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【求助）免疫组化不加1抗和2抗的对照组也染色，求助各位高手帮我分析分析原因吧，谢谢 （有图）
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这是我头一次进实验室，菜鸟一个，做鳞癌的免疫组化有1个月了，在丁香园学习了很多，实验组有明显着色，对照组也会有非特异性着色，染色能轻一些，我说下我的具体的过程，常规二甲苯、水化，0.3%双氧水室温半小时（自配），微波修复 5min*2次，自然冷却，1抗是兔抗人，2抗试剂盒是中山金桥sp法的，由于对照会着色，我就做了好几个对照，分别是血清封闭后不加1抗，血清封闭后不加1抗和2抗，直接不加封闭血清、1抗、2抗和3抗。然后用索*龙的DAB显色试剂盒显色3分钟，复染，脱水。树胶封片。以下是不同的对照的图片，[img]&&[/img][img]&&[/img]直接不加封闭血清、1抗、2抗和3抗 的图片完全阴性，我没有照。我想难道是，二抗、三抗我没有完全冲干净的事吗？或者试剂盒里的三抗有问题？请教各位啦我该怎么一步步解决。万分感谢！
不知道邀请谁？试试他们
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yl528 edited on
由于图片发不上去拿手机照的，第一张是没加一抗，第二张是没加一抗和二抗
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丁香园助理版主
1、列出你的详细试剂信息和操作信息。2、如果使用了biotin抗体可以封闭一下内源性biotin试试。3、显色时间是否优化？这些看起来都是背景。
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1、列出你的详细试剂信息和操作信息。2、如果使用了biotin抗体可以封闭一下内源性biotin试试。3、显色时间是否优化？这些看起来都是背景。谢谢这位战友，我一抗用的是前人买的Novusbio家的抗体，二抗试剂盒用的是中山金桥公司的抗兔sp法试剂盒，里面有去除内源性过氧化物酶的双氧水和封闭血清，还有生物素化第二抗体，和链霉青和素—过氧化物酶复合物，dab显色用solar io家的，
我有几个疑问，由于链霉亲和素不含糖基，可保持中性等电点，不与组织产生静电结合，也不与内源性生物素结合，是不是可以不用阻断内源性的生物素呢？在园子里学习的内容结合我自己想法，没加一抗的着色，是双氧水和血清封闭过的，没有封闭干净造成二抗与肿瘤组织中的其他物质结合？肿瘤毕竟在取材和固定和包埋中很多不在控制之中，比如出血多，如果是这样的话，我应该延长双氧水的时间吗？试剂盒里有封闭血清，我如果想单独再封闭内源性生物素应该用什么试剂好呢？或者是二抗没洗干净？请教一下您是从哪些方面觉得像是背景着色？我不会看哎！谢谢了！
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yl528 我有几个疑问，由于链霉亲和素不含糖基，可保持中性等电点，不与组织产生静电结合，也不与内源性生物素结合，是不是可以不用阻断内源性的生物素呢？在园子里学习的内容结合我自己想法，没加一抗的着色，是双氧水和血清封闭过的，没有封闭干净造成二抗与肿瘤组织中的其他物质结合？肿瘤毕竟在取材和固定和包埋中很多不在控制之中，比如出血多，如果是这样的话，我应该延长双氧水的时间吗？试剂盒里有封闭血清，我如果想单独再封闭内源性生物素应该用什么试剂好呢？或者是二抗没洗干净？请教一下您是从哪些方面觉得像是背景着色？我不会看哎！谢谢了！1、理论上是这样，但要看具体内源含量。2、可以适当延长过氧化氢封闭时间。3、封闭液可以买到成品。可加强洗涤，多看点阳性片子有助于你的检测。
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yl528 我有几个疑问，由于链霉亲和素不含糖基，可保持中性等电点，不与组织产生静电结合，也不与内源性生物素结合，是不是可以不用阻断内源性的生物素呢？在园子里学习的内容结合我自己想法，没加一抗的着色，是双氧水和血清封闭过的，没有封闭干净造成二抗与肿瘤组织中的其他物质结合？肿瘤毕竟在取材和固定和包埋中很多不在控制之中，比如出血多，如果是这样的话，我应该延长双氧水的时间吗？试剂盒里有封闭血清，我如果想单独再封闭内源性生物素应该用什么试剂好呢？或者是二抗没洗干净？请教一下您是从哪些方面觉得像是背景着色？我不会看哎！谢谢了！1、理论上是这样，但要看具体内源含量。2、可以适当延长过氧化氢封闭时间。3、封闭液可以买到成品。可加强洗涤，多看点阳性片子有助于你的检测。非常感谢
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