CRISPR-Cas9基因敲除技术了解学习
我是有多么的打酱油，才能现在才了解到这个东西。。。。。。
Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats
(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems.
(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)&是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小&RNA&来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。
1.&两篇science&文章证明CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞有效
2013年2月15日发表在《科学》（Science）的两篇文章，证明Cas9系统能在293T,
K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组（HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。虽然目前，大家对该技术的特异性，免疫原性还了解甚少，但是随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。在未来的2-3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统
图2.&利用CRISPRCas进行基因组工程，图中不同颜色的剪刀代表着不同的Cas9酶
RNA-Guided Human Genome Engineering viaCas9 Science. 2013 Feb 15
Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems Science. 2013
Feb 15 339(.
2.&模式动物构建革命：CRISPR/Cas技术一次性构建多突变转基因鼠
曾构建第一只转基因小鼠的Rudolf
Jaenisch教授采用CRISPR/Cas技术成功构建了同时携带多个基因突变的小鼠。CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，且可绕开胚胎干细胞操作过程。该技术将重新定义模式动物。
Rudolf Jaenisch教授是MIT怀特黑德研究所（WhiteheadInstitute）的创始成员，在1974年，他通过将SV40&病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，构建了第一只转基因小鼠，从而改变了遗传学研究。而现在，Rudolf
Jaenisch教授将再一次革新基因修饰模式动物的生产技术，甚至有可能重新定义哪些物种可以作为模式物种。“我们现在可以在三到四个星期内生产一只携带5个突变的小鼠，而传统的技术要达到这一目标需要花费3到4年。并且这一技术相当简单，甚至可能比传统方法还要简便。”
通过改变与特定疾病相关的基因，科学家们可以利用小鼠建立疾病模式。利用这些疾病模式动物，研究者可以对疾病的发生及发展，以及各种干预措施（包括遗传学与化学手段）对疾病的影响进行研究。在过去的20年中，建立疾病模式动物的方法基本没什么变化：首先将特定的DNA片段插入到小鼠胚胎干细胞中，在将修饰过的干细胞植入到早期胚胎（即囊胚）中，然后将发育中的细胞移植到雌性小鼠中。通过这种方式建立单基因敲出的小鼠品系可能需要花费数年和数十万美元的成本。并且这种基因敲出的技术还仅局限于小鼠、大鼠等少数物种中应用。
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
Jaenisch教授的学生Chikdu
Shivalila介绍，利用CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，“我们可以非常高效率地在四个位点上对两个基因进行敲出，效率达到了80%左右。如果利用TALENT技术，我们进行单基因敲出的效率只有30%。”&Shivalila相信这一技术将很快在需要建立基因突变鼠的研究机构中得到应用。
在目前的模式动物生产技术中，胚胎干细胞是一个绕不开的过程。而CRISPR/Cas技术则无需胚胎干细胞，因此遗传学研究可能将不再局限于有限种类的模式生物了。“这打破了模式生物的定义。现在，任何可以进行胚胎操作的动物都可以成为基因组工程的研究目标。由于许多动物的基因组已经完成测序，因此，利用这一技术我们可以在更多的物种中进行高效的遗传操作。”
同时研究者也指出，对于利用CRISPR/Cas技术构建模式动物还需要开展更进一步的研究，看是否存在预期外的效果，是否会对基因组产生设计外的改变。
vip-2013.&利用CRISPRCas系统快速和高效地培育转基因小鼠One-Step
Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes
byCRISPRCas-Mediated Genome Engineering. Cell, Volume 153, Issue 4,
910-918, 02May 2013
3. CRISPR/Cas技术灵魂人物——Feng
Zhang（张锋）
MIT麦戈文脑研究所（McGovernInstitute
for Brain Research）助理教授Feng
Zhang获得瓦利基金青年研究家奖（Vallee
Foundation Young Investigator Award）。Feng
Zhang目前的研究方向是设计新的分子工具来操控活体大脑，他同时也是布罗德研究所（Broad
Institute）的核心成员。
这位年仅31岁（2013）CRISPR/Cas技术灵魂人物到底有多NB，话不多说，直接来他实验室主页看
（真是高产啊，这里面的论文都可以免费下载的哦！！）
作为一个学习者，Feng
Zhang的两篇最新的CRISPR-Cas论文是必需要学习的：
2013.改善CRISPRCas系统基因组编辑准确性DNAtargeting
specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.NatBiotechnol
doi:10.1038/nbt.)
2013. 8月29日Cell新论文DoubleNicking
by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity.
Cell,29 August 6/j.cell.
文献太多，这里给3篇Feng Zhang的新论文全文！
已投稿到：
以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。微信扫一扫
下载说明书
欢迎光临j北京英茂盛业生物科技有限公司网站！
*电子邮件：
*感兴趣的服务或产品：
详细说明：
哺乳动物细胞Cas9基因编辑服务
哺乳动物细胞Cas9基因编辑服务采用质粒转染法转入Cas9蛋白/sgRNA表达质粒和重组修复模板，通过抗性基因筛选出阳性细胞。我们有着丰富的细胞株构建经验，可为您提供基因编辑多克隆株、单克隆株筛选服务。
现在可提供的服务项目包括实验方案设计、基因敲除载体构建、基因敲入、基因敲除、定点突变等。
服务内容：
1、靶点设计，构建Cas9基因敲除质粒。
2、靶点敲除效率检测。
3、Cas9质粒/重组模板转染目的细胞。
4、挑选单克隆细胞，检测细胞基因型。
重组模板载体构建服务
多个sgRNA组装服务
两种实验方案：无痕/重组
Cas9动物细胞无痕基因编辑
Cas9动物细胞重组基因编辑
定点突变、基因敲除、基因敲入
基因敲除、基因敲入
是否残留标记
残留抗性基因或LoxP位点
易转染、易培养
易转染、易培养
Puromycin +GFP
Cas9动物细胞无痕基因编辑流程
Cas9动物细胞重组基因编辑流程
下载订单，填写您的订购要求发送到。我们收到后将根据您的订单信息，安排技术人员与您联系。
版权所有 北京英茂盛业生物科技有限公司
网站备案：京ICP备1100746
地址：北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B-916 电话:010－
产品订购： 产品咨询：CRISPR/Cas9基因敲除，敲入怎么做，原理_百度知道
CRISPR/Cas9基因敲除，敲入怎么做，原理
我有更好的答案
.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型.诱导性基因敲除也是以Cre&#47。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。2、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象;loxp系统为基础。80年代初。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制。1985年，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础
为您推荐：
其他类似问题
换一换
回答问题，赢新手礼包
个人、企业类
违法有害信息,请在下方选择后提交
色情、暴力
我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。本类论文推荐将cre loxp与crispr cas9结合的方法_文档库
文档库最新最全的文档下载
当前位置： & 将cre loxp与crispr cas9结合的方法
将cre loxp与crispr cas9结合的方法
Activation loop phosphorylation regulates B-Raf in vivo and transformation by B-Raf mutants Martin K?hler1, 2, 3, 4, + , Michael R?ring1, 2, 3, 4, + , Bj?rnSchorch 2, 3, 4, Katharina Heilmann 2, 4, Natalie Stickel 3, 4, 5, Gina J Fiala 3, 4, 6, 7, Lisa C Schmitt 1, 2, 4, Sandra Braun 1, 2, 6, Sophia Ehrenfeld 1, 4, Franziska M Uhl 1, 4, Thorsten Kaltenbacher 1, 4, Florian Weinberg 1, 2, 4, Sebastian Herzog 2, 6, 7, Robert Zeiser 5, 6, 8, 9, Wolfgang W Schamel 6, 7, 10, Hassan Jumaa 6, 7, 11&Tilman Brummer 1, 2, 4, 6, 8, 9,*
Despite being mutated in cancer and RASopathies, the role of the activation segment (AS)has not been addressed for B-Raf signaling in vivo . Here, we generated a conditional knock-in mouse allowing the expression of the B-Raf AVKA mutant in which the AS phospho-acceptor sites T 599and S 602are replaced by alanine residues. Surprisingly, despite producing a kinase-impaired protein, the Braf AVKA allele does not phenocopy the lethality of Braf -knockout or paradoxically acting knock-in alleles. However, Braf AVKA mice display abnormalities in the hematopoietic system, a distinct facial morphology, reduced ERK pathway activity in the brain, and an abnormal gait. This phenotype suggests that maximum B-Raf activity is required for the proper development, function, and maintenance of certain cell populations. By establishing conditional murine embryonic fibroblast cultures, we further show that MEK/ ERK phosphorylation and the immediate early gene response toward growth factors are impaired in the presence of B-Raf AVKA . Importantly, alanine substitution of T 599/S602impairs the transfor-mation potential of oncogenic non-V 600E B-Raf mutants and a fusion protein, suggesting that blocking their phosphorylation could represent an alternative strategy to ATP-competitive inhibitors.
Keywords BRAF Cre/loxP MAPK Ras Subject Categories C Signal Transduction
DOI 10. 15252/embj.|Received 19May 2015|Revised 26October 2015|Accepted 28October 2015|Published online 10December 2015 The EMBO Journal (– 161
See also:A Varga &M Baccarini (January2016)
Introduction
The Ras/Raf/MEK/ERKpathway plays a pivotal role in controlling proliferation, survival, and differentiation. As this pathway is often deregulated in various diseases, in particular cancer and RASo-pathies, its components are pursued as targets for pharmacological intervention (Holderfieldet al , 2014; Samatar &Poulikakos, 2014). Raf kinases represent a particularly important node as they are subject to a complex and tight regulation (Csehet al , 2014). The Raf family comprises A-Raf, B-Raf, and Raf-1in vertebrates and single raf genes in invertebrates such as D-Raf and LIN-45in Drosophila and Caenorhabditis , respectively. Distant relatives are the KSR proteins, which promote MEK activation as scaffolds, allosteric Raf activators, and potentially by their own kinase activity (Brennan et al , 2011). As described below, the presence of three Raf and two KSR isoforms allows fine-tuning of Raf activity by forming homo-and heterodimers with distinct signaling potential (Csehet al , 2014; Mooz et al , 2014). For example, B-Raf/Raf-1heterodimers represent the most potent MEK activator (Rushworthet al , 2006; Freeman et al , 2013).
Genetic analyses demonstrated that Raf isoforms possess unique and overlapping functions. B-Raf is required for maximum ERK acti-vation and for placental development as it is illustrated by the embryonic lethality of B-Raf-deficient mice (Wojnowskiet al , 2000; Brummer et al , 2002; Galabova-Kovacs et al , ; Zhong et al , 2007). B-Raf displays the most potent transforming activity among the three isoforms and is often activated by somatic alter-ations in cancer (Pritchardet al , 1995; Holderfield et al , 2014). Consequently, B-Raf appears as an attractive therapeutic target and inhibitors such as vemurafenib yield unprecedented response rates
1Faculty of Medicine, Institute of Molecular Medicine and Cell Research, Albert-Ludwigs-University (ALU),Freiburg, Germany
2Centre for Biological Systems Analysis ZBSA, ALU, Freiburg, Germany
3Spemann Graduate School for Biology and Medicine, ALU, Freiburg, Germany
4Faculty of Biology, ALU, Freiburg, Germany
5Department of Hematology and Oncology, University Medical Center, ALU, Freiburg, Germany
6Centre for Biological Signalling Studies BIOSS, ALU, Freiburg, Germany
7Department of Molecular Immunology, Faculty of Biology, University of Freiburg, Freiburg, Germany
8Comprehensive Cancer Centre, Freiburg, Germany
9German Consortium for Translational Cancer Research DKTK, Standort Freiburg, Germany
10Center for Chronic Immunodeficiency CCI, University Medical Center, Freiburg, Germany
11Institute of Immunology, University Hospital Ulm, Ulm, Germany
*Correspondingauthor. Tel:+; Fax:+; E-mail:tilman.brummer@zbsa.de
+ These authors contributed equally to this work
?2015The Authors The EMBO Journal Vol 35|No 2|2016143 Published online: December 10, 2015
Word文档免费下载：
（共19页）
病理生理和评估新药物、新治疗方法 方面有重要应用。...该文将介绍CRISPR-Cas9系统在构建基因修饰哺乳动物...利用CRISPR 系统在动物模型上引入Cre-LoxP系统可以...相对于稍早的RNAi、Cre/LoxP、ZFN和TALEN系统,此...本文将对CRISPtL/Cas9打靶系统的结构、工作原理 和...酶的结合来实现。由于是最新开发的技术,所以尚 未有...结合对癌症研究及基因组编辑技 术的理解,对 CRISPR/Cas9 技术在癌症研究中的...该小鼠模型出现了 与传统的 Cre-loxp 基因打靶方法构建的 PTEN、p53 基因敲除...《Science》 杂志发表了基于 CRISPR-Cas 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法,该技术与以往的技术不同,是利用靶点 特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的...CRISPR-derived RNA )通过碱基 配对与 tracrRNA (trans-activating RNA ) 结合...事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中, 可以大大扩展Cas9的用途。 ? 以后用此...推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNAi 方式抵抗外源遗传物质...将dCas9与 gRNA在细胞中共表达,则gRNA可以介导dCas9蛋白与DNA 结合。 如果d...相对于稍早的 RNAi、 Cre / LoxP 、 ZFN 和 ...识别并结合 李 辉等: CRISPR / Cas9 新型基因打靶...[36 ] 显微注射的方式注入斑马鱼单细胞期的受精卵...相对于稍早的 RNAi、 Cre / LoxP 、 ZFN 和 ...识别并结合 李 辉等: CRISPR / Cas9 新型基因打靶...[36 ] 显微注射的方式注入斑马鱼单细胞期的受精卵...CRISPR-Cas9一种新型基因编辑 方法 基因组编辑技术又称基因组定点修饰技术,通过在某些物种基因组中进行靶向特异 性的突变,从而解答并提出更多精确的生物学问题。 ...相对于稍早的RNAi、Cre/LoxP、ZFN和TALEN系统,此...本文将对CRISPtL/Cas9打靶系统的结构、工作原理 和...酶的结合来实现。由于是最新开发的技术,所以尚 未有...}