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各位高手解答，感激不尽
1、有的样品扩增曲线没有平台期是怎么回事
2、3个平行样的溶解曲线中怎么有一个有2个峰，其余的都是1个峰，我的引物特异性很好的啊,都是在同一条件下加样的，怎么会有个别的溶解曲线是2个峰呢
3、有个别样品的扩增曲线纵坐标很低，都接近于0了，几乎贴近底线了，请问这是怎么回事
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溶解曲线两个峰是有非特异性条带的扩增。要么是你的模板有污染，要么是你的引物不行。你说自己的引物特异性很好是怎么知道的?如果有人用过这个引物做定量，那么你可以考虑是模板污染。比如你用RNA反转录后的cDNA做模板就可能是RNA抽提中有基因组DNA污染。
另外个别样品的扩增曲线荧光值接近o，可能是你的操作导致的。比如荧光试剂见光，加样时管壁上粘附，加样不准等等。你要逐个寻找原因了。从你的描述看，需要注意实验操作的。
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谢谢你的回复，我说的特异性好是因为我以前跑荧光定量时只有一个单峰，现在跑的绝大部分是单峰，但是不知怎的，有个别样品三个平行样（三个重复）溶解曲线里有两个重复是单峰之外还有点矮矮的小的杂峰，都是一样的重复3次，怎么有1次好2次不太好呢
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应该是操作导致的污染吧，荧光定量PCR灵敏度太高，要小心点。
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谢谢你的回复，以后有问题再向你请教
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新手做荧光定量PCR，要做6个基因，是不是每做个基因就要画一次标准曲线？求解
新手做荧光定量PCR，SYBR Green I 法，要做沙门氏菌6个基因，是不是每做个基因就要画一次标准曲线？还是只用做一个基因的标准曲线？在做标准曲线是，六个基因的质粒用何种缓冲液稀释？稀释梯度做几个比较合适？
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准备构建6个质粒，回来分别做标准曲线了
做标曲是为了给其他DNA定值吗，比如沙门氏菌的基因组，或直接定量沙门氏菌的含量。
做完标准曲线，在荧光定量测定通过未知样品的Ct值，代入标曲就能得知样品中基因组的拷贝数，来确定基因的表达量，我是这么认为的，不知有没有高手系统解释下
相对定量要找内参基因，内参基因该如何选择呢
内参基因一般为持家基因，如Actin、Ubi等，由于我是做植物的，具体你可以查阅相关外文文献。
如果只要知道样品中基因组的拷贝数只要做一个基因就可以了，为什么要做6个基因？
做一个基因相对定量就可以了吧
你好，求个联系方式，也是相对QPCR这块很盲目，求教。全部身家40个金币都送你都行。。QQ
六个基因表达量不同，在原始样品中的拷贝数也就不同
做的绝对定量啊 内参不好找
你能帮我找到做沙门氏菌相对定量用的内参么，16SrRNA？
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请问做实时荧光定量PCR实验时,为什么做标准曲线?
强颜欢笑丶炋v
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1 做标曲才可以算出这对引物的扩增效率（其斜率）,方便用pfaffl方法来进行相对定量（得到的结果相对精确一点）,否则只能默认扩增效率为2,用2^-ddCt(Livak)法来计算2 做标曲才可以绝对定量.
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其他类似问题
绝对定量和相对定量都可以做标准曲线，目的在于用已知浓度样品的量做成的标准曲线来定未知浓度样品的量。
标准曲线是已知量的做了标准曲线可以实现绝对定量
扫描下载二维码& 【求助】第一次做荧光定量PCR，得到的扩增曲线很奇怪
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【求助】第一次做荧光定量PCR，得到的扩增曲线很奇怪
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【求助】第一次做荧光定量PCR，得到的扩增曲线很奇怪
第一次做荧光定量PCR，得到的扩增曲线很奇怪，不知道是什么原因，求指教！还有要是CT值过高是不是应该增加模板的浓度啊？
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我是这样认为的：
你看到那个红色的线了吗，那应该是阙值线，如果你没有手动调整过的话，在阙值线以下的都是背景杂信号，忽上忽下的很正常，后边没有在一定范围内起峰，说明是无产物扩增的，如果你用的SYBR Green I 法，也同时会有溶解曲线分析吧，若那里边也是没有很尖锐的峰出现（我这里是笼统的说法），只能说明你这个扩增是没有产物出现的。而且你图不是很清晰，看不清楚纵轴是什么标示。
问题很多，不能在这一概而就的说明
希望有所帮助，如果有说错地方，请各位高手指点
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非常感谢，但是我的溶解曲线有单一峰，而且特异性非常好啊。那就说明有扩增产物啊。那个阈值通常需要改动么？
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为什么大家把溶解曲线看的这么重要呢，我觉得本末倒置了，若是你的扩增曲线都没有再一定范围内起峰的话，溶解曲线即使是单一峰又有什么用呢？况且你还要看峰的尖锐程度，峰的高低。我就说这么几个例子吧：
1. 以前用某乐的96-microplate，总在77~80度左右有单一小侧峰，考虑引物问题等众多事情后仍旧无解，最后同样实验条件使用某A的8-Strip tube，前边的杂峰消除。
2. 做过NTC，发现三重复都在38Ct时左右起峰，溶解曲线很单一，与内参同温度，但峰最高值是其一半左右，至今仍无解。
所以你只能有扩增才能用溶解来证明是不是扩增正确，而不能没扩增却用溶解来说明有扩增，如果实在不放心，那就那扩增产物跑胶，理论可行，但我没有试过。
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稀释100倍模板再试试，一般是模板量太大了
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模板浓度降低后怎么样？楼主解决这个问题了吗？
我最近也遇到类似的扩增曲线，但我的几个样品中，每次只有一个样品发生这种奇怪的扩增曲线。其他样品的多个基因扩增都很正常。推测是模板中混有影响荧光测定的东西。不知乙醇，异丙醇残余是否有影响。
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个人感觉是没有有效扩增，没有看到指数期和平台期，楼主再稀释一下模版看看吧。细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
& 问题详情
要做乳酸杆菌及肠球菌的荧光定量，是否需要标准菌株来做参照并制作标准曲线，一定要做绝对定量吗？另外引物是不是要做检测呢？
求高人解答，多谢
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谁做这个实验？
nan,感觉一窍不通
操作严格按照实验步骤进行，保证提取物的纯度。
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