RT-PCR中总RNA的浓度问题
请教：在做RT-PCR过程中，不同试验组别的标本中提出的总RNA浓度不一样，在下一步生成cDNA的过程中，加样时是否需要把总RNA的浓度调成一样，否则不能进行组间的比较？
09-10-27 &匿名提问
1) 什么是RT-PCR？ RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）,和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。    2) 什么是Access RT-PCR系统？ Access RT-PCR系统用于从总RNA或mRNA中, 对特异RNA模板进行反转录（RT）和聚合酶链式扩增（PCR）。这一系统在单个管子中，使用两个酶，可对极其稀少的RNA进行灵敏,快速,重复好的分析。这一系统使用禽类成髓细胞瘤病毒的反转录酶合成cDNA的第1条链，用来自黄栖热菌的热稳定 Tf1 DNA聚合酶合成cDNA的第2条链,和PCR扩增DNA。
 3) 总RNA能否作为模板，是否一定需要poly(A)+RNA? RNA模板可以是总RNA， mRNA[poly(A)+RNA], 或者合成的RNA转录产物。无论使用何种RNA，关键是保持在RNA提取过程中无RNA酶污染。使用Promega公司的SV总RNA提取系统（目录号Z3100和Z3101），RNAgents 总RNA提取系统(目录号Z5110)和PolyATtract-mRNA提取系统,所获得的RNA的纯度好, 适用于Access RT-PCR系统。 应注意降低提取所得RNA中残留DNA的量。用Promega公司的RQ1无RNA酶的DNase（目录号M6101）处理RNA样品（随后抽提和沉淀）,除去其中残留的DNA。    4) 使用Access RT-PCR系统需要RNA的量是多少？ 使用Access RT-PCR系统扩增RNA的低限取决于模板和引物。用正对照RNA，RNA量的低限为103个分子。总RNA模板的量在1pg-1ug的范围内，poly(A)+RNA模板的量在1-100ng的范围内, 可获的很好的结果。    5) 同一般常用方法相比较，Access RT-PCR系统有什么优点？ Access RT-PCR系统在单个管子中完成反应，不需要对反应混合物作任何添加，同一般常用方法相比, 减少了操作时间，减少了污染反应混合物的机会。同单酶反应相比较，即用r Tth DNA聚合酶对总RNA中的目标RNA作扩增，双酶反应更灵敏。    6) 使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件？ 有多个因素需要优化以获得最佳引物模板结合,这包括硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的次数。 A)Access RT-PCR系统中AMV反转录酶和 Tf1 DNA聚合酶对镁的需要受核苷酸，引物和模板终浓度的影响。建议选择0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸镁作初步实验。 B)对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。 C)大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察倒。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。    7) Tf1 DNA聚合酶是否有反转录酶活力？ Tf1 DNA聚合酶本身在测试的条件下不具有反转录酶活力。    8) 为什么Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶？ 要使反转录有效，必须消除RNA中的多数次级结构。为次，合成cDNA的第1条链必须在较高的温度下进行。MMLV反转录酶能采用的最高温度是42oC, AMV的活力在Access RT-PCR系统中可以达到48oC。因此，使用AMV反转录酶，可以消除RNA次级结构的负面影响。    9) 在使用反转录系统时，能否用氯化镁代替硫酸镁？ 不能用氯化镁代替硫酸镁。 Tf1 DNA聚合酶在用硫酸镁和AMV/ Tf1 5X反应液中的的活力有很大提高。
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RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程
　　（一）RNA提取
　　1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
　　2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。
　　3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
　　4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
　　5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
　　6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。
　　7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
　　8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，rpm，离心2min。
　　9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
　　10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20以下保存。
　　注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
　　（二）反应体系配制
　　1、实验设计：
　　检测标本RNA 阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）
　　阳性对照：已知病毒RNA
　　2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）
　　1）按下表加入试剂：
　　PCR反应体系
组 分 体 积（μL） RNase Free Water
　　5×RT-PCR Buffer 11.9×n
　　5×n 10mM dNTP Mixture 1×n Enzyme Mi
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