其经过损伤的细胞，死细胞都被润洗掉了，这样会导致control组比损伤组的ROS含量还要高，这不符合实验预期结果呀！而且在激光共聚焦显微镜下观察，会发现细胞数量很少！请问大家是怎样处理的呢？有什么固定细胞的方法吗？背景：本人购买的是sigma公司的DCFH-DA荧光探针粉末（2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate），DMSO配成10mM储备液，-20℃保存，实验时稀释1000倍至浓度为10uM使用。DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)是非标记性的氧化敏感的荧光探针，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光以判定细胞内活性氧的水平。
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做过DCFH，谈下个人体会：1、一开始我也是用酶标仪96孔来测的。一点都不准，影响因素太多。2、后改用流式，非常好。一来流式准备可以重悬细胞用离心的办法不会损失太多，二来流式定量很准。比如统一搜集1-3万个最后检测，这样每个组基地线都是一样的。另外流式的结果可以用Flowjo等软件测出其荧光强度值，量化很准确。3、但流式结果毕竟就是几个线图，不是很好看，后来又做了荧光显微镜观察。用的六孔板，如果处理因素很容易让细胞死亡而漂起，那么建议你缩短作用时间。ROS是一个很灵敏的检测项目，很多处理因素作用几小时甚至数十分钟，细胞内的ROS就已经显著表达了。这就是文献上常说的“rapid elevation”.希望有帮助。
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以下言论仅针对酶标仪测ROS，个人经验，希望有用如果造模时间不长，可以单纯的用无酚红培养基（不含胎牛血清），或者直接用PBS悬浮细胞，我的细胞可以坚持大概4~6h，探针用PBS稀释后直接入酶标板，DCFH-DA本身是没有荧光的，进入细胞后变成DCFH，后变成DCF才有荧光，可以不洗去探针，直接上机测，相当于延长孵育时间，那探针孵育时间都是一个范围，找一个适合的时间就可以了另外双氧水造模有一个很大的问题，大剂量双氧水会杀灭细胞，细胞破灭后DCF就在那液体里了，弃去液体后，荧光必然会变弱，若双氧水浓度不同，则存活细胞数量不同，荧光强度就不在同一水平，结果是有问题的。
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对于试剂盒，说明书是一个大概的方法，不同细胞的贴壁性不同，技巧自然不一样，应该多查阅相同细胞，相同试剂盒的文献参考。现本人说一下自己的经验，供楼主采纳：洗涤三次主要目的是洗去未结合的探针，所以后面可以再用PBS或者培养基悬浮，不会影响观察，如果需要固定细胞观察，有专门的固定液，建议楼主与激光共聚焦操作人员联系，看是否需要固定。本人用流式观察ROS，用的是PBS悬浮后观察，结果还行。对于第三个问题，如果细胞贴壁效果差，容易被洗掉，楼主可以在相同条件下洗2次或者1次试一下，动作轻柔一点，放置1-2min后，直接悬浮观察。
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关于丁香园齐墩果酸诱导Jurkat细胞凋亡及对ROS和细胞内Ca2+含量的影响
: 921-929&&&&
齐墩果酸诱导Jurkat细胞凋亡及对ROS和细胞内Ca2+含量的影响
李旸1，廖爱军1，潘梦瑶2，周蕾1，徐淑梅1，刘卓刚1
1.中国医科大学附属盛京医院血液病治疗中心，沈阳110004；2.辽宁省抚顺市公安局监管支队，辽宁抚顺113000
Oleanolic Acid Introduced Apoptosis in Jurkat cells and Influence on the Contents of ROS and Intracellular Ca2+
LI Yang1,LIAO Ai-jun1,PAN Meng-yao2,ZHOU Lei1,XU Shu-mei1,LIU Zhuo-gang1
1.Department of Hematology,Shengjing Hospital,China Medical University,Shenyang 110004,C2.Fushun Police Station Inspection & Administration Detachment,Fushun 113000,China
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