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各类荧光染料分析
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各类荧光染料分析
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【求助】关于荧光显微镜的激发波长和发射波长，高手请进！
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这个帖子发布于7年零236天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我用荧光显微镜检测DAPI染色的细胞。问题1：激发光的波长在荧光显微镜上是不是根本就调不了？也就是说是汞灯发出的是广谱激发波长，已经涵盖了所有波长，不用调？问题2：我看荧光显微镜上有个仅仅标有UV，Blue和Green的圆盘，请问这是不是过滤激发光用的滤光片？如果设在UV的话，则表示仅仅让紫外光通过，并照射样品？
问题3：检测时的发射光波长在哪里调节？
不知道邀请谁？试试他们
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magichunter edited on
没人知道？
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没有用过，无法给你肯定的答复。但给你找了点资料，看看是否可以参考一下：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。
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1、没有覆盖所有波长、有全光谱光源，通常使用的是100W 50W的汞灯为光源2、你看到的三个UV、Blue和Green分别对应三个激发块，仔细看看里面是否有激发块仔细看看是什么类型的激发块，通常是长通型的3、发射光光源会随着使用时间长短不断老化吧，光的强度减弱使用DAPI染色，可以查找对应使用激发块多染光谱相近，可以使用专用激发块
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idworker edited on
magichunter 我用荧光显微镜检测DAPI染色的细胞。问题1：激发光的波长在荧光显微镜上是不是根本就调不了？也就是说是汞灯发出的是广谱激发波长，已经涵盖了所有波长，不用调？问题2：我看荧光显微镜上有个仅仅标有UV，Blue和Green的圆盘，请问这是不是过滤激发光用的滤光片？如果设在UV的话，则表示仅仅让紫外光通过，并照射样品？
问题3：检测时的发射光波长在哪里调节？1，汞灯发出的光确实是广谱波长，而一般显微镜通过滤光片调节激发光的波长2，你的显微镜上的圆盘就是调节滤光片之用
看DAPI的话
直接旋到UV去看蓝色3，发射光波长是荧光染料固有的
眼睛看即可
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我用荧光显微镜观察CM-Dil的红色荧光，就直接用绿光来激发，为什么看不到？怎么调波长呢？CM-Dil的λexc 553nm, λem 570 nm。有哪位高手指点一下啊？俺不懂，急啊
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我们实验室有绿、蓝、红、紫、白光源，波长范围为300-700nm，那是能调吗？
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cl5823283 我用荧光显微镜观察CM-Dil的红色荧光，就直接用绿光来激发，为什么看不到？怎么调波长呢？CM-Dil的λexc 553nm, λem 570 nm。有哪位高手指点一下啊？俺不懂，急啊CM-Dil发光是红色（570nm),因为λexc= 553nm也在红色区，激发光就应该用红光啊。
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但是文献和说明书都说绿光激发啊？今天换一台显微镜终于看到了，但细胞并没有标记的很好。跟文献出入很大，不知还有什么原因
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好帖子，值得分享
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关于丁香园|/|/|/|/|/|
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【求助】荧光显微镜的选择？
老师说我们实验室的荧光显微镜只能发红光和绿光，我不知道是什么意思，波长大约是多少呢？我想做的要发蓝光，能不能用呢？要想看兰光,荧光显微镜必须要有U也就是紫外激发块我最近也在选购滤光片，一点体会，不对的请指正：荧光显微镜关键看滤光片组，滤光片组的参数主要看激发波长和发射波长，所谓的显微镜只能看红光和绿光，大概就是显微镜配备了常规的G和B滤光片组，两者的发射光波长分别落在红色和绿色波长内，而你要的蓝光要发射光滤光片的可通过波长落在蓝光波长范围，显然是不行的，选购常规U滤光片组应该差不多，但如果要达到更好的显示效果还是建议去查查你的荧光蛋白（或染料）的具体激发发射光波长，然后选配个性化的滤光片组，下面这个网站的滤光片查询不错，你可以看看 >奥林巴斯显微镜论坛,这里面有许多关于显微镜好东东谢了,唉,可能这个又要pass了,买滤光片又要money~~初学乍练,不妥之处请原谅吧!!我要是想用红光或绿光看的话,要用什么荧光染料呢?谢谢你们了,好心的人啊!yuling5168 wrote:我要是想用红光或绿光看的话,要用什么荧光染料呢?谢谢你们了,好心的人啊!green fluoriscent light detects "red" antibody, normally wavelength is 594blue fluoriscent light detects "green" antibody, normally wavelength is 488yuling5168 wrote:我要是想用红光或绿光看的话,要用什么荧光染料呢?谢谢你们了,好心的人啊!楼主，我觉得对于这个问题你的思考方向不太对。一般来说人们都是确定了使用的染料再来选择荧光激发块。因为：1、做实验之前通常都已经查阅了大量的文献资料，然后根据参考文献你知道哪几种染料可以用在你将要实验的标本上，再从中挑选最适合你的实验设计的染料，选定了染料之后再确定你要使用的荧光激发块；2、另外，你所说的红光或绿光其实是指荧光的发射光的颜色，根据荧光的原理：荧光的产生是由于某些物质的分子受到光刺激之后发生了能级变化，即分子中的原子受到光刺激后（吸收了能量）从低能级状态跃迁到高能级状态，由于高能级状态很不稳定，很容易回到低能级状态，根据能量守恒定律，从高能级状态回复到低能级状态的时候必然有能量的释放（以辐射的形式），因此就有光的产生，这种光就是我们通常说的荧光。所以荧光的产生简单地说就是stroke法则：短波长的光激发产生长波长的光。这就是通常我们说的紫外激发产生蓝光，蓝光激发产生绿光，绿光激发产生红光。所以如果你用的染料是DAPI（发蓝光），你就要选用紫外激发块，如果你选择GFP（绿光），你就要选用蓝色激发块以此类推。然而如果根据你目前说的，用红光来选择染料的话，那么所有受到激发能产生红光的染料你都可以选择，那个范围就很大很广了，你怎么去筛选出适合你的标本的染料呢？所以我觉得你这个方法是不可行的。
您的位置： &&：>>实验技术>技术应用>如何使用荧光显微镜观察细胞荧光染色
如何使用荧光显微镜观察细胞荧光染色
&一、的成像原理
&&&&是一种较为常用的的，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
&&&&什么是荧光?
&&&&物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
&&&&即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
&&&&荧光的性质
&&&&保持固有的荧光特性
&&&&荧光波长＞激发波长
&&&&荧光强度极小于激发光的强度
&&&&有不同程度的衰减
&&&&荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
&&&&荧光显微镜的优点和用途(生物秀仪器频道)
&&&&优点：
&&&&检出能力高
&&&&对细胞的刺激小
&&&&能进行多重染色
&&&&用途：
&&&&物体构造的观察
&&&&荧光的有无、色调比较进行物质判别
&&&&发荧光量的测定对物质定性、定量分析
实验目的与教学要求
&&&&1.掌握荧光显微镜的成像基本原理及其使用；
&&&&2.掌握的成像基本原理及其使用。
&&&&荧光素的特性
&&&&荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用
&&&&1.对细胞结构或组分的定性、定位、半定量研究。
&&&&2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。
&&&&二、的成像原理
&&&&通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照射到样品上，由样品表面的绕射光线入射到物镜内，产生样品的衍射图象。
&&&&三、试剂与器材
&&&&青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片(HE染色)
&&&&甲醇、1&丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片
&&&&荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜
&&&&四、实验内容和实验步骤
&&&&1.蛙血细胞染色观察：取少许蛙血&常规血涂片&凉干&甲醇固定10min&1&丫啶橙染色5min&水洗&
干燥(滤纸擦干玻片底面)&荧光显微镜观察(先低倍后高倍观察)(可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞)
&&&&2.取洋葱&撕取一小片内表皮&平面单层铺展于玻片上&室温凉干&1&丫啶橙染色5min&水洗(用吸管，小心掉片)&室温干燥(或用滤纸擦干)
&&&&&荧光显微镜观察
&&&&3.暗视野显微镜观察蛙血细胞(示范)
&&&&4.观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片(HE染色)
&&&&五、注意事项
&&&&要在光线尽量暗的环境下观察。
&&&&使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛。
&&&要在光线尽量暗的环境下观察。
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