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【求助】请帮忙看为何出现这种背景
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丁香园荣誉版主
这个帖子发布于10年零308天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
很奇怪最近的2D出现不规则的脏背景新配的缓冲液，盘子很干净，但是胶底部就是很奇怪指导一下人血浆去高丰度后120ug银染
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丁香园荣誉版主
不明白在哪出问题，阴阳脸
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丁香园荣誉版主
底部的山水画，我哭
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胶底还真奇怪,仿佛一个高丰度蛋白的梯度~~~哈哈但我感觉最奇怪的是,为什么你的胶面上存在规则"≡"样的淡条纹,而且数量好多呀~~~
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丁香园荣誉版主
最后一块。
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我的胶也出现过这样的情况，自己推测可能是封胶的琼脂糖里面加的溴酚兰太多了，要么就是玻璃板没刷干净，也不知道想的对不对。
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首先，胶配的不是很好。第一张图片尤其明显，中间有很多细小的波浪，两边也不是很漂亮。可以提前一天或半天配胶，胶彻底摇匀了再灌，彻底凝好了再用，这样效果会好些，我就是这么做的。其次，底部灰色背景，我觉得可能是你染色的时候脏上去的，因为你胶其他部分都还干净。我也曾做过一次背景局部很脏的胶。后来发现是一次性手套不干净染上去的，因为那次的脏背景明显是一个手掌加五个手指印的痕迹。所以一次性手套和染色的盒子一定要干净。还有，上样量好像还可以再大点，呵呵，祝好！
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支持貂蝉（diaochan）
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从胶上看,你的聚焦没有聚好啊!横向条纹特别明显!原因是很多的!建议仔细分析!
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关于丁香园最近做Western，出现问题了，杂带太多，请帮忙分析原因，有图有真相 - 实验交流 - 生物秀
标题: 最近做Western，出现问题了，杂带太多，请帮忙分析原因，有图有真相
摘要: [最近做Western，出现问题了，杂带太多，请帮忙分析原因，有图有真相] 目标条带70KDa试验条件：3%TBST脱脂奶室温封闭1小时一抗多克隆抗体室温3小时，4°C过夜TBST洗液洗膜3次，共30分钟二抗37°C摇床孵育1小时TBST洗液洗膜3次，共30分钟显色请帮忙分析原因，谢谢 关键词:[多克隆抗体 一抗 条带 孵育 摇床 二抗]……
目标条带70KDa试验条件：3%TBST脱脂奶室温封闭1小时一抗多克隆抗体室温3小时，4°C过夜TBST洗液洗膜3次，共30分钟二抗37°C摇床孵育1小时TBST洗液洗膜3次，共30分钟显色请帮忙分析原因，谢谢
我做的也有很多杂带，请问你问题解决了吗？
我做的也有很多杂带，请问你问题解决了吗？你可以减少上样量试试，或许可以好一些
你的样品是含有血清吗？要是含有血清就先去除血清，要不是的话就： 1.先减少上样量2.减少一抗的用量或缩短一抗孵育时间3.将一抗改用单抗
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电话：021-【求助】p-p38的western - 经验共享 - 分析测试百科网 - 分析测试百科网
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【求助】p-p38的western
查看完整版本请点击这里：
做了一个月的磷酸化p38，买的CST的抗体。
只有一次一抗1：500，二抗1：1000出了很不清楚的条带。重复就再也没有了。
别的时候什么也没有。郁闷哪。
每次取新鲜标本，提取蛋白（加入磷酸酶抑制剂），上样量50，100，150，200ug。
电转200mA 2h，5%脱脂奶粉封闭1h。1：500，1：1000，二抗1：00都试过了。
就是不行。
求高手指点啊！查看完整版本请点击这里：
free ( 13:58:26)
普利莱的NC膜，0.2 um孔径
200mA ，2h p38做出来了 ，但是p-p38就是不行
请高手指点。
seven7 ( 13:58:46)
磷酸化抗体封闭液一般用BSA，你试一下10%BSA，再做不出来，拿过来我们给你做做看
wsll ( 13:59:17)
我的也是呢，做P-p38很久了都没有出来，1：500CST的抗体总是很弱，并且有很多杂带，真不知道该怎么优化，急求解决方法
is2011 ( 13:59:43)
还是建议你先用anti-pY抗体富集后再做磷酸化p38的WB， 效果会好很多的， 只是你的细胞培养多一点好用于富集。
南宁蓝光生物（)有很不错的anti-pY Agarose,是共价结合的抗体，不易脱落所以抗体干扰比较少。
redbutterfly ( 14:00:10)
听说做磷酸化蛋白的时候，封闭尽量不用奶粉，而用BSA来封。
200mA转膜两小时，这个时间稍微有点长，有转过头的可能。P-p38的分子量只有38kDa左右，不需要转这么长时间。我一般转50min就停了。不知道你做的几次实验结果如何，有没有背景，有没有杂带？如果没背景没杂带的话，可以考虑再增加抗体的浓度或增加上样的量来进行调整。NC膜结合能力比较弱，洗膜切记不可洗太长时间。
查看完整回复请点击这里：关注今日：6 | 主题：242038
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【求助】western blot 结果杂带比目的条带浓，求助。。
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这个帖子发布于5年零82天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做脂肪组织中一个指标的检测，westernblot 结果在曝光后发现杂带比目的条带清晰，曝光结果强。怎么回事啊？求高手指点。。。**。。。。
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可能是目的蛋白量太少，所以曝光不明显。而且杂带越强，越掩盖目的条带的曝光。建议：提取蛋白时增高总蛋白的浓度。而且提取过程中，要防止蛋白降解。
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erm73 可能是目的蛋白量太少，所以曝光不明显。而且杂带越强，越掩盖目的条带的曝光。建议：提取蛋白时增高总蛋白的浓度。而且提取过程中，要防止蛋白降解。提取蛋白的过程中如何防止蛋白的降解呢？谢谢！
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yangfeiya122 提取蛋白的过程中如何防止蛋白的降解呢？谢谢！1.分离组织时最好在冰上操作。2.匀浆时，管外也用冰降温；分次匀浆，以免太热引起蛋白降解。3.蛋白提取好后即100℃变性，分装存于﹣80度低温冰箱中。如果长期不用，存于液氮罐中。
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erm73 1.分离组织时最好在冰上操作。2.匀浆时，管外也用冰降温；分次匀浆，以免太热引起蛋白降解。3.蛋白提取好后即100℃变性，分装存于﹣80度低温冰箱中。如果长期不用，存于液氮罐中。谢谢
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关于丁香园关注今日：12 | 主题：79594
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【求助】急需JNK、P38的western blot的详细步骤
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丁香园荣誉版主
这个帖子发布于10年零147天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
因为时间较匆忙，急需一份关于JNK和P38的western blot的详细步骤谢谢！
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1 Western blot试剂1.1
30 %丙烯酰胺丙烯酰胺29 g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1 g加水至100 ml，棕色瓶室温保存。1.2
1.5 mol/L Tris-Cl (pH8.8)Tris碱18.17 g溶于水，用HCl调节pH至8.8，定容至100 ml。4 ℃保存，备用。1.3
1.0 mol/L Tris-Cl (pH6.8)Tris碱12.11 g溶于水，用HCl调节pH至6.8，定容至100 ml。4 ℃保存，备用。1.4
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris碱1.51 g, 甘氨酸9.4 g溶于水，加入10 %SDS 5ml，调节pH值8.3，定容至100 ml。4 ℃保存，备用。1..5
SDS上样缓冲液Tris-HCl
62.5mol/L (pH6.8)SDS
50mol/L (临用前加入)1.6
1 mol/L DTT量取20 ml 0.01 mol/L 乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09 g DTT，0.22 μm过滤分装，−20 ℃储存备用。1.7
脱色液甲醇
225ml蒸馏水
50ml1.8 转移缓冲液（pH 8.5）Tris碱
25mol/L甘氨酸
0.2mol/L甲醇
20%4℃保存，备用。1.9
丽春红S染液（10×贮存液）称取丽春红S 2 g，三氯乙酸30 g，磺基水扬酸30 g，加蒸馏水定容至100 ml，储存备用。用前稀释成1×使用液。1.10
10×TBSTris碱24.2 g，NaCl 80 g，用HCl调节pH值7.6，定容至1 L。用前稀释成1×使用液。4 ℃保存，备用。1.11
抗体稀释缓冲液1×TBS，0.5 %脱脂奶粉，用前加入Tween-20（终浓度为0.1 %）。1.12
封闭液1×TBS，0.5 %脱脂奶粉，现用现配。1.13
洗脱液 TBS/T1×TBS，0.1 % Tween-201.14
抗体洗脱缓冲液（stripping buffer）Tris-HCl
62.5mol/L (pH6.8)SDS
2%β-巯基乙醇
100mol/L4 ℃保存，2
Western blot实验：2.1
全细胞蛋白质提取1） 细胞用0.25 %胰酶消化。2） 细胞计数，1000 rpm，离心5 min。弃去培养基，用1×PBS洗涤细胞，每次洗涤后1000 rpm，离心5 min。3） 按细胞计数结果加入不同体积的1×SDS上样缓冲液裂解细胞，将细胞裂解液转移至微量离心管中，存于冰上。4） 将样品置于沸水浴中煮沸10 min，使蛋白质变性，冰上冷却。5） 用超声波细胞粉碎机100 W处理2 min，以降低样品粘稠度。15,000 rmp离心10 min，取上清，−20 ℃储存备用。2.2
聚丙烯酰胺凝胶电泳1） 根据所要分离蛋白质的分子量配制不同浓度的分离胶。下面可分离40－60kd的蛋白质溶液成分&&各种成分所需体积（ml）蒸馏水&&5.930%丙烯酰胺&&
5.01.5mol/L (Tris pH8.8)&&3.910%SDS&&0.15010%过硫酸铵&&0.150TEMED&&0。006合计&&4.9652） 迅速在安装好的玻璃板间隙灌注分离胶，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加1 cm）。用注射器小心地在分离胶上覆盖一层蒸馏水（约2 mm），将凝胶垂直放于室温下等待聚合。3） 分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖的蒸馏水，用蒸馏水洗涤凝胶顶部3次以除去未聚合的丙烯酰胺。尽可能排除凝胶上的液体，再用纸巾边缘吸净残留的液体。4） 配制积层胶：按下面配制5 ml溶液成分&&各种成分所需体积（ml）蒸馏水&&3.40030%丙烯酰胺&&0.8301.0mol/L (Tris pH6.8)&&0.63010%SDS&&0.05010%过硫酸铵&&0.050TEMED&&0.005合计&&4.9655） 立即在积层胶溶液中插入干净的Teflon梳子，小心避免混入气泡，再加入积层胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放于室温下等待聚合。6） 积层胶完全聚合后（约50 min），小心移出Teflon梳子用蒸馏水洗涤加样槽，把凝胶固定于电泳装置上，上下槽均加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。尽量排除凝胶底部与两玻璃板之间的气泡。7） 按预定顺序加样，每孔加10-20 μl，用Hamilton微量加样器加于底部。每加完一个样品在蒸馏水中洗涤加样器。最后在所有不加样品的槽孔中加上等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。8） 在电压60 v（8 v/cm）条件下，当染料前沿进入分离胶后，将电压提高到120 v（15 v/cm），继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约需2 h），关闭电源。1.3.2.3
蛋白质从凝胶转移至滤膜1） 戴手套，剪切6张Whatman 3mm滤纸和一张硝酸纤维素膜，其大小应与凝胶大小完全吻合。把滤纸和硝酸纤维素膜浸于转移缓冲液中，浸泡30 min。 2） 在一块夹板上放一层海棉，上铺3张浸泡过的滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用玻璃试管作滚筒挤出气泡，放置漂洗过的凝胶。3） 把硝酸纤维素滤膜放在凝胶上，要保证精确对齐，再放置3张滤纸，放上层海棉，赶尽气泡，夹紧夹板。4） 将凝胶一侧靠近阴极，滤膜一侧靠近阳极，30 mA电转移30 min后，调节电流至300 mA转移2 h。5） 转移结束后取出凝胶用考马斯亮蓝染色，硝酸纤维素膜用丽春红染色，以检查蛋白转移是否完全。6） 硝酸纤维素膜用去离子水漂洗3次，洗去红色条带。置于25 ml封闭液中，室温摇床上缓慢摇动1 h。7） 取出硝酸纤维素膜，用TBS/T漂洗3次，5 min/次。置于含有10 ml用封闭液稀释的一抗（1:1000）杂交袋中，封口，4 ℃摇床上缓慢摇动过夜。8） 弃去带有一抗的封闭液，用TBS/T漂洗硝酸纤维素膜3次，5 min/次。将膜放入含有10 ml用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的相应二抗（1:2000）的杂交袋内，封口，室温摇床上缓慢摇动1 h。9） 弃去带有一抗的封闭液，用TBS/T漂洗硝酸纤维素膜3次，5 min/次。10） 在暗室中，取等体积的ECL试剂A液、B液混合（按每平方厘米膜0.125 mlECL混合液计算）。用滤纸将膜轻轻吸干，有蛋白质的一面向上放在保鲜膜上。将ECL混合液均匀加到膜上，反应1 min，提起膜，用滤纸轻轻吸干液体。用保鲜膜覆盖硝酸纤维素膜，注意表面要平整，不存有气泡。覆盖X光胶片，曝光。胶片显影4-6 min，自来水冲洗1 min，定影5-10 min，自来水冲洗1 min。观察结果。
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能否解释一下JNK 和 p38是什么东西啊
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哺乳动物中，MAPKs pathway中的经典成员
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步骤差不多，最后一步，膜加上发光液，不发荧光，是什么原因？请大神帮忙
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