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放射性核素标记技术
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北京市海淀区增光路55号紫玉写字楼9层[100037]
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第14章.同位素标记技术在分子生物学实验技术中的应用
第14章.同位素标记技术在分子 生物学实验中的应用中国农业大学 齐孟文标记探针? 探针（proble) 带有检测标记的，与被检测目标 物分子具有特异性互补反应性能的探测物分子或 分子片断。 ? 探针类别核酸探针 DNA、RNA探针非核酸探针，抗体、蛋白质分子标签等核酸探针双链DNA探针DNA探针核酸探针 RNA探针DNA探针单链DNA探针cDNA探针标记类别标记信号 放射性标记非放射性标记32P，33P，3H, 35S，125I，131I生物素、酶、地 高辛配体、荧光 素 等。标记位置 均匀标记 非均匀标记 如DNA末端标记标记核素核素3H 32P 33P 35S 125I 131I半衰期12.33a 14.26d 25.5d 87.23d 60d 8.04的衰变方 式?-(100) ?-(100) ?-(100) ?-(100) EC ?-(100)?粒子能量 /MeV0. 0.248 0.167?粒子能量 /MeV0.027-0.0320.605 0.333标记单体? 掺入DNA探针的常用单体标 记化合物 [?-32p]dATP，[?32p]dCTP ， [?-32p]UTP ，[?32p]ATP 。国内供应商：北京福瑞 国外供应商： UK标记单体? 在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标 记物主要是放射性同位素，如32P，33P和 35S 。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三 磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因 此使用 α 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸， 如 [ α- 32 P]dATP 。而在标记 5' 末端磷酸 基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的 ATP 。放射性的信号通过X- 光片放射自显 影或磷屏扫描获取。核酸探针标记法 1.双链DNA探针⑴ 切口平移法 首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后 借助于E.coli DNA聚合酶I的5`→3`外切酶活性，切去 带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活 性，使同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活 性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷 酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯 化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。最合适的 切口平移片段一般为50-500个核苷酸,产生均匀标记的 探针。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比 活性取决于[α -32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置 换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的 质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物 如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。切口平移法(2)随机引物法 通过热变性使模板DNA 变为单链DNA，随机 引物与单链DNA退火后，利用Klenow Fragment合 成互补链。此时如果底物中dNTP的一种或几种被 [α -32P], [α -35S], [3H] 等标记时，那么合成 的互补链DNA也被标记。合成后的双链DNA通过热 变性变成单链后即可用作杂交探针。随机引物 法? DNA标记法比较：切口平移法 反应时间 延长反应时间会降低 标记效率。必须确保 反应时间。 ～108 dpm/μg 琼脂糖等抑制反应。 随机引物法 短时间内即可得到高比活性的 探针。即使反应时间延长也不 受影响。 ～109 dpm/μg 即使有琼脂糖等混入，也相对 不受影响。探针比活性 模板纯度反应后纯化模板量要求需要除去未反应的dNTP ≥1 μg不需要除去未反应的dNTP≥25 ng2.单链DNA探针⑴ 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感 染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为 双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染 新的宿主菌。 将模板序列克隆到M13噬菌体,以特定的同用 引物或人工合成寡合苷酸为引物，在[?-32P]dNTP 存在下，由Klenow片断 酶促合成标记探针，反应 完毕后，酶切长短不一的产物，然后通过变性凝 胶电泳与模板分离。
⑵ 从RNA合成单链cDNA探针 用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: a. 寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用 于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏 向于mRNA 3‘末端序列。 b. 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上 述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA 中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列 往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到 的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可 被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析 即可得到单链探针。
3.寡核苷酸探针 若只知道待分离的目的基因编码的 蛋白质产物，而对其核苷酸序列一无所知， 即可设计合成寡核苷酸探针。 利用寡核 苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的 点突变。 单一已知序列的寡核苷酸探针. 种类 许多兼并性寡核苷酸探针组成的 寡核苷酸探针库.4.RNA探针许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自 噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们 能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA 聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中 若加入经标记的dNTP，则可合成RNA探针。 RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的 优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主 要是： RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的 稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性 的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用 RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所 以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果。5.末端标记（1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 转移加到DNA片段5`-OH上。 （2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个 单标记的ddUTP。6.PCR 扩增标记在PCR扩增时加入标记的 dNTP ，不 仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩 增，尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形。标记一般流程核酸分子杂交? 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配 对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过 程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可 以根据所使用的探针已知序列进行特异性 的靶序列检测。杂交类型核酸杂交 固相杂交 印迹杂交Southern Northern 斑点(dot)狭槽(slot)菌落 噬菌 真核原位杂交液相杂交Southern杂交DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜 或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA 或RNA。 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA 片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤: (1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位 变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼 龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性 结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。检测灵敏 Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与 32 P标记的高比活性探针的(&109 cpm/μ g)互补 DNA。如果将10μ g基因组DNA转移到滤膜上，并 与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则 可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序 列。限制性酶切割限制片段 琼脂糖电泳DNA分子带有DNA片段的凝胶用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上凝胶 滤膜转膜 吸附有DNA 片段的膜杂交、显影Southern 印迹杂交的技术流程
凝胶电泳电泳示意图转印方法(1)毛细管虹吸 优点是简单,不需要用其他仪器。缺点 是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。 (2)电泳转印 将DNA变性后,经电泳印移至带电荷的尼 龙膜上。优点是可直接转移较大的DNA片段，缺点是转 移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管和真 空转移无效时,才予以采用。 (3) 真空转移 一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在 真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从 上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉 积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正 常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(&1%)的凝胶中定量地 转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强23倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 在洗膜不严格 时,其背景比毛细管法的要高。虹吸印迹
杂交过程分子杂交炉
成像观测? 放射性自显影 利用标记核素自身的放射性射线 使感光材料感光成象的过程。目前常用的方法有: 传统的胶片自显影 感光屏：医用X光片；原理： 爆光过程，射线粒子使X光片乳胶基质中均匀分布 的溴化银晶粒感光形成物点的潜影，然后经显影 及定影得像图。胶片影象可在底片上直接观察。X光自显影暗盒及图像增强屏
成像观测储存磷光屏（storage phosphor screen） 一种由磷光晶体制成的影像屏（Imaging Plate)。经射线爆光后IP以潜能储存射线能，当 在读取装置下扫描读取时， IP在扫描激光下释放 潜能发出蓝绿光，光强与爆光时射线强度成正比， 用光电传感器转换电信号，再经模数转换成二进 制编码信号，由计算机成象系统合成为影象图。 操作：用塑料薄膜盖电泳凝胶，贴附于装于暗盒 的磷光屏曝光，然后在成像仪上，通过扫描磷光 屏上储存的光能进行成象。
UVI化学发光凝胶成像系统与著名的Molecular DynamicsTM PhosphorImagerTM 系统是一样， 台风储磷技术---磷屏Typhoon9000系列能对所有电离辐射源提供高分 辨率图像并精确定量： 3H 32P 14C 33P 125I 35S 18F 99mTc大成像面积，高分辩光学系统和灵 敏的磷屏组合，为您提供可靠的实验结果。下图给出的是用32P标记的 AtlasTM 微阵列(macroarray)在GP屏上的图像。成像观测? 闪烁光纤屏 由塑料光纤制成的板，光纤中填有铅 和发光染料，使射线能转换为可见光光子， 然后再由电荷耦合器件CCD摄像机成像。较 胶片和磷光屏的分辨率好，近实时成像且 需曝光量低。成像观测? 放射性薄层扫描仪 由空间位置灵敏探测器组成核探测仪器。 可用于薄层层析板、凝胶电泳转印膜上放 射性条带的直接定位测定。美国的Bioscan公司 AR-2000图 像扫描仪AR2000图像扫描仪可对所有类型同位素（包括3H）标 记的TLC板、凝胶、印迹进行直接定位定量计数测量。 扫描仪采用充气式计数器，可检测γ和β射线的同位素。 对整块薄层层析条带的扫描可在1分钟内完成。整套系 统包括一个仪器控制和数据采集软件，扫描结果以层析 图或2D图像显示，自动完成对峰的定量，并以多种方 式显示结果。 ? 应用于TLC板、凝胶和印迹 ? 不需破坏TLC板即可进行定量 ? 对所有类型同位素（包括3H）灵敏 ? 简单易用的WinScan软件 ? 快速、自动、可靠的运行 ? 提供出色的空间分辨率 ? 针对1、2、3块TLC板可选择不同的型号 ? 2-D彩色图像 ? 主要应用于放射化学纯度、脂类生物化学、代谢研究、 酶分析、毒理学研究等领域。瑞士卡玛产地：德国同位素薄层扫描仪技术参数扫描面积为 400×200 mm（Gita , Rita ） 50×200mm(mini Gita ,mini Rita ) 扫描速度：可选 轨道数目：1-80 检测器：γ -radiation (BGO detector) ，?-radiation (GM counting tube)，gasflow 检测能量范围：0-2000KeV 可检测的放射物: γ -radiation (BGO scintillation probe) 背景: 129I:0.7 cps (20-100 KeV) 灵敏度: 129I : 20 Bq in 10 min 分辨率: 129I : 2-3 mm(depending on the used collimator) 可检测的放射物: ?-radiation open proportional counting tube (Recommended for 3H -requires counting gas P10 = 90% Ar 10% Ch4) 背景: 18F : 0.1 cps 灵敏度: 18F : 10 Bq in 10 min 分辨率: 18F : 1-2 mm防护措施INSPECTORNorthern杂交Northern杂交与Southern杂交很相似, 主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变 性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保 证RNA完全按分子大小分离。变性剂主要有 3种:乙二醛，甲醛，羟甲基汞。电泳后的 琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法 将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探 针杂交。菌落原位杂交对分散在若干个琼脂平板上的少数菌 落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本 方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板 以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝 酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对 菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直 至得到筛选结果。菌落原位杂交
斑点杂交斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸 纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示 样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经 不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以 它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方 法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基 因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的 序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底 干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。
DNA序列分析? Sanger双脱氧链终止法 Cambridge的F. Sanger于1977年发明。 基本原理： ①DNA聚合酶能够以单链DNA作为模板，准确合成 的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷 三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中， 加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3， M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种 ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。
DNA序列分析? Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)对一个末端标记的DNA片段，用化学试 剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段。把 反应分为四组，每一组反应特异性地针对 某一种或某一类碱基，并且要保证每个DNA 分子平均只有一个靶碱基被修饰，这样， 在每一组反应中都在同一个或两个核苷酸 处DNA链发生断裂，由于碱基位置不同，就 会产生一组不同长度的DNA片段。最后，经 过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自 显影后就可读出待测DNA的核苷酸序列。化学修饰法
Maxam-Gilbert法所用的化学修饰技术碱基 G A+G特异修饰方法在pH8.0下，用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化，使C8－C9键对碱 裂解具有特异的敏感性 在 pH2.0 下，哌啶甲酸可以使嘌呤环的 N 原子质子化，从而导 致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键 肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去 在1.5mol/LNaCl存在下，只有胞嘧啶可同肼发生明显可见的反 应C+T CA+C在90℃下，用1.2mol/LNaOH处理，可使A位点发生剧烈的断裂 反应，而C位点的断裂反应较微弱DNA序列分析? DNA序列分析自动化用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作 为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段 能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终 止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用 计算机检测。荧光标记物ddATPddTTPddGTPddCTP单泳道电泳及信号收集正极负极计算机排序5@? GS FLX系统超高通量测序技术原理GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物 发光进行DNA序列分析的新技术：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶， 荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚 合与一次荧光信号释放偶联起来 (图 1)。通过检测荧光信号释放 的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不 需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
? GS FLX系统的操作过程GS FLX系统提供了完整的从样品制备到后续的生 物信息学分析解决方案。 1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品 序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA， 小分子RNA等等。 2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被 打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA， 这一步骤则不需要。短的PCR产物则可以利用GS融合 引物进行扩增后直接进行步骤4)的工作。 3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术， 将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DN**段上。 接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中 仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DN**段。? GS FLX系统的操作过程4）一条DNA片段＝一个磁珠：接头使成百上千条DN** 段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混 合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有 其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个DN**段进行 平行扩增。 5）一个磁珠＝一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠 上的DN**段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以 后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入 到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。 6）数据读取和分析工具：GS FLX系统 在7.5小时的运 行当中可获得40多万个读长，读取超过1亿个碱基信息。 GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数 据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3 GB序列 的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析， 及 120 MB的从头测序工作等。备注 焦磷酸测序(pyrosequeneing)是通过核苷酸 和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促 使荧光素发光并进行检测的测序技术。既可进行 DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核昔酸 多态性(single 年nueleotide polymohism，SNP) 检测及等位基因频率测定。 焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNAPolymerase)、 三磷酸腺酰硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素 酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化 同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物 为5’---磷酰硫酸(adenosines 5’phosphosuifate，ASP）备注和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测 序引物。在每一轮测序反应中，加人1种dNTP， 若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺人到 引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光 素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与 ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramMT转 化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数 目成正比。根据加人dNTP类型和荧光信号强度就 可实时记录模板DNA的核昔酸序列。DNA序列分析? DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果一段较短的DNA探针能与较长的 DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，则 可认为靶DNA上存在着相应的互补序列，这 就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一 种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer 寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536 种8-mer的探针群体中，仅有5种探针会与 靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。
DNA杂交测序法? SBH的应用： ① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变； ② 可用于不同DNA片段之间的序列比较； ③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中 特定基因的表达状况； ④ 可用于检验传统测序技术的准确性。蛋白质研究技术? Western免疫印迹 将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检 测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进 行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分 的抗体检测。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳， 被检测物是蛋白质，“探针”是抗体。经过 PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如 硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键形式吸 附蛋白质，且保持电泳分离的多肽类型及其生物 学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为 抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位 素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射 自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的 蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的 表达。WB
PCR应用? 1.PCR技术的原理无细胞克隆法：以拟扩增的DNA片段为模板， 一对分别与模板互补的寡核苷酸为引物，在4种脱 氧核苷酸（dNTP）存在下，由DNA聚合酶在引物所 结合的位置向3’方向合成新的互补链。其反应以 双链DNA的变性、退火、延伸为一个循环。经过多 次循环（25-30次），便目标DNA片段得以大量扩 增。由于每一次循环所产生的新链均可成为新的 模板用于下一轮循环，故PCR产物以指数方式增加。Mullis的PCR构思引物DNA聚合酶DNA聚合酶引物特定DNA片段5’(a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’(d)靶DNA的扩增3’3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’ 5’ 3’3’ 5’新引物(e)不同长度的链单位长度的链(f)引物2互补链5’ 3’3’ 5’引物1互补链(g)目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图PCR的一般过程： 预变性(93-95?C,2-5m) 变性(93-95?C,30s)(25-35)总延伸 延伸 复性 (50-70?C,30s) (75?C,30-60s) (75?C,7m)经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上 。PCR技术的原理PCR步骤: （1）高温变性，双链DNA变性（90～95℃） 成为单链； （2）低温退火（37-60℃） ，引物与单链 DNA互补序列结合； （3）适温延伸，DNA聚合酶催化（70-75℃） 使引物延伸。 （4）重复（1）-（3）步。PCR技术的原理? 实验材料、仪器和试剂 1.材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T 质粒DNA 2.仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3.试剂：10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2PCR操作步骤1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL2.PCR循环PCR仪PCR操作步骤3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按 比例混匀,上样电泳。琼脂糖凝胶电泳PCR应用PCR应用2.与标记相结合的应用 ? LP-PCR(labelled primers) 利用同位素、荧光素等对PCR引物进行 标记，可用以直观的检测目的基因，特别 适合于临床基因诊断，同时可以检测多种 基因成分。
PCR应用2.与标记相接合的应用 ? 原位PCR (Is-PCR) 以整个细胞作为反应体系，对目的基 因进行扩增，然后通过原位杂交等不破坏 细胞结构的方法进行检测的方法。其检测 标本一般为细胞涂片或组织切片，适合低 拷贝靶序列的检测。可用于细胞内的病毒 感染、基因重排，以及基因表达的检测。
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