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绿色环保型病理制片技术的探讨.pdf
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绿色环保型病理制片技术的探讨席越(北京积水潭医院病理科) 目前,我们技术领域面临的是一个很恶劣的工作环境,虽然大部分的实验室都采取了一定的措施,改善通风环境,但是只要我们仍在使用那些有毒试剂(甲醛、二甲苯等),毒害就不会停止,而目前的情况并不乐观,即使是大型的三甲医院,也仍还有很多实验室在使用这些有毒化学试剂,我们认为在今天这个非常重视环境及身体健康的社会,在各种高科技产品不断问世的年代,我们完全可以摆脱受毒害的状况, 现在国外基本都已采用环保型的替代品用于病理制片程序中,我们经过长时间(年)的摸索也成功的采用了绿色环保型的制片程序,解决了有毒化学药品对工作人员的毒害问题,而这一制片程序的效果不但很好,而且在某些方面还超出了我们以前制片程序的效果,在这里我们愿与广大病理技术同仁共同探讨和分享我们的新方法,以对改变我们的工作环境及身心健康起到抛砖引玉的作用。材料与方法。一、材料 1.2004年.2011年全部病理活检标本30000例 2.环保型病理制片程序中的有毒化学品的替代物(1)甲醛替代物:FineFIX (2)二甲苯替代物:Waxln无毒型组织透明剂、WaxOut无毒性脱蜡剂、新型组织脱蜡剂(C.D二甲苯替代物)、UTC切片透明剂。(3)超净封片胶(U仃aI【in) 二、方法甲醛、二甲苯的替代物,即FineFIX、Waxln、WaxOut、C.D脱蜡剂、UltraKitt封片胶,我们已在病理制片全程使用,从而使整个病理制片过程彻底剔除甲醛、二甲苯的使用,真正’jjI地病理制片过程的无毒作业,从而真正建立起了一个绿色环保型的病理制片实验室。甲醛替代物FineFIX主要用于组织自动脱水机上用以替代甲醛固定液的AF液;而Waxln主要替代二甲苯用于自动脱水机的组织透明;WaxOut主要替代二甲苯用于自动脱水机的试剂槽清洗;C.D新型脱蜡剂主要替代二甲苯作为自动染色机的切片脱蜡剂使用;UltraKitt主要替代DPX(--甲苯溶解)作为切片封胶使用。脱水机绿色环保脱水程序自动染色机绿色环保染色程序应用。经过多年的实际应用,我们在完全用甲醛、二甲苯替代品应用于以上程序后,取得了十分理想的制片效果,从而证明以上替代物完全町以取代甲醛、二甲苯而成为病理组织制片的理想试剂,相对于甲醛、二 239 甲苯不仅处理效果完美,更可以使我们的病理工作人员完全摆脱甲醛、二甲苯的毒害,使我们的工作环境真正达到绿色标准。一、FineFIX环保型固定剂的应用: 1.FineFIX是一种不含福尔马林的水溶性浓缩液,用乙醇稀释后的配方已获专利,并克服了以往纯酒精固定液或乙醇类固定液所存在的明显的组织收缩、细胞空泡以及核固缩等缺陷,FineFIX能够相对有效地保存组织抗原、维护良好的细胞核和胞浆形态学结构,同时能保护细胞膜的完整性。FineFIX处理组织时间短,因其在固定过程中就较早开始脱水及去脂;它非常适用于后固定,快速去除含脂较多组织中的脂肪,经FineFIX处理后的组织,在形态学上可保证很高的质量,不会因切片质量而影响诊断,与传统的甲醛固定相比,FineFIX固定的组织也几乎不产生收缩和空泡及核固缩。经过实际应用,我们认为FineFIX 完全可以适用于病理诊断所需的常规HE染色、免疫组化标记及组织化学染色及特殊染色;采用FineFIX 固定可使DNA及RNA得到极佳的保存,有利于展开分子生物学研究。 2.FineFIX无毒性,其在空气中的弥散值远远大于甲醛,由于其在空气中的弥散率低,故更加突出了 FineFIX在维护实验室人员身体健康的优越性。 3.FineFIX环保处理不需甲醛中和剂进行废液处理,回收容易;以乙醇成分为主的FineFIX,可依据乙醇废液处理程序处理废液;并且FineFIX在贮存及运输中可在极度低温环境下贮存及装运(在--50度的极低温条件下仍然不会凝结)。 4.FineFIX固定剂在免疫组化中的应用修复抗原决定簇(Epitope Retrieval,ER),目前,对经福尔马林固定、石蜡包埋的组织进行修复抗原的处理流程极不规范,其主要原因是:福尔马林交联反应持续存在,组织在固定液中停留时间较长,因此免疫组化标记的敏感性与染色强度参差不齐也就在所难免了。 FineFIX进行固定属于自然沉淀模式,组织抗原特性不受影响,避免了因固定剂交联作用而产生的抗原数量上的衰减,因此,在进行修复抗原时,不必采取有破坏性的修复方法,从而使抗原修复技术更为标准化,FineFIX这种无交联反应的优势,提高了抗原对抗体的敏感性,因此在许多情况下,这种节约抗体的作用尤为明显,可以稀释抗体而减少抗体的用量,这样,对使用多克隆抗体的用户,一定分量的试剂在原有基础上增加了检测的例数。针对FineFIX固定、石蜡包埋组织的抗原修复流程应采用如下规则①抗原修复温度低,一般不超过85℃。②抗体稀释度高,一般在1:200左右。③很多抗体可不做修复也能达到很好的效果。④所使用的抗原修复液没有变化,采用您工作室现已有的、经过实践证明合适的抗原修复液均可。⑤达到抗原修复温度后,修复15&--20分钟,时间的长短取决于抗原决定簇的类型。 5.FineFIX固定剂的优点①处理组织时间短,因在固定过程中较早开始脱水及去脂。②非常适合微波快速组织处理及常规组织过程的固定步骤。③非常适用于后固定,可去除含脂量较多组织中的脂肪,如带骨髓的骨组织脱钙时。④可作为全自动组织脱水机第一缸的福尔马林替代品。 6.FineFIX固定后组织切片显微镜下的形态表现无论是传统的方法还是微波的方法,用FineFIX处理后的组织,在形态学上可保证很高的质量,不会因切片质量而使诊断困难,与传统的酒精固定相比,FineFIX固定的组织几乎不产生收缩和空泡,也不存在核固缩。 7.FineFIX在取材室中的优势(1)组织浸泡在FineFIX中可取得同步同定、脱水、脱脂的效果。(2)经FineFⅨ固定的大体标本,取材时触之感觉良好,易于分离并切取较薄的具有代表性的组织块。(3)经FineFⅨ固定后,淋巴结显灰白色,易于淋巴结的检出。(4)可去除脂肪组织标本的粘滑感及粘稠性,使清洁工作快速及简单,对脂肪组织可达到快速去脂的效果。(5)与福尔马林灰蒙蒙的染色效果相比,组织着色更显真实鲜艳。 8.FineFIX固定剂值得推荐在实际应用中已可证明FineFIX完全适合病理诊断所需的常规HE染色、免疫组化标记和组织化学染色,另外,在进行分子生物学研究方面更具优势。①HE染色质量及显示细胞细微结构均明显提高。②由于减少了为抗原修复决定簇而进行的具有破坏性操作,因此,明显改善了免疫组化染色效果。③特殊染色可依据已有的资料进行而无需任何变化。④非常适合细胞涂片的固定。⑤用组织蜡块进行分子生物学研究DNA是巨大的资源,但是,试图从福尔马林固定的组织中抽提DNA 以开展分子生物学研究,其成功率很难确定,室温下福尔马林固定的组织很难保存高分子量DNA,抽提的DNA分子的大小又与固定的温度直接相关,即使短暂的福尔马林固定切片也会明显降低DNA的可溶性, 在固定过程
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幽门螺杆菌免疫组化
幽门螺杆菌（helicobacter pylori，HP）的感染占所有胃癌危险因素的75%左右。及时发现HP感染并使用正规的“三联”除菌治疗可以明显降低无癌前病变个体发生胃癌的概率，预防包括胃癌在内的胃黏膜病变。目前胃黏膜活检标本检测HP感染的方法有快速尿素酶法、HE染色直接观察、HP特殊染色及HP免疫组化染色等，各医院根据自身条件采用不同的方法检测，因而得到的HP感染率差异很大，阳性检出率为45%～85%。来自于宁夏医科大学总医院病理科吕怀盛主任及其同事进行的一项研究表明，免疫组化染色法检测HP清楚直观，结果准确可靠，是检测胃黏膜活检标本中HP感染的最佳方法。该研究结果在线发表于2014年第6期《临床与实验病理学杂志》上。研究人员收集214例接受胃镜活检检测的患者，并对其胃粘膜活检组织标本采用上述4种方法进行检测，旨在探讨不同检测方法对HP感染的诊断价值。结果显示，4种方法（快速尿素酶法、HE染色、亚甲蓝特殊染色或HP免疫组化染色）检测214例胃黏膜标本中HP的阳性率分别为30.8%(66/214)、27．6%(59/214)、57.0%(122/214)、54.2%(116/214)，其中HE染色检出HP的阳性率最低，亚甲蓝染色法检测HP的阳性率最高，4种方法的检测结果比较，差异均有显著性(P&0.01，表1)。快速尿素酶法检测简便、快速，患者在行胃镜检查的同时即可获知是否有HP感染，但该法的敏感性差，与HP的数量呈正相关，有报道称标本中含有1×104个以上的菌量时，快速尿素酶的检测结果才为阳性，并且显色反应与个体视觉差异较大，因此只能作为临床检测HP感染的初筛，结果阴性并不能排除HP感染。HE染色观察亦具有简便、廉价的优势，可直接在胃黏膜活检标本中查见HP，但菌体染色较淡，有时与染液中污染的细菌难以区分，当HP感染的数量较多时容易确诊，HP量少时，诊断较为费时费力且常被病理医师判定为阴性。亚甲蓝染色可将HP染成紫蓝色，细菌形态结构清晰，但其它革兰氏阴性细菌亦可着色，因此特异性较差，本组中HP的假阳性率为34.7%。而采用HP特异的抗体行免疫组化检测时，HP呈黄褐色而周围胃黏膜组织细胞核呈蓝色，对比十分清晰，易于判读。综上所述，研究人员认为，HP免疫组化检测费用虽然较高，但染色特异、敏感、结果容易判读等优点都是其他方法无法企及的，该法以查见HP作为阳性，与作为金标准的细菌培养相比更具优势，尤其对于大批量胃黏膜活检组织的检查。
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保存至快速回贴「吐槽」做病理就病理，还得免疫组化？就知道收钱！「吐槽」做病理就病理，还得免疫组化？就知道收钱！晨曦光百家号我是一名病理科医生，今天跟大家聊一个关于患者吐槽的话题。曾经有一位显微镜下肉眼观察高度怀疑胃癌的病人，我们建议做免疫组化进一步确诊。结果这位病人当即发火……甚至有很多临床医生也不理解，以前病理科取取材，切切片子，显微镜下看一看就能诊断了，为什么现在动不动就做免疫组化，你们离开免疫组化就不会诊断了？大家的疑问与心情完全可以理解，今天我们就来给大家扒一扒免疫组化的前世今生。先打一个并不是很恰当但却非常直观的比喻。病理科最主要的任务就是鉴别肿瘤的良恶性。而鉴别肿瘤的良恶性就好比是区分人的性别。有人说那就太简单了，三岁小儿都会。要我说可不一定。伪装者绝大部分的确是可以一眼辨明，但走在街上总有那么几位会让你匪夷所思，更不要说是男扮女装或女扮男装者。人妖自不必多说，还有甚至连医学上都无法界定性别的真两性畸形和假两性畸形。性别只有男女，而肿瘤可并非绝然的只有良恶，依其良善程度可大致分为良性、交界性、低度恶性、高度恶性，还有一类是恶性潜能未定（未定？对，就是说有可能一直没事，也有可能转为恶性，对于这种我们也只能呵呵了）。说到这里实在忍不住要加一个小插曲。还是2010年在北医进修时，有一位老师会诊一例恶性潜能未定的病例，结果患者不乐意了……再说说什么是免疫组化免疫组化，全称“免疫组织化学染色”，就是利用了“抗原-抗体”的特异性化学反应的特性进行的检查。抗原，首先理解为我们取的目标粘膜，抗体可以简单的理解为能和粘膜结合的化学试剂，“化学试剂+目标组织（或粘膜）”的简单构架结构成为免疫组化的主要内容和操作梗概。这样说太难懂，简单解释一下，人体的每一类肿瘤都是由人体的不同细胞演变而来的，因此也或多或少携带这类原始细胞的特性。我们通过查找它所包含的原始细胞特性进而明确它是哪一种肿瘤，这具有循证医学意义。从根本上解除了病理以前只依靠经验诊断的瓶颈。来看看我们常用的免疫组化抗体是不是有大排档的感觉？免疫组化的意义第一肿瘤细胞特异性抗体表达与鉴别诊断病理科要做免疫组化，其中非常重要的原因就是通过不同肿瘤细胞所表达的特异性抗体，来帮助我们病理医生更清楚的认识肿瘤细胞的真正来源，以纠正我们在主观认知上的偏差，以确保病理诊断的可靠性。从上个世纪50年代免疫组化技术的初步应用，直到今天，免疫组化技术的最重要的发展就是有上百种的肿瘤细胞特异性表达抗体的发现和应用，从而使我们认识肿瘤细胞的依据越来越具有客观性。第二肿瘤恶性程度与预后肿瘤良恶性质的判断是近现代病理学诊断最重要的任务之一，也是绝大多数病患者最关心的临床诊断（没有之一），因此如何用科学的客观的指标来判断肿瘤的性质与预后，是百年来近现代病理医师孜孜以求的梦想，因此肿瘤恶性程度与预后的判断也就成为免疫组化技术中一个非常重要的发展领域。近20年来，以P16（宫颈癌）、P504S（前列腺癌）、Ki-67（肿瘤增殖、预后监测）、PCNA（肿瘤增殖、预后监测）、P53（癌基因、预后监测）等为代表的数十种恶性肿瘤相关抗体相继被广泛应用于肿瘤性质的判断和预后，从而使恶性肿瘤的辨识更加精确。比如，这是妇产科送检的一例宫颈活检标本，通过P16、Ki-67两张抗体的免疫组化染色，我们可以清楚的发现病变的宫颈粘膜上皮（红色箭头）明显表达P16和Ki-67，而正常的宫颈粘膜上皮（绿色箭头）则几乎不表达。第三肿瘤药物的使用指导病变一旦被诊断为恶性肿瘤，那么下一步传统治疗除了手术，就是放化疗了，进入21世纪，分子靶向治疗又逐步在国内广泛应用于乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、胃肠间质瘤等诸多肿瘤方面，尤其是在复发转移病例中，几乎成为肿瘤治疗的终极方案。那么如何去判断和筛检一个肿瘤病人可以使用的化疗和分子靶向治疗药物的范围，以及判断其多重耐药的可能性，却成为一个业界公认的难题！而近十几年来，随着越来越多的肿瘤药物相关基因和蛋白的发现，我们可以通过免疫组化的方法来检测相关基因和蛋白的表达水平，来初步判断患者化疗和分子靶向药物的适用范围，为下一步更精确的检测提供筛检依据。这是普外科送检的一例乳腺癌患者的药物相关基因和蛋白检测结果（ER+、Her-2+），其分子分型为Luminal B型（HER阳性），那么该病人的治疗，临床则可考虑化疗+内分泌治疗（三苯氧胺）+分子靶向治疗（赫赛汀）。这是普外科送检的一例胃腺癌病人所做的病理学检查，我选取了其中的四幅图，除了第一幅图为常规HE染色外，其余三幅图均为免疫组化染色，分别为CK-Pan、Ki-67和Her-2，其意义分别代表肿瘤细胞特异性抗体表达与鉴别诊断、肿瘤恶性程度与预后、以及肿瘤药物使用指导这三个方面。其实，免疫组化的发展和应用还有很多地方在本文中没有涉及，但是有一点是毋庸置疑的，那就是免疫组化技术已经成为现代病理学中越来越重要的组成部分，也已经成为常规病理诊断中不可替代的辅助诊断技术，更是病理科质量控制中必不可少的重要环节。一句话那就是常规病理学诊断、常规病理学技术、免疫组化技术以及分子检测技术，已经成为现代病理学不可或缺的检测手段，只有它们齐头并进，共同发展，我们病理诊断质量才能真正的有所保障。希望读完此文的您，能对免疫组化有个初步认识，也希望类似的吐槽越来越少。本文由百家号作者上传并发布，百家号仅提供信息发布平台。文章仅代表作者个人观点，不代表百度立场。未经作者许可，不得转载。晨曦光百家号最近更新：简介:最美的是清晨曦光，柔美多姿作者最新文章相关文章当前位置：
&求助HE染色和免疫组化
求助HE染色和免疫组化
作者 于德斌
我做实验需要的组织都在-80冰箱冻着呢，我想要做HE染色和免疫组化。请问冰冻组织要怎样处理才可以做HE染色和免疫组化，要具体步骤
没做过，我们做石蜡包埋的组织采摘下来就多聚甲醛固定了，不敢冻啊……
引用回帖:: Originally posted by 秋水素心 at
没做过，我们做石蜡包埋的组织采摘下来就多聚甲醛固定了，不敢冻啊…… 我是研一的，研0的时候就把组织样品取完冻上了，现在让我做HE染色和免疫组化
通常是新鲜组织石蜡包埋的，你百度下免疫组化，网上很多的步骤方法
引用回帖:: Originally posted by jjjhhbbb at
通常是新鲜组织石蜡包埋的，你百度下免疫组化，网上很多的步骤方法 想听听别人做的经验，都是怎么做的
冰冻过的组织，在制作组织切片前，必须在室温下缓慢解冻，然后按常规中性甲醛固定再制作石蜡切片或直接冷冻切片
我们是用冰冻切片的，冰冻的组织转移至冰冻切片机内，恢复到切片机温度，不能放室温，不然会产生冰晶。冰冻切片后晾片至干，HE染色和免疫组化就都可以做了。
引用回帖:: Originally posted by 蒜苗葱花 at
我们是用冰冻切片的，冰冻的组织转移至冰冻切片机内，恢复到切片机温度，不能放室温，不然会产生冰晶。冰冻切片后晾片至干，HE染色和免疫组化就都可以做了。 我得到新鲜组织之后放到了4%的多聚甲醛中于4度冰箱保存，请问切片之前还需要蔗糖脱水吗？还是从多聚甲醛中取出之后直接用冷冻液在切片机里冻上切就可以了？求大神指点，
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求助HE染色和免疫组化
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HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。一染色程序1．石蜡切片HE染色（常规HE染色）（1）二甲苯Ⅰ 5～10min（2）二甲苯Ⅱ 5～10min（3）无水乙醇Ⅰ 1～3min（4）无水乙醇Ⅱ 1～3min（5）95%乙醇Ⅰ 1～3min（6）95%乙醇Ⅱ 1～3min（7）80%乙醇 1min（8）蒸馏水 1min（9）苏木素液染色 5～10min（10）流水洗去苏木素液 1min（11）1%盐酸-乙醇 1～3s（12）稍水洗 1～2s（13）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s（14）流水冲洗 1～2min（15）蒸馏水洗 1～2min（16）0.5%伊红液染色 1～3min（17）蒸馏水稍洗 1～2s（18）80%乙醇 1～2s（19）95%乙醇Ⅰ 2～3min（20）95%乙醇Ⅱ 2～3min（21）无水乙醇Ⅰ &, 3～5min（22）无水乙醇Ⅱ 3～5min（23）石炭酸-二甲苯 3～5min（24）二甲苯Ⅰ 3～5min（25）二甲苯Ⅱ 3～5min（26）二甲苯Ⅲ 3～5min（27）中性树胶封固注：①（12）和（13）项可省去，但（14）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。②（23）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。2．冰冻切片HE染色（1）冰冻切片固定 10～30s（2）稍水洗 1～2s（3）苏木素液染色（60℃） 30～60s（4）流水洗去苏木素液 5～10s（5）1%盐酸-乙醇 &n, &nbs, &nb, 1～3s（6）稍水洗 1～2min（7）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s（8）流水冲洗 15～30s（9）0.5%伊红液染色 1～2min（10）蒸馏水稍洗 1～2min（11）80%乙醇 1～2min（12）95%乙醇 1～2min（13）无水乙醇Ⅰ 1～2min（14）无水乙醇Ⅱ 1～2min（15）石炭酸-二甲苯 2～3min（16）二甲苯Ⅰ 2～3min（17）二甲苯Ⅱ 2～3min（18）中性树胶封固注：①（7）和（8）项可省去，但（9）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。②（15）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。二染色结果：细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。三染色注意事项1．切片染色前，应彻底脱蜡。2．用含有升汞液体固定的组织，其切片染色前应先脱去汞盐：（1）石蜡切片脱蜡至水洗（2）Lugol液 20min（3）流水冲洗 5min（4）95%乙醇 10min（5）水洗 1min（6）5%次亚硫酸钠水溶液 5min（7）流水冲洗 5min（8）显微镜观察除汞满意后，转入HE染色3．脱除福尔马林色素（必要时）：（1）石蜡切片脱蜡至水洗（2）1%NaOH(1ml)与80%乙醇（99ml）混合液 10min（3）流水冲洗 5min（4）转入HE染色4．严格执行HE染色流程，用显微镜控制细胞核的苏木素染色质量。HE染片应着色鲜艳，红、蓝分明，对比清晰。5．载玻片自二甲苯中取出后，应立即用洁净、光亮的盖玻片和稠度适宜的中性树胶湿封载玻片。封盖处内无气泡，外无溢胶。封片时必须进行操作人员和局部环境的二甲苯污染防护。不应将组织切片烤干或风干后再行封片。6．必须在载玻片的一端牢贴标签。标签上应印有病理科所在的医院名称。标签上应清楚显示有关的病理号及其亚号；标签上的病理号应准确无误，无涂改。7．制片完成后，技术人员应对切片与其相应的病理学检查记录单或取材工作记录单认真进行核对；确认无误后，将制备好的切片连同相关的活检申请单/活检记录单以及取材工作单等一并移交给有关的病理医师；交接双方经核对无误后，办理移交签字手续。8．石蜡切片-HE染色的优良率（甲、乙级切片所占的比率）应≥85%。石蜡切片-HE染色质量的基本标准列于附表。9．制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含进行脱钙、脱脂等需要特殊处理的标本）。10．制片过程出现意外情况时，技术室人员应及时向病理医师和科主任报告，设法予以补救。附表 常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准优 质 标 准 满 分 质 量 缺 陷 减 分⒈组织切面完整， ①组织稍不完整：减1～3分　②不完整：减4～10分内镜咬检、穿刺标本切面数 10 ③未达到规定面数：减5分⒉切片薄(3～5μm)，厚薄均匀 10 ①切片厚(细胞重叠)，影响诊断：减6～10分②厚薄不均匀：减3～5分⒊切片无刀痕、裂隙、颤痕 10 ①有刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊断：减2分②有刀痕、裂隙、颤痕，影响诊断：减5分⒋切片平坦，无皱褶、折叠 10 ①有皱褶或折叠，尚不影响诊断：各减2分②有皱褶折或折叠，影响诊断：各减5分⒌切片无污染 10 有污染：减10分⒍无气泡（切片与载玻片间/ 10 ①有气泡：减3分盖片与切片、载玻片间）， ②胶液外溢：减3分盖片周围无胶液外溢⒎透明度好 10 ①透明度差：减1～3分②组织结构模糊：减5～7分⒏细胞核与细胞浆染色对比清晰 10 ①细胞核着色灰淡或过蓝：减5分②红(细胞浆)与蓝(细胞核)对比不清晰：减5分⒐切片无松散，裱贴位置适当 10 ①切片松散：减5分②切片裱贴位置不当：减5分⒑切片整洁， ①切片不整洁：减3分标签端正粘牢，编号清晰 10 ②标签粘贴不牢：减3分③编号不清晰：减4分合 计 100切片质量分级标准： ①甲级片： ≥90分 （优）②乙级片：75～89分（良）③丙级片：60～74分（基本合格）④丁级片： ≤59分 （不合格）四HE染色试剂的配制1．苏木素染液（1）Harri苏木素染液苏木素 1g无水乙醇 10ml硫酸铝钾 20g蒸馏水 200ml氧化汞 0.5g冰醋酸 8ml先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾；然后将该两液合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌溶液至深紫色，随即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。使用前加入冰醋酸并混匀、过滤。（2）Gill改良苏木素液苏木素 2g无水乙醇 250ml硫酸铝钾 17g蒸馏水 750ml碘酸钠 0.2g冰醋酸 20ml先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水溶解硫酸铝钾；然后将该两液混合，再依次加入碘酸钠和冰醋酸。使用前过滤。（3）Mayer改良苏木素液A液：苏木素 2g无水乙醇 40mlB液：硫酸铝钾 100g蒸馏水 600ml将苏木素溶于无水乙醇中（A液）；稍加热，使硫酸铝钾溶于蒸馏水中（B液）。将A液与B液混合后煮沸2min，再用蒸馏水补足至600 ml，加入400mg碘化钠充分混匀。染液呈紫红色。2. 盐酸－乙醇分化液浓盐酸 1 ml70%乙醇 99 ml3．伊红液（1）0.25～0.5%伊红Y水溶液伊红Y 0.25～0.5 g蒸馏水 100 ml冰醋酸 1滴（2）0.5%伊红Y-氯化钙水溶液伊红Y 0.5 g蒸馏水 100 ml无水氯化钙 0.5 g（3）0.25～0.5%伊红Y-乙醇溶液。伊红Y 0.25~0.5 g80%乙醇 100 ml4．石炭酸-二甲苯混合液石炭酸 1份二甲苯 3份石蜡组织切片的HE染色1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。3．苏木素染色5min，自来水冲洗。4．盐酸乙醇分化30s（提插数下）。5．自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。6．置伊红液2min。7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。3、免疫组织化学染色SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2～3次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗10～15分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC法1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。4)抗原修复。5)PBS洗5分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。8)PBS洗三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。10)PBC洗3次每次2分钟。11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。12)PBS洗4次每次5分钟。13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15)脱水、透明、封片、镜检。PAS染色法操作步骤1. 固定液:用Carnoy液或75%酒精　 Carnoy固定液: 纯酒精 60 ml　 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml2. 染色液1) 过碘酸酒清夜配法:过碘酸(HIO .2H O) 0.4g　 95% 酒精 35ml　 M/5醋酸钠(2.72g+蒸馏水100ml) 5ml蒸馏水10ml保存于冰箱内,用棕色瓶,可用两周.2) Schiff氏液:0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中,时时摇动三角瓶5分钟,使之充分溶解.冷却至50℃后过滤,加入10毫升1N盐酸.冷却至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸钠,在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存.3) Schiff氏酒精液配置 　Schiff氏液 11.5ml　 1N HCI 0.5ml　 纯酒精 23ml4) 亚硫酸水1%偏重亚硫酸钠 10ml　　 1N HCI 10ml　　 蒸馏水 180ml的树胶溶解。Schiff（希弗）试剂在100 mL热水里溶解0.2 g品红盐酸盐（也有叫碱性品红或盐基品红），放置冷却后，加入2g亚硫酸氢钠和2 mL浓盐酸，再用蒸馏水稀释到200 mL。或先配制10 mL二氧化硫的饱和水溶液，冷却后加人0．2g品红盐酸盐，溶解后放置数小时使溶液变成无色或淡黄色，用蒸馏水稀释至200 mL。此外，也可以将0.5 g品红的盐酸盐溶于100 mL热水中，冷却后用二氧化硫气体饱和至粉红色消失，加人0.5 g活性炭，振荡过滤，再用蒸馏水稀释至500 mL。本试剂所用的品红是para-rossaniline（或称para-fuchsin,又称假红）。此物与另一类似物rossaniline（或称fuchsin,称洋红）不同。品红溶液原是桃红色，被二氧化硫饱和后变成无色的Schiff试剂。Schiff试剂应密封贮存于暗冷处，倘若受热见光或露置空气中过久，试剂中的二氧化硫易失，结果又显桃红色，遇此情况，应再通入二氧化硫，使颜色消失后使用。但应指出，试剂中过量的二氧化硫愈少，反应就愈灵敏。 & &
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