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求助：关于磷酸化抗体的问题
本人马上要作蛋白的磷酸化检测，有几个问题不明白，求助高人：1、是用单独的磷酸化抗体好还是针对具体蛋白的磷酸化抗体好？2、具体蛋白的磷酸化抗体单抗还是多抗好？3、具体蛋白的磷酸化抗体和非磷酸化抗体电泳应该跑在同一个位置吗1. 早期的文献一般都采用单独的磷酸化抗体，但是现在的抗体种类多了，最好还是用针对具体蛋白的磷酸化抗体，因为专一性更强而且方便。2. 一般来说单抗有更强的专一性，但是做western的时候单抗和多抗没什么区别，不用考虑。3. 磷酸化与否对蛋白分子量几乎没有影响，因此SDS-PAGE的条带位置相同。十分感谢版主十分精彩
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【求助】关于磷酸化蛋白做western
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这个帖子发布于3年零92天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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要做两个指标，一个是磷酸化的，一个是非磷酸化的，都是同一个目的，做出来的条带非磷酸化的很细，我想问问一般非磷酸化的蛋白表达量和磷酸化的有什么关系呢，谁多谁少，我的非磷酸化的很细是因为表达量低还是我做的问题的呢
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jing1234jing 要做两个指标，一个是磷酸化的，一个是非磷酸化的，都是同一个目的，做出来的条带非磷酸化的很细，我想问问一般非磷酸化的蛋白表达量和磷酸化的有什么关系呢，谁多谁少，我的非磷酸化的很细是因为表达量低还是我做的问题的呢 加大上样量？还有，因为曝光时间不同，不能根据条带大小来比较非磷酸化的蛋白表达量和磷酸化之间的关系吧。看到有人用两者的光密度来比较，感觉有点扯了。
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一般我们做的不是磷酸化与非磷酸化。我们是压磷酸化 与 磷酸化加非磷酸化总蛋白
算磷酸化占总的的比例。你不妨做个总的试试，用总的抗体。还有，被激活的状态是磷酸化的还是非磷酸化的？
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卡卡西23 一般我们做的不是磷酸化与非磷酸化。我们是压磷酸化 与 磷酸化加非磷酸化总蛋白
算磷酸化占总的的比例。你不妨做个总的试试，用总的抗体。还有，被激活的状态是磷酸化的还是非磷酸化的？ 如果是分开压的（一般也是分开跑的），这样的比较光密度本身来说，没有太多意义吧。因为如果在曝光时用了不同的模式，而有些模式是非线性的，这样使得样本之间，各次实验之间的结果，很难进行比较吧。个人感觉，一般做P化，总要是做个total的。这样做主要是来看，在信号通路激活下，某种蛋白质的活化或抑制以特定位点的P化形式随时间而变化，而这种变化是独立于上样量和这种蛋白的降解而变化的。而测total的，就是为了证明上样量的一致，同时也为了证明说蛋白质没有发生降解。因为很多信号中检测的活化蛋白质的P化加强或是减少，不是因为活化水平，而是总体蛋白质本身的减少或是增加。
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你们说的总的是什么呀？我是买了两个抗体，一个是磷酸化的，另一个不带p，应该就是你们说的总的吧。磷酸化是被激活的状态，现在我的问题是条带很细，不知道为什么呢，我加大了上样量或者加大抗体浓度都没什么变化呢还有你们说的证明上样量一致，我不太明白，我每次都做内参的呀，不就是标准吗
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不带p就是总的。一般要有内标，说明上样量一致。压总的，看是磷酸化上调是确实通路被激活了，还是比例不变，总的转录翻译增加了
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恩。但是我做的条带很弱很细，总蛋白也是，我加大上样量或者抗体浓度还是一样，还可能是什么原因呢
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jing1234jing 要做两个指标，一个是磷酸化的，一个是非磷酸化的，都是同一个目的，做出来的条带非磷酸化的很细，我想问问一般非磷酸化的蛋白表达量和磷酸化的有什么关系呢，谁多谁少，我的非磷酸化的很细是因为表达量低还是我做的问题的呢1）一般来说，加大上样量条带会增粗一点，延迟曝光时间信号也应该更强一些。2）总蛋白用非磷酸化抗体检测，应该比磷酸化蛋白更多。3）看楼主的帖，感觉上是非磷酸化抗体的质量有点问题，所以检测到的信号弱。前提：楼主的磷酸化抗体检测信号好的，条带正常的。
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xuzilin 1）一般来说，加大上样量条带会增粗一点，延迟曝光时间信号也应该更强一些。2）总蛋白用非磷酸化抗体检测，应该比磷酸化蛋白更多。3）看楼主的帖，感觉上是非磷酸化抗体的质量有点问题，所以检测到的信号弱。前提：楼主的磷酸化抗体检测信号好的，条带正常的。 磷酸化和非磷酸化条带都很弱，只有内参还好
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jing1234jing
磷酸化和非磷酸化条带都很弱，只有内参还好上张图吧，看看磷酸化，非磷酸化和内参条带。
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【求助】有没有不用western去检测p-Smad2/3的方法
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由于细胞少，蛋白提取困难。请问有没有检测p-Smad2/3的其他方法？流式可以吗
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elisa不知道行不行
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森林志士 elisa不知道行不行 我读书少……ELISA估计不行吧？待测的是细胞内p-Smad2/3
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流式更不行。可以考虑免疫组化或者免疫荧光。
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火车二场 流式更不行。可以考虑免疫组化或者免疫荧光。 好不容易查到了一篇关于流式检测p-smad的文献，可惜没有写步骤和抗体品牌
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已经查到相关流式抗体，问题已关闭。谢谢
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