大肠菌群平板计数法
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本法参照国标GB 0规定的大肠菌群测定方法第二法。
(1）检验程序见图3-7
样品先经过VRBA的筛选，因其中含有和紫，可以很好的抑制的生长，乳糖可以产酸，在中性红存在时，产生典型的紫红色周围有红色胆盐沉淀的菌落。因为其他阴性肠杆菌可以分解其他糖类产生红色菌落，因此需接种BGLB培养基证实。
(3）操作步骤
样品处理及稀释同MPN法。
①加样制作平板：选取2-3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿ImL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。及时将15 -20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注．于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，
待琼脂凝固后，再加3～ 4mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于（36±1)0C培养18~24h.
②平板菌落数的选择：选取菌落数在15 ~150CFU的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0. 5mm或更大。
③证实试验：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，(36±1)℃培养24-48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
④大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8. 3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（每毫升）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100 X 6/10 X 10-4 CFU/g(mL)＝6. 0 X 10一3 CFU/g（mL)。
(4）检验时应注意的事项
①检验步骤
2008版前的大肠菌群的检验步骤采用三步法（乳糖胆盐发酵试验、EMB琼脂分离培养和证实试验）。第一步乳糖发酵实验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经过平板分离和证实试验后，有时可以成为阴性。大量的数据表明，食品中大肠菌群检验步序的符合率，初发酵与证实试验相差较大，不同食品三步法的符合情况也不一致，所以2008版之后改为两步法，取消了分离培养这一步，将大肠菌群MPN计数法的培养基由乳糖胆盐修改为月桂基硫酸盐胰蛋白膝肉汤；复发酵培养基由乳糖发酵肉汤改为亮绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤，大肠菌群MPN法中报告每100mL (100g）改为1mL(1g)。试验证实，修改后对大肠菌群的检出效果相同，发酵管对于阳性结果的判断只通过“产气”，不存在颜色的影响，明确了判断依据；减少了步骤，使操作更加简便，结果更接近真实。
②产酸产气原因：在初发酵试验中，能出现产酸产气现象的原因很多，如大肠菌群发酵乳糖产酸产气；两种细菌共同作用发酵乳糖产酸产气，但其中任何一种不能单独发酵；食品中杂菌多时，（多黏芽抱杆菌、浸麻芽抱杆菌、产气荚膜梭菌）发酵乳糖产酸产气；有些非大肠菌群发酵葡萄糖等糖类产酸产气。因此必须做证实试验。
③复发酵结果：从LST产气管接一环到BGLB中进行复发酵，（此时不受样品中非乳糖的干扰进行乳糖发酵，也避免了许多芽抱杆菌的干扰），在BGLB中产气的为阳性，不产气的为阴性。但此法也有缺陷，有时出现假阳性。由于亮绿遇胆盐降低了其活性，有时不能彻底抑制芽抱菌。为避免此缺陷，对BGLB中产气的划线于EMB上，挑典型菌落镜检。
④抑菌剂：在大肠菌群检验中，经常使用的抑菌剂有胆盐、洗衣粉、十二烷基磺酸钠、亮绿、结晶紫、孔雀绿等。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响；有的抑菌剂当牌号、规格改变时，也可影响抑菌效果，而需重新测定抑菌的有效剂量，这些情况均给抑菌剂的使用带来不利条件。目前我国在食品大肠菌群检验方面采用胆盐作为抑菌剂，猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果，经试验观察无明显差异，可相互替代，但其他胆盐的检验效果则不一致，故不宜相互替代。
目前由于胆盐不易购买，有的实验室以3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠、兔胆盐等替代猪胆盐加入培养基中，这会影响大肠菌群的检验结果，应予注意。因此在2008版的检验标准中改为月桂基硫酸钠。两者的作用都是抑制革兰氏阳性球菌。但前者是化学试剂，批间差异小，易观察结果，对损伤菌有修复作用，检出率提高，检验结果稳定。后者是生物试剂，取自牛和猪等动物的胆囊，批间差异大，结果可靠性差。另外，在胆盐用量上实验表明1%, 0.5％和0. 25％三个剂量无任何差异，所以目前乳糖发酵管采用的胆盐剂量（(0. 5%)是适宜的，在称量时稍有误差，亦不致影响大肠菌群的检出。
⑤平板计数法：若样品较脏，使用MPN法较不方便，一般使用结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）在平皿内样品稀释液与VRBA琼脂混合，等到凝固后，另加盖一层VRBA琼脂，以抑制专性需氧菌，从中挑取粉红晕的菌落计数，取30~150个菌落的平板，挑选其中10个有代表性的菌落分别接种到亮绿胆盐发酵管进行鉴定。
⑥挑选菌落：大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠埃希氏菌类更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。所以在实际工作中，为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。在检验中，大肠菌群在VRBA琼脂上典型菌落呈紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0. 5mm或更大。在伊红一美蓝（EMB)平板上的菌落呈黑紫色有光泽或无光泽的检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。菌落形态的其他方面（如菌落大小、光滑与粗糙、边缘完整情况、降起度、湿润与干燥等）虽亦应注意，但不如色泽方面更为重要。影响大肠菌群检出率的因素较多，如食品种类、菌落色择和形态、细菌种类等，所以实际工作中通常挑选一个菌落，由于概率问题，难免出现假阴性，尤其当菌落不典型时。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则多挑几个，以免出假阴性。
⑦产气量：大肠菌群的产气量，多者可使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生小于米粒的气泡。一般来说，产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但随样品种类而不同，有小于米粒的气泡，亦可有阳性检出。对未产气的乳糖发酵管如有疑问时，可用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应做进一步观察。这种情况的阳性检出率可达半数以上。
⑧MPN法：MPN法是一种采用数学理论推算，用置信区间描述细菌浓度的一种间接计数法。虽然实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数，而实际菌落数落在置信区间内的任何一点。该方法是1915年McCrady首次发表的。
最可能数（MPN）是表示样品中活菌密度的估测。MPN检索表通常是采用三个稀释度九管法来计算的，当然也可以十五管或更多。稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测，较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性，而最高稀释度的3管为阴性。如果无法估测样品中的菌数，则做一定范围的稀释度。这次提供的MPN检索表列出了95％可信限，供作参考。
另外，在查阅MPN检索表时，应注意以下几不问题。
通常MPN检索表只给了三个稀释度，即0.1mL(g), 0.O1mL(g), 0.OO1mL(g)，如欲改用1mL(g)、0. 1mL(g)、0. 01mL(g）或0. 01mL(g)、0. 001mL(g)、0. 0001mL(g）时，则表内数字应相应增加或降低10倍，其余可类推。
在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的mL (g)，系指原样品（包括液体和固体）的毫升（克）数，并非样品稀释后的毫升（克）数，如固体样品lg经10倍稀释后，虽加人1mL量，但实际其中只含0. 1 g样品，故应按0. 1g计，不应按1mL计，或按1mL计，单检索数字必须再乘以稀释倍数。
当检索表内三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN值应按＜3判定，这样更能反映实际情况。例如11. 1mL(g）和1. 11mL(g）两个检测剂量，当它们都是阴性时，如按。处理，则两组样品虽相差10倍，但MPN值却无法区分，实际上这两个。的含义并不相等。如按照＜3和＜30处理，则MPN值能反映出两组所用样品量的不同，实际上11. 1mL(g）应为G3，而1. 11mL(g）应为＜30，二者还是有区别的。所以用＜3和＜30处理，更能反映实际情况。
【关键词】琼脂平板 胆盐 结晶 革兰氏阳性菌 大肠菌查看: 1720|回复: 11
求大肠菌群10版方法二的原始积记录
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各位，可有大肠菌群10版方法二的原始积记录啊？
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我自己做的，看看能不能用。
可能比较复杂
那个你做证实实验的时候是一个稀释度挑10个还是一个平板挑10个啊&&一个接种一根BGLB管吗
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我自己做的，看看能不能用。
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不用做5个样品吗
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请问下，从VRBA平板上挑取10个不同类型的菌落，是从几个平板里选呀？
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学习学习，谢谢
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谢谢，我自己又设计了一下，完全的表格形式，我每天要做的太多了 ！
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谢谢，参考参考
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前半照菌落的，后半加上证实试验的比例基本就差不多了吧
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GB 6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
GB 6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数发布 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布本标准代替GB4789.3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB/T4789.32—2002《食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。本标准与GB4789.3—2010相比,主要变化如下:———增加了检验原理;———修改了适用范围;———修改了典型菌落的形态描述;———修改了第二法平板菌落数的选择;———修改了第二法证实试验;———修改了第二法平板计数的报告。1 范围本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。2 术语和定义2.1大肠菌群 （Coliforms）在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2最可能数 （Mostprobablenumber）MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3 检验原理3.1 MPN 法MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。3.2 平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。4 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:4.1 恒温培养箱:36℃ ±1℃。4.2 冰箱:2℃~5℃。4.3 恒温水浴箱:46℃±1℃。4.4 天平:感量0.1g。4.5 均质器。4.6 振荡器。4.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL 刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头。4.8 无菌锥形瓶:容量500mL。4.9 无菌培养皿:直径90mm。4.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。4.11 菌落计数器。5 培养基和试剂5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(laurylsulfatetryptose,LST)肉汤:见A.1。5.2 煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤:见A.2。5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA):见A.3。5.4 无菌磷酸盐缓冲液:见A.4。5.5 无菌生理盐水:见A.5。5.6 1mol/LNaOH 溶液:见A.6。5.7 1mol/LHCl溶液:见A.7。第一法大肠菌群MPN 计数法6 检验程序大肠菌群MPN 计数的检验程序见图1。7 操作步骤7.1 样品的稀释7.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。7.1.3 样品匀液的pH 应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl调节。7.1.4 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。7.2 初发酵试验每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃±1℃ 培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。7.3 复发酵试验(证实试验)用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索MPN 表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN 值。第二法大肠菌群平板计数法8 检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。 & & & & & & & & & & & & & &图2 大肠菌群平板计数法检验程序9 操作步骤9.1 样品的稀释按7.1进行。9.2 平板计数9.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。9.2.2 及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。9.3 平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。9.4 证实试验从VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。9.5 大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA 平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。附录 A培养基和试剂A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤A.1.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000mLA.1.2 制法将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH 至6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤A.2.1 成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200mL0.1%煌绿水溶液13.3mL蒸馏水800mLA.2.2 制法将蛋白胨、乳糖溶于约500mL 蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL 蒸馏水中,调节pH 至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调节pH 至7.2±0.1,再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)A.3.1 成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g胆盐或3号胆盐1.5g中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂15g~18g蒸馏水1000mLA.3.2 制法将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH 至7.4±0.1。煮沸2min,将培养基融化并恒温至45℃~50℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3h。A.4 磷酸盐缓冲液A.4.1 成分磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g蒸馏水500mLA.4.2 制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至7.2±0.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。A.5 无菌生理盐水A.5.1 成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mLA.5.2 制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。A.6 1mol/LNaOH 溶液A.6.1 成分NaOH 40.0g蒸馏水1000mLA.6.2 制法称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。A.7 1mol/LHCl溶液A.7.1 成分HCl 90mL蒸馏水1000mLA.7.2 制法移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。附录 B大肠菌群最可能数(MPN)检索表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
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果不产气, 继续培养至 48± 2h, 检查产气情况。按产气管数,查 MPN 表计数出粪大肠菌群 MPN 值。继续大肠杆菌分析, 按以下 F 部分进行。 EC 肉汤 MPN 方法可用于海水和贝肉类的粪大肠菌群检测。注意: 除水、贝类和贝类养殖水中的粪大肠菌群检测的培养温度为 44.5 ± 0.2 ℃外, 其他所有食品中粪大肠菌群的培养温度为 45.5 ± 0.2 ℃。 F、 MPN 法—大肠杆菌的完全测定进行大肠杆菌完全测定前, 轻轻摇匀产气的 EC 肉汤试管, 取产气管的培养物划线接种于伊红美蓝平板( L-EMB ), 35℃培养 18-24h ,检查 L-EMB 平板上有无具黑色中心的有金属光泽或无金属光泽的扁平菌落。挑取 5 个典型菌落接种到 PCA 斜面培养基上, 35℃培养 18-24h ,进行进一步检测。注意:检测 5 个可疑菌落中任何一个为大肠杆菌,都可以确证 EC 肉汤管为阳性。因此,并非 5 个菌落都必须检测。革兰氏染色:所有为革兰氏染色阴性短杆菌的培养物,都应进行 IMVIC 生化反应检测和重新接种到 LST 肉汤进行产气确证试验。吲哚试验:将 PCA 斜面纯培养物接种到胰蛋白胨肉汤中, 35℃培养 24± 2h,加 Kovac s 氏试剂 0.2-0.3ml 。上层出现明显红色为靛基质阳性反应。 VP 试验: 将纯培养物接种到 MR-VP 肉汤中, 35℃培养 48± 2h, 以无菌操作称取培养物 1ml 至 13*100mm 试管中,加入 0.6ml α- 萘酚溶液, 0.2ml 40%KOH 溶液和少许肌酸结晶。振摇试管后静置 2h 。如出现伊红色,为 VP 阳性反应。***红试验:在VP 试验完后, 试管中 MR-V P 培养物剩余部分继续在 35℃培养 48± 2h; 滴加 5 滴***红溶液,培养物变为明显红色为***红试验阳性,若变为黄色则为阴性反应。柠檬酸盐试验: 接种纯培养物到 Koser ’S 枸橼酸盐肉汤中清澈液体, 避免接种量过量产生浑浊。 35℃培养 96h ,培养物为明显浑浊为阳性反应。发酵乳糖产气试验: 接种纯培养物到 LST 肉汤中, 35℃培养 48± 2h, 产气或轻轻摇动试管产生气泡为阳性反应。结果报告:所有培养物( A )在 35℃培养 48± 2h 内发酵乳糖产酸产气( B )革兰氏阴性无芽孢杆菌(C) IMVIC 试验为++--或-+-- 为大肠杆菌。再根据 EC 肉汤中阳性管数(连续 3 个稀释度)查 MPN 表(见附录 2 )计算出每克(毫升)样品大肠杆菌 MPN 值。注意:可以选用 API20E 或 VITEK 生化分析,鉴定大肠杆菌,替代 IMVIC 生化试验。 G .大肠菌群固体培养基测定法按照生产厂家说明制备结晶紫中性红琼脂( VRBA ) 冷至 48℃时备用。样品制备按照以上 I.C 部分制备。每个稀释度分别移取 2个 1ml 样品液到 2 个灭菌平皿中, 根据细菌受损和挤压的程度。取 10ml 冷至 48℃的 VRBA 培养基加入平皿中, 小心旋转平皿, 将培养基与样品液充分混匀。待琼脂凝固后,再加入 5mlVRBA 培养基覆盖平板表层,以防止细菌蔓延生长。如果细菌细胞受损严重,需要复苏修复,取 8-10ml 冷至 48℃的胰蛋白胨大豆琼脂, 将培养基与样品液充分混匀, 在室温中放置 2± 0.5h , 再加入 8-10ml 冷至 48℃的 VRBA 培养基覆盖平板表层。把凝固后的平板, 35℃倒置培养 18-24h ,检测乳制品时,放置 32℃培养 18-24h , 用带光源的放大镜下检查平板。选用有 25-250 个菌落的平板, 计数平板上出现的典型大肠菌群, 典型菌落为紫红色, 菌落周围有红色的胆盐沉淀环, 菌落直径为 0.5m m 或更大。为了确证大肠菌群,从 VRBA 平板至少挑取 10 个典型菌落,接种于 BGL B 肉汤内, 35℃培养 24h 和 48h ,观察产气情况。注意: 将出现产气的 BGLB 肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管应进行革兰氏染色,以便挑除革兰氏阳性杆菌。每克样品中的大肠菌群数量等于经最后证实为阳性的试管百分比乘以 VRBA 上的可疑菌落,再乘以稀释倍数。另外一种方法: 大肠杆菌可以与大肠菌群进行区别, 在每毫升 VRBA 覆盖琼脂中加入 100ug MUG , 经培养后, 大肠杆菌在长紫外灯下出现蓝色荧光。( 详见 LST-MUG 部分Ⅱ) H 、膜过滤法(MF) 检测大肠菌群:见部分Ⅲ,瓶装水检测。注意: 由于大多数食品容易粘在膜上, 因此, MF 法最适合于检测水样品, MF 法也可用于含微量颗粒少的液体食品。Ⅱ.LST-MUG 法检测冷藏和冷冻食品中大肠杆菌( 除双壳类软体动物制品外) LST-MUG 法原理基于β- 葡萄糖苷酶能降解 MUG 成 4-MU , 在长紫外灯下时( 365nm ), MU 在菌落周围培养基显示出蓝色荧光, 非常容易辨别。 95% 以上的大肠杆菌产生β- 葡萄糖苷酶( 包括一些不产气的菌株), 而大肠杆菌 O157 : H7 不产生此酶。经常通过β- 葡萄糖苷酶来区别大肠杆菌与大肠杆菌 O157 : H7, 虽然β- 葡萄糖苷酶阳性的 O157 : H7 确实存在。肠杆菌科中除了一部分志贺氏菌( 44-58% ) 和沙门氏菌( 20-29% ) 含有此酶以外,其他细菌都不含有此酶。因此, 从公共卫生角度来分析, 并不认为通过β- 葡萄糖苷酶来检测致病菌出现疏忽是一个缺点。β- 葡萄糖苷酶的活性是受催化抑制影响的,有些大肠杆菌为β- 葡萄糖苷酶阴性, 甚至有时携带有编码这个酶的 Vida 基因。然而, 在研究表明, 大约 96% 的大肠杆菌为β- 葡萄糖苷酶阳性而不需要此酶的诱导。除一些培养基外,例如 EMB 培养基,含有一些荧光物质, 会掩盖 MU 荧光, MUG 能加入几乎任何培养基中进行大肠杆菌检测。当 MUG 加入 LST 中后,大肠菌群可以通过发酵乳糖产气进行检测,大肠杆菌可以在长紫外灯光观察荧光进行检测, 这样可以在 24h 内进行大肠杆菌近似鉴定。 LST-MU G 培养基已经被 AOAC 作为对除贝类外的冷藏和冷冻食品的大肠杆菌检测。对于 MUG 分析的方法可联系 Peter Feng 博士、 FDA 、 CFSAN 、大学公园、 MD、 20740 、 301-436-1650 注意:观察 LST-MUG 试管的荧光时,应在黑暗处长紫外灯( 365nm )下,手提式 6w 的紫外灯完全可以满足要求且非常安全。当使用更大功率的紫外灯时,例 15w 紫外灯,应带上防紫外线的眼镜和手套。同时,在采用 MUG 方法前,检测所有玻璃试管是否本身含有荧光,有时二氧化铈加入玻璃中进行质量控制检测,在紫外灯下会产生荧光,干扰 MUG 检测。因此,在 MUG 检测方法中,把阳性菌株和阴性菌株进行对照非常必要。 1、设备和材料:见前面部分 I.A 玻璃试管:新的、一次性( 100*16mm ) 玻璃试
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