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有哪位高手能详细指导一下用transwell板做细胞趋化实验的具体方法和步骤吗？
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半导体 能带 p型半导体 n型 半导体 晶体二极管、三极管 【半导体】 导电性能介于导体绝缘体间非离性导电物质室温其电阻率约10-3~l09欧姆&厘米般固体例锗(Ge)、硅(Si)及些化合物半导体碲化铅(PbTe)、砷化铟(InAs)、硫化铅(PbS)、碳化硅(SiC)等与金属材料同半导体杂质含量外界条件改变(温度变化、受光照射等)都使半导体导电性能发显著变化纯度高内部结构完整半导体极低温度几乎导电接近绝缘体随着温度升高半导体电阻迅速减含少量杂质内部结构完整半导体通n型p型两类半导体p-n结及半导体同某些金属相接触边界层都具单向导电或光照产电势差特性利用些特性制各种器件半导体二极管、三极管集电路等半导体所具介于导体绝缘体间导电性原结构比较特殊即其外层电既象导体容易挣脱其原核束缚象绝缘体电原核紧紧束缚着决定导电性介于两者间 【能带】 研究固体物理种理论虽所固体都包含量电具电导电性能则基本观察任何电导电性基本事实曾期解释能带理论基础首导体、绝缘体半导体区提理论说明能带论发展初期重物理往往形象化用水平横线表示电能量值能量越线位置越高定能量范围内许能级(彼相隔近)形条带称能带各种晶体能带数目及其宽度等均相同相邻两能带间能量范围称能隙或禁带晶体电能具种能量完全电占据能带称满带满带电导电;没电占据带称空带;部占据称导带导带电才能导电价电所占据能带称价带能量比价带低各能带般都满带价带满带导带;金属导带所金属能导电绝缘体半导体满带所能导电半导体容易其杂质或受外界影响(光照、加热等)使价带电数减少或使空带现些电导带能导电 【本征半导体】 含杂质且结构非完整半导体单晶其参与导电电空穴数目相等温度极低其电阻率极难导电;随着温度升高电阻率急剧减硅、锗等半导体材料制单晶体其原排列由杂乱章状态变非整齐状态其原间距离都相等约2.35&10-4微米每原外层4电仅受自身原核束缚且与周围相邻4原发联系每两相邻原间都共电电任何电面围绕自身原核运另面现相邻原所属轨道组合叫做共价键结构硅、锗共价键结构特点外层共电所受束缚力并象绝缘体紧定温度由于热运其少数电能挣脱束缚自由电形电载流共电挣脱束缚自由电同留空位空位附近共电容易进行填补形共电运种运论效现象都象带电荷空位移区别于自由电运种运叫做空穴运空位叫做空穴由见空穴种载流半导体处于外加电压作用通电流看作由自由电定向移所形电流另部带电空穴定向移所半导体仅电载流空穴载流半导体导电特点种纯单晶半导体虽种空穴载流载流总数离实际应用要求具良导电能力要求看相差远所种本征半导体实际用处 【杂质半导体】纯单晶本征半导体掺杂些用杂质使其导电特性改善其导电性能取决于杂质类型含量半导体即称杂质半导体数半导体都种类型半导体材料提纯再用扩散或用离注入掺入适杂质制n型半导体或p型半导体利用同类型杂质半导体制整流器半导体二极管、半导体三极管集电路等重要部件由看杂质半导体才用 【n型半导体】n表示负电意思类半导体参与导电主要带负电电些电自半导体施主杂质所谓施主杂质掺入杂质能够提供导电电改变半导体导电性能例半导体锗硅五价元素砷、锑、磷等原都施主杂质某半导体杂质总量施主杂质数量占数则种半导体n型半导体硅单晶掺入五价元素砷、磷则硅原砷、磷原组共价键磷外层五电四电组共价键电受原核束缚容易自由电所种半导体电载流数目主要靠电导电叫做电半导体简称n型半导体 【p型半导体】p表示电意思种半导体参与导电主要带电空穴些空穴自于半导体受主杂质所谓受主杂质掺入杂质能够接受半导体价电产同数量空穴改变半导体导电性能例半导体锗硅三价元素硼、铟、镓等原都受主某半导体杂质总量受主杂质数量占数则半导体p型半导体单晶硅掺入三价硼原则硼原与硅原组共价键由于硼原数目比硅原要少整晶体结构基本变某些位置硅原硼原所代替硼三价元素外层三价电所与硅原组共价键自形空穴掺入硼杂质每原都能提供空穴使硅单晶空穴载流数目增加种半导体内几乎没自由电主要靠空穴导电所叫做空穴半导体简称p型半导体 【p-n结】块半导体掺入施主杂质使其部n型半导体其余部掺入受主杂质p型半导体p型半导体n型半导体两区域共处体两区域间交界层p-n结p-n结薄结电空穴都少靠近n型边带电荷离靠近p型边带负电荷离p型区空穴浓度n型区电浓度所结合起交界便要发电空穴扩散运由于p区量移空穴n区几乎没空穴空穴要由p区向n区扩散同n区量自由电p区几乎没电所电要由n区向p区扩散随着扩散进行p区空穴减少现层带负电粒区;n区电减少现层带电粒区结p-n结边界附近形空间电荷区p型区边带负电荷离n型区边带电荷离结形强局部电场向由n区指向p区结加向电压(即p区加电源极n区加电源负极)电场减弱n区电p区空穴都容易通电流较;外加电压相反则电场增强原n区少数空穴p区少数电能够通电流p-n结具整流作用具p-n结半导体受光照其电空穴数目增结局部电场作用p区电移n区n区空穴移p区结两端电荷积累形电势差现象称p-n结光伏特效应由于些特性用p-n结制半导体二极管光电池等器件p-n结加反向电压(n区加电源极p区加电源负极)电压定范围内p-n结几乎通电流加p-n结反向电压越某数值发电流突增现象p-n结击穿p-n结击穿便失其单向导电性能结并定损坏反向电压降低性能恢复根据其内物理程p-n结击穿雪崩击穿隧道击穿两种由于p-n结具种特性面用制造半导体二极管使工作定电压范围内作整流器等;另面击穿并损坏用制造稳压管或关管等器件 【晶体二极管】亦称半导体二极管种由半导体材料制具单向导电特性两极器件早期半导体二极管用金属丝尖端触半导体晶片制称点接触二极管通较高频率范围内作检波、混频器用目前数晶体二极管都面结型由半导体晶片形p-n结组或由金属同半导体接触组用于整流检波、混频、关稳压等除般用途二极管外些用于特殊用途利用特殊原理制二极管例:(1)肖特基二极管(称金属-半导体二极管):用某些金属半导体相接触交界面处便形势垒区(通称表面势垒或肖特基势垒)产整流检波作用种二极管起导电作用热运能量比较些载流所叫热载流二极管种二极管比p-n结二极管更高使用频率关速度噪声比较低工作电流较反向耐压较低目前主要用作微波检波器混频器已雷达接收机代替点接触二极管;(2)隧道二极管:种具负阻特性半导体二极管目前主要用掺杂浓度较高锗或砷化镓制其电流电压间变化关系与般半导体二极管同某极加电压通管电流先随电压增加快变电压达某值忽变定值急剧变;所加电压与前相反电流则随电压增加急剧变种变化关系能用量力隧道效应加说明故称隧道二极管具关、振荡、放等作用应用电计算机微波技术;(3)变容二极管;利用p-n结电容特性实现放、倍频、调谐等作用种二极管由于结电容随外加电压显著变化所称变容二极管制造变容二极管所用半导体材料主要用硅砷化镓作微波放优点具低噪声;(4)雪崩二极管:亦称碰撞雪崩渡越间二极管种外加电压作用产超高频振荡半导体二极管工作原理:利用p-n结雪崩击穿半导体注入载流些载流渡越晶片流向外电路由于渡越需要定间使电流相于电压现间延迟适控制渡越间电流电压关系现负阻效应能够产振荡雪崩二极管主要用微波领域作振荡源;(5)发光二极管:种外加向电压作用发光二极管发光原理:向电压作用p-n结注入非平衡载流些载流复合余能量转化光形式发射发光二极管经用作电设备指示灯、数码管等显示元件用于光通讯优点工作电压低耗电量体积、寿命制造发光二极管所用半导体材料主要磷砷化镓、碳化硅等 【晶体三极管】 亦称半导体三极管或简称晶体管种具三电极能起放、振荡或关等作用半导体器件按工作原理同结型晶体管场效应晶体管结型晶体管半导体单晶制备两p-n结组p-n-p(或n-p-n)结构间n型(或p型)区叫基区边两区域别叫发射区集电区三部都电极与外电路联接别称发射极字母e表示、基极字母b表示集电极字母c表示电线路用符号代表p-n-p型n-p-n型晶体管图3-17所示晶体管用作放器发射极基极间输入电信号其电流控制集电极基极(或集电极发射极)间电流负载获放电信号同电管相比晶体管具体积、重量轻、耐震、寿命耗电优点受温度影响较目前用晶体管主要用锗或硅晶体制场效应晶体管利用输入电压电场作用控制输电流种半导体器件场效应晶体管结型场效应晶体管金属-氧化物-半导体场效应晶体管两类金属-氧化物-半导体场效应晶体管简称MOS晶体管结构图3-18所示其1栅极;2绝缘层;3沟道;4源;5漏制作程n型(或p型)晶片扩散两p型(或n型)区别称源漏面引源极(接电压端)漏极(接负端)源漏间沟道区面隔层氧化层(或其绝缘层)制作层金属电极称栅极场效应晶体管工作栅极电压变化引起沟道导电性能变化说栅极电压变化控制源漏间电流变化场效应晶体管特点输入阻抗高抗辐射能力强 【集电路】 种微型电器件或部件采用定工艺电路所需要晶体管、电阻、电容电等制作块或几块晶片或陶瓷基片再用适进行互连封装管壳内具所需功能微型电路结构集电路已打破传统电路设计概念集电路晶体管、二极管、电阻、电容、电等各元件结构已组整体整电路体积缩且引线焊接点数目减少使电元件向着微型化低功耗高靠性面迈进步用集电路装配电设备其装配密度比用立式晶体管等元器件组装电设备提高几十倍百倍设备稳定工作间提高集电路电计算机、通讯设备、导弹、雷达、造卫星各种遥控、遥测设备占据非重要位根据制造工艺同目前集电路主要半导体集电路、薄膜集电路、厚膜集电路混合集电路等几类根据性能用途同数字集电路、线性集电路微波集电路等近集电路发展极迅速早期半导体集电路集度每晶片几十元件目前集度已高达每片包含几千甚至万元件习惯由百门电路或千晶体管集块晶片并互连具系统或系统功能电路称规模集电路 【半导体集电路】 亦称固体电路或单块集电路块半导体单晶片(般硅片)用氧化、扩散或离注入光刻、蒸发等工艺做晶体管、二极管、电阻电容等元件并用某种隔离技术使电性能互相绝缘晶片表面用金属薄膜使关元件按需要互相连接封装管壳构完整电路半导体集电路制造比较简便本低廉、靠性高、体积比较目前集电路产应用种。
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你可能喜欢高迁移率族蛋白1（HMGB1）对气道上皮屏障功能失调的机制研究--《南方医科大学》2014年博士论文
高迁移率族蛋白1（HMGB1）对气道上皮屏障功能失调的机制研究
【摘要】：支气管哮喘(简称哮喘)是多种细胞(如嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组份(cellular elements)参与的慢性气道炎症性疾病,伴有气道高反应性、气道阻塞和气道重塑。哮喘患病率在全球范围内有逐年增加的趋势,目前全球至少有3亿以上,我国有近3000万哮喘患者,哮喘已成为仅次于癌症的世界第2大致死和致残疾病,严重危害人类健康。哮喘是一种基因和环境因素相互作用导致的复杂疾病,即使在今天生物-环境-心理的疾病评估模式中,其发病、发展等环节仍不清楚。因此探讨哮喘发病机制、寻找新的治疗乃至预防靶点仍然是哮喘研究的重大课题。
随着研究的不断拓展和深入,关于哮喘发病的假说不断增多,其中气道上皮结构、功能受损和免疫作用异常成为研究热点,气道上皮在哮喘发病中的地位被大大提升。目前认为气道上皮细胞是哮喘发病关键环节。气道上皮正常情况处于免疫耐受状态,是机体抵抗气道内外环境有害刺激的第一道屏障。上皮细胞维持正常结构及功能,需要相邻细胞通过不同连接蛋白及信号分子形成紧密连接、粘附连接及桥粒连接,并通过连接蛋白协调表达和相互作用,保持上皮细胞结构的完整及极性,调节物质转运。紧密连接位于气道上皮顶端,由occludin及claudin蛋白家族构成,主要负责调控旁细胞通透性以及维持上皮极性。紧靠紧密连接下方是粘附连接,是由Ca2+依赖的E-cadherin以及与E-cadherin相结合的多种连环蛋白(如a、p连环蛋白)和肌动蛋白细胞骨架相互作用形成的,E-cadherin具有负性免疫调控作用,与上皮免疫耐受有关。般认为,粘附连接是紧密连接形成的前提,它的形成活化了细胞内多种有活性的蛋白质分子,最终导致紧密连接相关蛋白聚集于相邻细胞接触部位,形成一个完整的顶端连接复合体。
气道上皮细胞不但参与气道上皮物理屏障的形成,而且通过分泌多种活性物质发挥免疫调节作用。气道上皮细胞表面及胞浆中存在模式识别受体(PRRs),主要为Toll样受体(TLRs)和晚期糖基化终产物受体(RAGE)。模式识别受体(PRRs)被激活后,经过一系列衔接蛋白的信号转导后,激活NF-κB或IRF-3/7等转录调节因子,调节相关效应分子的基因转录,最终表现为抗菌蛋白、干扰素、促炎因子、趋化因子的产生和释放,参与哮喘慢性气道炎症的启动和维持。
当哮喘发病时,气道上皮及固有免疫细胞可释放以高迁移率族蛋白1(HMGB1)为代表的DAMP(损伤相关分子模式)分子,进而启动气道固有免疫及获得性免疫,打破气道上皮免疫耐受,释放更多炎症介质,炎症介质相互作用于气道上皮,形成复杂细胞因子调节网络,引发和促进哮喘发生。因此,炎症介质致气道上皮功能失调是促发和维持哮喘发病的重要机制之一。
高迁移率族蛋白(HMGB1)是真核细胞大量存在的一种染色体结合蛋白,广泛分布于淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织中,其基本功能参与调控DNA重组、修复、复制和基因转录。正常情况下肺组织HMGB1主要位于结构细胞核中,处于低表达水平,但对维持肺及气道的正常生理功能具有重要作用。近年来在动物模型和人类疾病的研究上发现：HMGB1可释放到胞外,发挥促炎因子的功能。HMGB1可以从激活的免疫细胞如单核巨噬细胞中释放出来,也能够从损伤和坏死的细胞被动释放出来。HMGB1可以诱导许多炎症因子如TNF-α,IL-1, IL-6和IL-8等的释放,也能激活人内皮细胞,导致其粘附分子的表达上调。因此,HMGB1作为一种重要上游免疫调节因子,当细胞损伤后其释放出细胞外,会激发免疫系统产生炎症反应。
HMGB1是一种重要的炎症介质,与脓毒症、免疫性疾病、恶性肿瘤等疾病相关,近期研究显示HMGB1可能参与多个呼吸系统疾病的病理生理过程,在哮喘等慢性炎症气道疾病的地位也越来越受到人们的重视。
当气道上皮细胞受到过敏原、微生物等有害因素攻击而受损时,根据Matzinger的危险模式理论,可产生某些内源性危险信号分子,也就是DAMPs分子,又称警报素(alarmin)。HMGB1是DAMPs家族的重要组成成分之一。气道上皮受到有害因素攻击后,HMGB1可由胞核释放到胞外,与Toll样受体(TLRs)、晚期糖基化终产物受体(RAGE)等膜受体结合,引起前炎症因子IL-1释放,刺激机体固有免疫系统产生防御反应及组织修复。释放到胞外的HMGB1其本身也能够诱导单核／巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等获得性免疫细胞合成并分泌TNF-α、INF-γ及IL-1β等炎症介质,这些炎症介质又能够加强HMGB1的分泌效应,从而形成一个复杂的细胞因子分泌调节网络。这说明以HMGB1为代表的DAMPs分子在气道炎症过程致敏阶段固有免疫向获得性免疫转化中起重要作用,是调控TNF-α、INF-y及IL-1β等炎症介质的关键上游分子。
本实验室早期,在卵蛋白(OVA)诱导的小鼠哮喘模型观察到肺组织及肺泡灌洗液HMGB1表达显著升高。我们进一步研究也发现,哮喘患者诱导痰及血浆中HMGB1水平显著升高,且诱导痰HMGB1水平与肺功能指标显著负相关,这提示HMGB1参与哮喘气道炎症。为进一步评价HMGB1在哮喘发病中作用,韩国学者在OVA诱导的小鼠哮喘模型阻断HMGB1活性,发现能够显著降低气道高反应性,改善气道局部炎症反应及病理改变。2013年最新研究表明HMGB1受体RAGE缺失的小鼠,显著减少屋尘螨(HDM)致哮喘Th2型细胞因子表达,气道嗜酸性粒细胞浸润以及血浆IgE水平,这一发现使得HMGB1-RAGE受体轴在哮喘发病的重要作用愈发受人关注。据此,我们认为DAMPs分子-HMGB1是参与哮喘发病的重要炎症介质,可能是一种新的哮喘慢性气道炎症调控机制。
我们已证实,哮喘患者诱导痰及血清中HMGB1水平显著上调,且与疾病严重程度相关,提示HMGB1是参与哮喘发生、发展过程重要炎症介质。目前,关于哮喘气道上皮功能失调的研究主要集中在TNF-α、IFN-γ及IL-1β等下游炎症介质的致伤作用,而对于调控TNF-α、IFN-γ及IL-1β的关键上游DAMPs分子-HMGB1对气道上皮功能的影响及调节机制研究相对较少,有必要深入的研究。
1.探讨HMGB1致气道上皮屏障功能损伤作用及可能参与的信号转导调节机制；
2.进一步明确HMGB1协同IL-1β是否对气道上皮屏障功能损伤有促进作用；
1.培养气道上皮细胞株16-HBE及A-549。
2.MTT比色法检测HMGB1对气道上皮细胞株16-HBE及A-549细胞活力的影响：选取不同浓度(100、200、400和800ng/ml) HMGB1与16-HBE及A-549细胞共培养,MTT比色法检测细胞活力。
3.观察HMGB1对气道上皮屏障功能的损伤作用-剂量效应实验。不同浓度(100.200、400ng/ml) HMGB1刺激16-HBE及A-549气道上皮细胞株24h,观察其对气道上皮屏障功能损伤作用,屏障功能观察指标主要有：
①单层气道上皮细胞通透性检测：Transwell技术检测单层16-HBE及A-549细胞跨膜电阻值(TER)以及FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)的改变。
②Western bolt方法检测紧密连接蛋白(occludin和claudin-2)及粘附连接蛋白(E-cadherin和β-catenin)表达情况；
③免疫荧光化学方法检测紧密连接蛋白(occludin和claudin-2)或粘附连接蛋白(E-cadherin和β-catenin)分布情况；
4.观察HMGB1对气道上皮屏障功能的损伤作用-时间效应实验。400ng/ml HMGB1在不同时间点(0、1、3、6、12、24和48h)刺激16-HBE和A-549细胞,观察其对气道上皮屏障功能的损伤作用,屏障功能观察指标参照方法3；
5.观察HMGB1协同IL-1β对气道上皮屏障功能损伤的作用。实验分为4组：①对照组；②单独IIMGB1(100ng/ml)刺激组；③单独IL-1β (2.5ng/ml)刺激组；④HMGB1(100ng/ml)/IL-1β (2.5ng/ml)联合刺激组。按上述分组处理16-HBE细胞24h,观察其对气道上皮屏障功能损伤作用,屏障功能观察指标参照方法3；
6.评价连接蛋白occludin在HMGB1致气道上皮屏障功能损伤中的作用：构建含野生型全长occludin基因质粒,扩增、提取并鉴定质粒。应用碱裂解法提取目的质粒,采用琼脂凝胶电泳和DNA测序鉴定目的基因,并测定滴度。应用阳离子脂质体法分别将occludin基因转染气道上皮细胞并过表occludin蛋白,通过倒置荧光显微镜观察GFP情况以了解转染效率,再应用QPCR和Western bolt技术确定有效的基因转染；转染16-HBE细胞。
①检测过表达occludin蛋白对跨膜电阻(TER)、FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)以及其他连接蛋白表达的影响；
②评价连接蛋白occludin在HMGB1致气道上皮屏障功能损伤中的作用：HMGB1(400ng/ml)分别刺激过表达和正常表达occludin蛋白的16-HBE细胞；实验分为4组：正常表达组(未转染occlduin基因正常细胞),过表达组(转染并过表达occlduin蛋白的16-HBE细胞),正常表达+HMGB1刺激组(HMGB1刺激正常表达occludin蛋白的16-HBE细胞24h)和过表达+HMGB1刺激组(HMGB1刺激过表达occludin蛋白的16-HBE细胞24h)。按照分组给予相应处理后,观察和比较跨膜电阻值(TER)及FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)的变化。7.探讨参与HMGB1致气道上皮屏障功能损伤作用的信号通路。观察HMGB1致气道上皮屏障功能损伤过程中HMGB1受体(TLR2、TLR4及RAGE)蛋白表达水平变化,以及其下游MAPK信号通路活化情况。在上述实验基础上,选择相应抗-膜受体单克隆抗体和MAPK信号通路阻断剂,检测其对跨膜电阻(TER)、FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)及连接蛋白的影响,发现参与HMGB1致气道上皮屏障损伤的可能信号通路途径。
1、与对照组比较,100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml HMGB1对细胞活力无明显影响(P值均0.05,n=6),而浓度达到800ng/ml的HMGB1刺激细胞明显降低细胞活力(P值均0.001,n=6)。
2, HMGB1对气道上皮细胞株16HBE和A549屏障功能的影响：HMGB1可导致16HBE和A549单层细胞跨膜电阻值(TER)显著下降和FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)显著增加,跨膜电阻值(TER)和FITC右旋糖苷(FITC-DX)通透性改变呈时间剂量依赖效应。与对照组比较,分别给予100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml HMGB1刺激16HBE或A549细胞,均可导致跨膜电阻值(TER)下降和FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加,其中400ng/ml HMGB1引起改变最为显著(P0.001)。在400ng/ml HMGB1刺激A549细胞6h或者16HBE细胞12h,即可观察到跨膜电阻值(TER)下降,呈时间依赖关系(A549细胞：F=80.46,P0.001;16HBE细胞：F=49.62,P0.001)。与对照组比较,400ng/ml HMGB1刺激细胞12h、24h、48h均可导致FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加(P0.001),且呈时间依赖关系。与16HBE细胞比较,HMGB1刺激A549细胞对跨膜电阻值(TER)和FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)的改变更加显著。
3、HMGB1对气道上皮细胞株16HBE和A549连接蛋白表达及分布的影响：
①A549细胞：400ng/ml HMGB1刺激细胞12h后,紧密连接蛋白occludin和claudin-2表达水平显著减少；而刺激细胞48h后粘附连接蛋白E-cadherin和β-catenin表达水平才显著减少；刺激细胞48h对连接蛋白表达的影响最明显。
②16HBE细胞:400ng/ml HMGB1刺激细胞24h时,紧密连接蛋白occludin和claudin-2表达水平显著减少,刺激细胞48h时蛋白水平进一步减少；而粘附连接蛋白E-cadherin和β-catenin表达水平无明显变化。但免疫荧光定位显示HMGB1可促进E-cadherin蛋白由胞膜向胞浆移位并破坏β-catenin细胞膜结构稳定性。
4、紧密连接蛋白occludin参与HMGB1致气道上皮屏障功能损伤作用：与正常表达occludin蛋白的16HBE细胞比较,过表达occludin蛋白导致16HBE细胞的跨膜电阻值(TER)增加、FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)减少,有统计学差异(P0.001),但过表达occludin蛋白对连接蛋白E-cadherin、β-catenin和claudin-2的表达水平无显著影响；16HBE细胞过表达occludin蛋白可以显著抑制HMGB1导致的气道上皮屏障功能损伤[跨膜电阻值(TER)降低和对FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加],与HMB1刺激正常的16HBE细胞引起屏障功能损伤相比较,有统计学差异(P0.001,n=5)。
5、HMGB1协同IL-1β促进气道上皮屏障功能损伤作用的结果：
①与对照组比较,单独HMGB1(100ng/ml)刺激16HBE细胞24h,跨膜电阻值(TER)无明显改变(P=0.091),但可增加FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)(P0.001)。与对照组及单独HMGB1(100ng/ml)刺激比较,HMGB1(100ng/ml)协同IL-1β(2.5ng/ml)可显著降低跨膜电阻值(TER)(P=0.002和P=0.04),并显著增加FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)(P0.001);
②对连接蛋白表达及分布的影响：单独HMGB1或IL-1β刺激对连接蛋白表达及分布无影响,HMGB1协同IL-1β显著减少occludin及claudin-2蛋白的表达水平(P=0.004和P=0.001)；免疫荧光定位结果显示HMGB1可促进E-cadherin蛋白由胞膜向胞浆移位,并破坏β-catenin细胞膜结构稳定性。
6、RAGE/ERK信号通路参与HMGB1致气道上皮屏障损伤及连接蛋白破坏：
①Western bolt结果显示：HMGB1可显著增加16HBE细胞RAGE蛋白表达水平,1h开始明显增加,24减少至正常水平,而对TLR2和TLR4蛋白表达水平无影响；抗RAGE单克隆抗体预处理16HBE细胞1h,可部分抑制HMGB1引起跨膜电阻值(TER)下降及FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加(P=0.001和P=0.002)；
②HMGB1可引起16HBE细胞MAPK信号通路活化,分别在HMGB1刺激后6,7,5h可观察到ERK、PI3K/akt及JN磷酸化水平明显增加；使用ERK通路抑制剂(U0126)后,可以部分抑制HMGB1引起跨膜电阻值(TER)下降及FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)增加,而使用PI3K/akt和JNK信号通路抑制剂(LY294002和SP600125)并未观察到类似效应；
③抗RAGE单克隆抗体能抑制HMGB1引起ERK磷酸化；
④使用ERK通路抑制剂(U0126)后能减少HMGB1引起16HBE细胞occludin及claudin-2蛋白的破坏,并抑制E-cadherin蛋白由胞膜向胞浆移位及β-catenin细胞膜结构的破坏。
1、HMGB1可导致气道上皮细胞屏障功能损伤,主要表现为跨膜电阻值(TER)显著下降和FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)显著增加,这种损伤作用呈现为时间-剂量依赖效应；HMGB1协同IL-1p可以促进对气道上皮屏障功能损伤
2、在HMGB1引起气道上皮细胞屏障功能损伤同时,减少紧密蛋白occludin及claudin-2蛋白表达水平,其中紧密蛋白occludin在HMGB1引起气道上皮细胞屏障功能损伤中发挥重要作用。此外HMGB1还可以促进粘附连接蛋白E-cadherin由胞膜向胞浆移位及破坏β-catenin细胞膜结构稳定性。
3、HMGB1可能通过RAGE/ERK信号通路参与气道上皮细胞屏障功能损伤,连接蛋白表达及分布异常；
【学位授予单位】：南方医科大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：R562.25
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