& 以下关于倒平板的操作，错误的是（　　）在火焰旁取下装有培养基
本题难度：0.73&&题型：选择题
以下关于倒平板的操作，错误的是（　　）
A、在火焰旁取下装有培养基的瓶塞B、倒平板前，让锥形瓶的瓶口迅速通过火焰C、倒平板时将培养皿的盖拿开，以方便将锥形瓶中的培养基倒入培养皿D、平板冷却凝固后要倒过来放置
来源：2015春o藁城市校级月考 | 【考点】微生物的分离和培养．
以下关于倒平板的操作，错误的是（　　）
A、在火焰旁取下装有培养基的瓶塞B、倒平板前，让锥形瓶的瓶口迅速通过火焰C、倒平板时将培养皿的盖拿开，以方便将锥形瓶中的培养基倒入培养皿D、平板冷却凝固后要倒过来放置
（2014o南昌模拟）纤维素酶对于能否实现乙醇工业化生产、处理服装面料等具有重要的意义，研究者初步筛选到能合成纤维素酶的菌株MC-1，以下是该菌株的鉴定过程．（1）为了获得能合成纤维素酶的单菌落，可采用&&&&法将初筛菌液接种在固体培养基上，这种培养基属于&&&&培养基．（2）关于制备固体培养基的叙述，错误的是&&&&A．制作固体培养基时可以加入琼脂．B．操作的顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C．待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板．D．待平板冷却凝固约5-10min后将平板倒过来放置．（3）实验过程中如何防止其他微生物的污染？．（4）下表的培养液pH均为4.8，若对MC-1中纤维素酶的活力进行测定，则需选择表中的培养液．培养液纤维素纤维素酶NaNO3牛肉膏K2HPO4KClMgSO4o7H2OFeSO4A25g/L---1g/L0.5g/L1g/L0.01g/LB--3g/L-1g/L0.5g/L1g/L0.01g/LC25g/L1ug/L-3g/L1g/L0.5g/L1g/L0.01g/LD25g/L-3g/L-1g/L0.5g/L1g/L0.01g/L（5）分离获得了具有较高纤维素酶活性的菌株MC-1，为了在此基础上获得纤维素酶活性更高的菌株，最可行的做法是&&&&．（6）某同学在培养过程中发现培养基上感染了几种细菌．若在以尿素为唯一氮源的培养基中加入&&&&指示剂培养几种菌后，指示剂变红就可以鉴定其中含有能够分解尿素的菌；若在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入&&&&染料，培养后，培养基中出现透明圈，就可以鉴定其中含有纤维素分解菌．
（2014o嘉定区一模）回答有关微生物的问题纤维素酶对于能否实现乙醇工业化生产、处理服装面料等具有重要的意义，研究者初步筛选到能合成纤维素酶的菌株MC-1，以下是该菌株的鉴定过程．（1）为了获得能合成纤维素酶的单菌落，可采用&&&&法将初筛菌液接种在固体培养基上，这种培养基属于&&&&培养基．（2）关于制备固体培养基的叙述，错误的是&&&&．A．制作固体培养基时可以加入琼脂．B．操作的顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C．待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板D．待平板冷却凝固约5-10min后将平板倒过来放置．（3）实验过程中如何防止其他微生物的污染？&&&&．（4）如表的培养液pH均为4.8，若对MC-1中纤维素酶的活力进行测定，则不能选择表中的&&&&的培养液．（多选）
MgSO4o7H2O
0.01g/L（5）分离获得了具有较高纤维素酶活性的菌株MC-1，为了在此基础上获得纤维素酶活性更高的菌株，最可行的做法是&&&&．
解析与答案
（揭秘难题真相，上）
习题“以下关于倒平板的操作，错误的是（　　）在火焰旁取下装有培养基的瓶塞倒平板前，让锥形瓶的瓶口迅速通过火焰倒平板时将培养皿的盖拿开，以方便将锥形瓶中的培养基倒入培养皿平板冷却凝固后要倒过来放置”的学库宝（/）教师分析与解答如下所示：
【分析】倒平板时先用左手握住锥形瓶的底部倾斜锥形瓶用右手旋松棉塞然后用右手的小指和手掌边缘夹住棉塞并将它拔出（切勿将棉塞放在桌面上）随之将瓶口周缘在火焰上过一下（不可灼烧以防爆裂以杀死可能沾在瓶口外的杂菌）．然后将锥形瓶从左手传至右手中（用右手的拇指、食指和中指拿住三角瓶的底部）在这操作过程中瓶口应保持在离火焰2～3cm处瓶口始终向着火焰．左手拿起一套培养皿用中指、无名指和小指托住培养皿底部用食指和大拇指夹住皿盖并开启一缝恰好能让三角瓶伸入随后倒出培养基．一般约倒入12ml的培养基即可铺满整个皿底．盖上皿盖置水平位置等凝．然后再将三角瓶移至左手瓶口再次过火并塞紧棉塞．为防止水蒸气凝集滴落到培养基上应该将冷凝后的培养皿倒置放置．
【解答】解：A、为防止杂菌污染应当在火焰旁取下装有培养基的瓶塞A正确B、倒平板前为防止杂菌污染应当让锥形瓶的瓶口迅速通过火焰B正确C、倒平板时左手拿起一套培养皿用中指、无名指和小指托住培养皿底部用食指和大拇指夹住皿盖并开启一缝恰好能让三角瓶伸入随后倒出培养基C错误D、为防止水蒸气凝集滴落到培养基上应该将冷凝后的培养皿倒置放置D正确．故选：C．
【考点】微生物的分离和培养．
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知识点讲解
经过分析，习题“以下关于倒平板的操作，错误的是（　　）在火焰旁取下装有培养基”主要考察你对
等考点的理解。
因为篇幅有限，只列出部分考点，详细请访问。
微生物的实验室培养
细菌和真菌的生活需要一定的条件，如水分、适宜的温度、还有有机物．因此首先要配制含有营养物质的培养基，可以用牛肉汁加琼脂熬制，然后把培养基和所有用具进行高温灭菌，以防杂菌对实验的干扰，为防止高温杀死细菌、真菌，要等冷却后，在进行接种，接种后放在温暖的地方进行恒温培养．注意：定期观察并详细记录实验现象．
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高中生物选修一生物技术实践知识点总结(乐山市适用)
五通桥中学 生物选修一--生物技术实践知识点总结――乐山市适用姓名：班级； 课题一 果酒和果醋的制作1、几种常用发酵菌种的比较 菌种 酵母菌 项目 生物学分类 真核生物 代谢类型 异养兼性厌氧 繁殖方式 适宜条件下出芽生殖 生产应用 酿酒 发酵条件 前期需氧，后期不需氧醋酸菌 原核生物 异养需氧 二分裂生殖 酿醋 一直需氧毛霉（选看） 真核生物 异养需氧 孢子生殖 制作腐乳 一直需氧乳酸菌（选看） 原核生物 异养厌氧 二分裂生殖 制作泡菜 不需氧2、果酒、果醋、腐乳、泡菜制作中所用菌种及控制条件的比较 制作内容 果酒 果醋 比较项目 所用菌种 酵母菌 醋酸菌 O2 的有无 无氧 有氧 最适温度 18℃～25℃ 30℃～35℃ 控制条件 时间控制 10～12 天 7～8 天 其他条件 封闭充气口 适时充气腐乳（选看） 主要是为霉 有氧 15℃～18℃ 腌制 8 天左右 控制盐酒用量泡菜（选看） 乳酸菌 无氧 常温 腌制 10 天左右 控制盐水比例相关反应式 (请同学们查书自行填 写，以加深记忆)3、果酒、果醋、腐乳和泡菜制作过程的比较及亚硝酸盐含量的检测 比较项目 果酒和果醋制作 腐乳的制作（选看） 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量（选看） 制作原理 果 酒 ： 无 氧 呼 吸 果 醋：有氧呼吸 挑选葡萄→冲洗→榨 汁→酒精发酵→醋酸 发酵 ↓ ↓ 果酒 果醋 材料的选择与处理； 防止发酵液被污染； 控制好发酵条件。泡菜制作：乳酸菌无氧呼吸多种微生物发酵亚硝酸盐检测：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐 与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N－1 －萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料实验流程图让豆腐上长也毛霉→ 加盐腌制→加卤汤装 瓶→密封腌制操作提示控制好材料的用量； 防止杂菌污染。1 / 20泡菜坛的选择；腌制的条件；测定亚硝 酸盐含量的操作。1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。 2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 ?无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵 3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 ?酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖 4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O C6H12O6→2C2H5OH＋2CO26、20℃左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在 18℃-25℃ 7、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在发酵过程中,随着酒精浓度 的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在缺氧 呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁 殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。 8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂 9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙 醛变为醋酸。 C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O 10、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气， 也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为 30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污 染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。 11、实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋） 12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现 灰绿色。先在试管中加入发酵液 2ｍL，再滴入物质的量浓度为 3mol/L 的 H2SO43 滴，振荡混匀，最后滴加常温 下饱和的重铬酸钾溶液 3 滴，振荡试管，观察颜色 13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出 二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接， 其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该 装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。疑难解答（1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。 （2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？ 如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶 盖，不要完全揭开瓶盖等。 （3）制葡萄酒时，为什么要将温度控制在 18～25℃？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在 30～35℃？ 温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围 内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为 30～35℃，因此要将温度控制在 30～35℃。课题二 微生物的实验室培养?培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质 基础。 ?培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红 藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长， 可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养2 / 20基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。 ?按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成 分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际 工业生产。 ?按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物 质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加 入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。 培养基的分类和应用 划分标准 培养基种类 液体培养基 物理性质 半固体培养基 固体培养基 天然培养基 化学组成 合成培养基 选择培养基 目的用途 鉴别培养基 特点 不加凝固剂 加凝固剂，如琼脂 加凝固剂，如琼脂 含化学成分不明确的天然物质 培养基成分明确（用化学成分已 知的化学物质配成） 培养基中加入某种化学物质，以 抑制不需要的微生物的生长，促 进所需要的微生物的生长 根据微生物的代谢特点，在培养 基中加入某种指示剂或化学药品 用途 工业生产 观察微生物的运动、分类、鉴 定 微生物分离、鉴定、活菌计数 工业生产 分类、鉴定 培养、分离出特定微生物鉴别不同种类的微生物?培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。 ?碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如 CO2、NaHCO3 等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。 异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。 ?氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如 N2、NH3、NO3 、NH4 （无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉 膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用 N2。 ?培养基还要满足微生物生长对 PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加 维生素，培养霉菌时须将培养基的 pH 调至酸性，培养细菌是需要将 pH 调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是 则需要提供无氧的条件 ?无菌技术?获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面： ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 ?消毒与灭菌的区别 消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢 子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭 酸等）消毒、紫外线消毒。 灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热 灭菌、高压蒸汽灭菌。+灭菌方法：3 / 20①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ； ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。 ④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。 消毒与灭菌的区别 比较项目 条件 结果 适用 常用方法 消毒 使用较为温和的理化方法 杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生 物（不包括芽孢和孢子） 实验操作的空间、操作者的衣服和手 煮沸消毒法（如在 100℃，煮沸 5～6 min）、 巴氏消毒法（如在 80℃，煮 15 min）；使用酒 精、氯气、石炭酸等化学药剂进行消毒 灭菌 使用强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括 芽孢和孢子 微生物的培养器皿、接种用具和培 养基等 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭 菌三种常用灭菌方法的比较 灭菌方法 灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 灭菌条件 酒精灯火焰的充分燃烧层 干热灭菌箱内，160～170℃ 100kPa，121℃ 灭菌时间 直至烧红 1～2 h 15～30 min 适用材料或用具 接种环、接种针或其他金属工具 玻璃器皿（吸管、培养皿） 和金属用具等 培养基等制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 （2）倒平板操作的步骤： ①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 ②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。 ③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约 10～20mL）倒入 培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。 ④等待平板冷却凝固，大约需 5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。 ?倒平板操作的讨论 1.培养基灭菌后，需要冷却到 50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基 表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什 么？ 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 （2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表4 / 20面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。 （3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表 面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。 （4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表 面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。 （5）平板划线法操作步骤： ①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。 ③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。 ⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内， 划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始 往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最 ⑧将平板倒置放入培养箱中培养。 ?平板划线操作的讨论 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为 什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是 为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末 端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能 及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着 划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 （6）涂布平板操作的步骤： ①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。 ③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 8～10s。 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。 涂布平板操作的讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第 2 步应如 何进行无菌操作？ 提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物 体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。 后一区的划线与第一区相连。菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。 ①临时保藏方法 将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入 4℃的冰箱中保 藏。以后每 3～6 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。 ②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。 （2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。 在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。将 1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－ 20℃的冷冻箱中保存。5 / 20疑难解答（1）生物的营养 营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物 质。 人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。 植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。 微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。 （2）确定培养基制作是否合格的方法 将未接种的培养基在恒温箱中保温 1～2 天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。课题三 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才 能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶 尿素最初是从人的尿液中发现的筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 （2）选择性培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培 养基。 （3）配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选 择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄 色葡萄球菌等。统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上 的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置 3～5 个平板，选择菌落数在 30～300 的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而 不是活菌数来表示。 采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在 30~300 之间的平板进行计数 2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在 培养基中加入 TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了 被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是 所测试的条件引起相应的结果。实验设计6 / 20实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安 排。 （1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更 多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7 的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约 3～8cm 的土壤层取样。 （2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的 样品液进行培养，以保证获得菌落数在 30~300 之间、适于计数的平板。 测定土壤中细菌的数量，一般选用 104 测定放线菌的数量，一般选用 103 （3）微生物的培养与观察 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌 30~37℃ 1~2 天 放线菌 25~28℃ 5~7 天 霉菌 25~28℃ 3~4 天 每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼 菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌 落特征。形状、大小、隆起程度、颜色 测定真菌的数量，一般选用 102 103 105 106 104 104 105疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3 个平板，计算出平板菌落数的平均值 每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时 所用的稀释液的体积（ml），M 代表稀释倍数课题四 菊花的组织培养植物组织培养的基本过程细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。 离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细胞排列疏松而 无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称 为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器 官，这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。 植物细胞工程 具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都具有全能性。 但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的选择性表达，构 成不同组织和器官。 植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细 胞产物的工厂化生产等。 ?细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？ 使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。 比较根尖分生组织和愈伤组织的异同组织类型 根尖 分生组织 愈伤组织 相同点细胞来源 受精卵细胞形态 正方形细胞结构 无液泡细胞排列 紧密 疏松7 / 20高度分化细胞 无定形 高度液泡化 都通过有丝分裂进行细胞增殖细胞去向 分化成多种 细胞组织 再分化成新个体影响植物组织培养的条件材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料 的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材 料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好， 容易诱导脱分化和再分化。 营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是 MS 培养基，其中含有的大量元素是 N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是 Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有 机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。 激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况 下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先 后顺序、用量的比例等都影响结果。 使用顺序 先生长素， 后细胞分裂素 先细胞分裂素， 后生长素 + 同时使用 实验结果 有利于分裂但不分化 细胞既分裂也分化 分化频率提高 生长素／ 细胞分裂素比值与结果 比值高时 比值低时 比值适中 促根分化， 抑芽形成 促芽分化， 抑根形成 促进愈伤组织生长环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将 pH 控制在 5.8 左右，温度控制在 18~22℃，并且每日用日光灯照射 12h. 4、操作流程 配制 MS 固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。 ?使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。 ?配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容 到 1000 毫升。 ?在菊花组织培养中，可以不添加植物激素 原因是菊花茎段组织培养比较容易。?灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。 ?MS 培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS 培养基有哪些特点？ 大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主 要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。 微生物培养基以有机营养为主，MS 培养基则需提供大量无机营养。 外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段 用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗 20min 左右。用无菌吸水纸吸干外植体表 面的水分，放入体积分数为 70%的酒精中摇动 2~3 次，持续 6~7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后 仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为 0.1%的氯化汞溶液中 1~2min。取出后，在无菌水中至少清 洗 3 次，漂洗消毒液。 注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。 接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种 7～8 个外植体。外植体接种与细菌接种相似，8 / 20操作步骤相同，而且都要求无菌操作。 培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（18~22℃）和光照（12h） 移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到 消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。 栽培 外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶 密封性差等。专题――月季的花药培养（部分班级曾略讲，选看）被子植物的花粉发育被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有许多花粉。花粉是 由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分 体时期、单核期和双核期等阶段。在小孢子四分体时期，4 个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的 4 个 单倍体细胞彼此分离，形成 4 个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核 居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成 1 个生殖细胞核和 1 个花 粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将在分裂一次，形成两个精子。 注意：①成熟的花粉粒有两类，一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核，二核花粉粒的 精子是在花粉管中形成的；另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一次有丝分裂，形成两个精 子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核）②花粉发育过程中的四分体和动物细胞减数分裂的四 分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分裂形成的 4 个连在一起的单倍体细胞；而动物细胞减 数分裂过程中的四分体是联会配对后的一对同源染色体，由于含有四条染色单体而称为四分体。③同一生殖细胞 形成的两个精子，其基因组成完全相同。 产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径，一种是花粉通过胚状体 阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没 有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。 注意：①无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根②胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的 形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结 构，就像一粒种子，又称为细胞胚。 影响花药培养的因素诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成 是主要的影响因素 〃亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。 〃合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高 〃花蕾：选择完全未开放的花蕾 〃亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响 〃材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最 常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细 胞核染成蓝黑色 〃材料的消毒 〃接种和培养：灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药 时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连 的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，通常每瓶接种花药 7～10 个,培养温度控制在 25℃左右,不需要光照.幼小 植株形成后才需要光照.一般经过 20～30 天培养后,会发现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及 时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量9 / 20幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。还需 要对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选。 植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不 同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也 要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。 植物组织培养技术与微生物培养技术的比较 比较项目 植物组织培养 在无菌条件下，将离体的植物体器官或组织接 含义 种在适当的培养基上进行培养，最终发育成完 整植物体 水、矿质元素、蔗糖、维生素、有机添加物和 培养基成分 植物激素等 严格控制无菌操作，在培养过程中要更换培养 特殊操作要求 基，调节细胞分裂素和生长素的比例 微生物培养 在无菌条件下，在适宜的营养和 环境条件下对微生物的培养 水、无机盐、碳源、氮源等 严格控制无菌操作，整个培养过 程无需更换培养基注：在这两种技术中均需要一定的营养物质，但营养物质的划分标准不同。课题五蒸馏装置包括：铁架台两个、酒精灯、石棉网、蒸 馏瓶、橡胶塞、蒸馏头、温度计、直型冷凝管、接 液管、锥形瓶，以及连接进水口和出水口的橡皮 管。所有仪器必须事先干燥，保证无水。整套蒸馏 装置可分为左、中、右三部分，其中左边的部分通 过加热进行蒸馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分 用来接收。安装仪器一般都按照自下而上、从左到 右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。具体安 装顺序和方法如下。（1）固定热源──酒精灯。 （2）固定蒸馏瓶，使其离热源的距离如教科书中图 6-2 所示，并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面 垂直。胡萝卜素的提取（3）安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。 （4）连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。 （5）连接接液管（或称尾接管）。 （6）将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接受器，接收瓶应在实验前称重，并 做好记录。 （7）将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的 下限处在同一水平线上。 蒸馏装置安装完毕后，可以在蒸馏瓶中加几粒沸石，防止液体过度沸 腾。打开水龙头，缓缓通入冷水，然后开始加热。加热时可以观察到， 蒸馏瓶中的液体逐渐沸腾，蒸气逐渐上升，温度计读数也略有上升。当 蒸气的顶端达到温度计水银球部位时，温度计读数急剧上升。在整个蒸 馏过程中，应保证温度计的水银球上常有因冷凝作用而形成的液滴。控 制蒸馏的时间和速度，通常以每秒 1～2 滴为宜。10 / 20分液漏斗的使用方法如下。（选看） （1）首先把活塞擦干，为活塞均匀涂上一层润滑脂，注意切勿将润滑脂涂得太厚或使润滑脂进入活塞孔中，以免 污染萃取液。 （2）塞好活塞后，把活塞旋转几圈，使润滑脂分布均匀。并用水检查分液漏斗的顶塞与活塞处是否渗漏，确认不 漏水后再使用。 （3）将分液漏斗放置在大小合适的、并已固定在铁架台上的铁圈中，关好活塞。将待分离的液体从上部开口处倒 入漏斗中，塞紧顶塞，注意顶塞不能涂润滑脂。 （4）取下分液漏斗，用右手手掌顶住漏斗顶塞并握住漏斗颈，左手握住漏斗活塞处，大拇指压紧活塞，将分液漏 斗略倾斜，前后振荡（开始振荡时要慢）。 （5）振荡后，使漏斗口仍保持原倾斜状态，左手仍握在漏斗活塞处，下部管口指向无人处，用拇指和食指旋开活 塞，使其释放出漏斗内的蒸气或产生的气体，以使内外压力平衡，这一步操作也称做“放气”。 （6）重复上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的气体时为止。再将分液漏斗剧烈振荡 2～3 min，然后将漏斗放 回铁圈中，待液体静置分层。 蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。 胡萝卜素性质：橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。 依据碳碳双键的数目划分为α 、β 、γ 三类。 其中最主要的组成成分为β -胡萝卜素。 作用：①治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；②常用于食品色素；③使癌变细胞恢复成正常细胞。 提取β －胡萝卜素的方法主要有三种：①从植物中提取②从大面积养殖的岩藻中获得③利用微生物的发酵生产 实验步骤①粉碎：使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。②干燥：脱水温度太高，干燥时间太长会导致胡萝 卜素分解。③萃取 Ⅰ、萃取剂的选择 水溶性的：乙醇、丙酮 水不溶性的：石油醚、乙酸乙酯、 乙醚、苯、四氯化碳等 选择：具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。 Ⅱ、影响萃取的因素 主要因素：萃取剂的性质和使用量 次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等 一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要将 胡萝卜进行粉碎和干燥 Ⅲ、胡萝卜素提取 装置的设计：萃取过程应该避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂 都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。为了防止加热时有机溶剂 挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装 置。在浓缩之前，还要进行过滤，除去萃取液中的不溶物。 ④过滤：除去萃取液中的不溶物 ⑤浓缩：蒸发出有机溶剂 鉴定：纸层析法 滤纸：18 M×30 M 基线：滤纸下端距底边 2 M处做一基线，在基线上取 A、B、C、D 四点。 点样：用最细的注射器针头（毛细吸管）吸取样品进行点样。点样应该快速细11 / 20致，在基线上形成直径２ｍｍ左右的圆点，每次点样后，可用吹风机将溶剂吹干，注意保持滤纸干燥。等滤纸上 的点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，至于装有１ｃｍ深的石油醚的密封玻璃瓶中。等各种色素完全分开 后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。 １．乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取吗？为什么？ 答：胡萝卜素可溶于乙醇和丙酮，但它们是水溶性有机溶剂，因萃取中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它 们作萃取剂。 2.在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，哪种最适宜用来提取胡萝卜素？ 答：在这五种有机溶剂中，石油醚的沸点最高，在加热萃取时不易挥发，所以石油醚最适宜用作萃取剂。提取方 法 实验原理 方法步骤 适用范围1.水蒸气蒸馏 水蒸气 蒸馏 利用水蒸气将挥发性较强的芳 香油携带出来 2.分离油层 适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油3.除水过滤1.石灰水浸泡、漂洗 通过机械加压，压榨出果皮中 压榨法 的芳香油 2.压榨、过滤、静置 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取3.再次过滤1.粉碎、干燥 有机溶 使芳香油溶解在有机溶剂中， 2.萃取、过滤 适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能 充分浸泡在有机溶液中剂萃取 蒸发溶剂后就可获得芳香油3.浓缩课题六一、实验原理血红蛋白的提取和分离蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分 离各种蛋白质。 1．凝胶色谱法（分配色谱法）： （1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒 内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程：12 / 20混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 ＊ 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 （4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。 2．缓冲溶液 （1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如 H2CO3－NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4 等），调节酸和盐的 用量，可配制不同 pH 的缓冲液。 （2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液 pH 的干扰而保持 pH 稳定。 3．凝胶电泳法： （1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不 同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 （2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （3）分离过程：在一定 pH 下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的 SDS，形成“蛋白质－ SDS 复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 二、实验步骤 1．样品处理 ① 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出 上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌 10min，低速 短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 ②血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释 放和分离。 2．粗分离 ①分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为 4 层。第一层为无色透明的甲苯层，第 2 层为白色薄层固 体，是脂溶性物质的沉淀层，第 3 层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第 4 层是其他杂质的暗红色沉淀 物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ②透析 取 1mL 的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300mL 的物质的量的浓度为 20mmol/L 的磷酸缓冲 液中，透析 12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。 3．纯化 调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝 ↓ 胶面平齐，关闭出口。加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后， O ↓ 打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后， 关闭出口。调节缓冲液面：加入 20mmol/L 的磷酸缓冲液到适当高度 ↓ 洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。 ↓ 收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。13 / 204.纯度鉴定------SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做） 三、注意事项 1. 电泳技术 电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差 异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。 2. 红细胞的洗涤 如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白 细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均 匀。 此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱 的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀？ 如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从 这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。 5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的 不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。 6．G-75 “G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75 表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水 7.5g。 7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密 8．加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？ 防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义 哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此 在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简 化了实验操作。 10．如何检测血红蛋白的分离是否成功 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平 整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有 关。课题七 果胶酶在果汁生产中的作用1．基础知识 活动 1：阅读“果胶酶的作用”，讨论并回答下列问题： 1．1 果胶是 植物细胞壁和胞间层 的主要组成成分之一。 1．2 在果汁加工中，果胶的存在易导致 果汁出汁率低，果汁浑浊 。 1．3 果胶酶分解果胶的作用是：①瓦解 植物的细胞壁及胞间层 ，使榨取果汁更容易，②把果胶分解为 可溶性的半乳糖醛酸 ，使浑浊的果汁变得澄清，因此可以解决果汁加工中出现的问题。 1．4 果胶酶是一类酶的总称，包括： 多聚半乳糖醛酸 酶、 果胶分解 酶和 果胶酯 〖思考 1〗在植物细胞工程中果胶酶的作用是 与纤维素酶一起除去植物细胞的细胞壁 。 活动 2：阅读“酶的活性与影响酶活性的因素”，讨论并回答下列问题： 1．5 酶的活性是指：酶催化 一定化学反应 的能力。 或 酶。1．6 酶的活性高低可用一定条件下的酶促 反应速度 来表示，即单位时间、单位体积内 反应物消耗量14 / 20产物生成量 来表示。 1．7 影响酶活性的因素有： 温度 、 PH 、 激活剂 和 抑制剂 等。活动 3：阅读“果胶酶的用量”，讨论并回答下列问题： 1.8 食品工业生产中最常用的果胶酶是通过 霉菌发酵 产生。1.9 根据影响酶活性的因素，在实际生产中我们如何获得果胶酶的最高活性？ 确定果胶酶的最适温度、最适 PH 等条件。 2．实验设计 活动 4：阅读“资料一：探究温度和 PH 对酶的活性的影响”，思考下列问题并尝试写出实验过程： 2．1 实验目的： 定量测定温度或 pH 对果胶酶活性的影响 。〖思考 2〗该实验与必修 I 中探究“影响酶活性的条件”实验有何不同？ 前者属于是定量分析实验，后者属于定性分析实验。 2．2 实验原理：果胶酶瓦解细胞壁和胞间层增大果汁产量；果胶酶催化分解果胶增大果汁澄清度。 2．3 变量设计与控制： ①你确定的温度梯度（或 pH 梯度）为 10℃或 5℃（或 0.5、1.0） 。 ②实验的自变量是 温度（或 pH） ，控制自变量的方法是利用 恒温水浴锅（或滴加酸碱等） 。 ③实验的因变量是 酶的活性 ，检测因变量的方法是测定 果汁的产出量或澄清度 。〖思考 3〗果汁与果胶酶在混合之前，分装在不同试管中用同一恒温处理的目的是什么？ 保证果汁与果胶酶混合前后的温度相同，避免因混合导致温度变化而影响果胶酶活性。 〖思考 4〗该实验中是否设置了对照？若设置，那么它是如何设置的？若没有，则如何进行设置？ 已经设置了对照。不同的温度设置之间可以相互对照。 〖思考 5〗怎样排除 PH 和其他因素对实验结果的干扰？目的是什么? 控制 PH 和其他因素相同，保证只有温度一个变量对果胶酶的活性产生影响。 〖思考 6〗教材中 A、B 两个同学的实验设计有何不同？ 测定的因变量不同（A 测定果汁产量，B 测定果汁澄清度）。 3．操作提示 活动 6：阅读“操作提示”，回答下列问题 3．1 制备果泥：用 榨汁机 榨制果泥。在榨制橙子汁时应怎样处理橙皮? 不必去橙皮 0.1%的 NaOH 溶液和盐酸 调节 pH。3．2 在探究不同 PH 对果胶酶活性的影响时，可以用3．3 在果胶酶处理果泥时，为了是果胶酶能充分地催化反应，如何操作? 用玻璃棒不时搅拌。 4．结果分析与评价 将以下某同学实验数据转换成曲线图。 将实验数据转换成曲线图的方法 ①以自变量为横坐标、以因变量为纵坐标建立直角坐标 系。 ②注明坐标轴名的名称、单位、坐标原点以及曲线名称。 ③每个坐标轴上的取值单位要相等。 ④将实验数据标在坐标系中，并用各种线型连接起来。15 / 2010 温度℃ （三）课堂总结、点评 1 果汁量/ml 设计实验方案 动手实验15 220 425 630 535 440 345 250 1制备水果泥 配制果胶酶 水果泥与果胶酶分别水浴保温记录实验数据将水果泥和果胶酶混合保温 过滤出果汁得出结论记录果汁量 改变不同的温度后重复上面的实验（四）实例探究 例 1. 水果罐头盖上印有“如发现盖子鼓起，请勿选购”的字样，引起盖子鼓起的最可能原因是（ ） A、好氧型细菌呼吸，产生 CO2 和 H2O B、酵母菌呼吸，产生 CO2 和 C2H5OH C、乳酸菌呼吸，产生 CO2 和 C3H6O3 D、酵母菌呼吸，产生 CO2 和 H2O [解析] 罐头是密封、杀菌的，但不排除有微生物的孢子等存活下来，只有进行无氧呼吸的微生物可以生存； 罐头鼓胀是过期后微生物生活产气的结果，乳酸菌无氧呼吸产生乳酸，无气体产生；酵母菌既可以在有氧条件下 生活，也可以在无氧条件下发酵产生酒精和二氧化碳。 [答案] B拓展――大学知识初识：在果汁加工中, 酶处理多用来提高果汁的出汁率、澄清果汁、脱除苦味物质、降低非酶褐变、测定有机酸以及 增香作用。 目前,我国天然果汁饮料的产量逐年增加,市场和消费者对产品品质提出了更高的要求,其中酶制剂在果汁饮料 生产上将发挥越来越重要的作用。用于果汁加工的酶主要有果胶酶、纤维素酶、α- 淀粉酶、糖化酶和溶菌酶等 多种类型,其主要作用是提高产品得率、防止产品沉淀、改善产品品质和防腐杀菌等。 果胶酶是食品加工中最重要的醇制剂之一。早在 1930 年就有了关于果胶酶生产和应用的报道。在国外果胶酶 已广泛地应用于果汁和果酒生产中，并有许多不同用途的果胶酶制剂出售。目前国内有一些单位在果胶酶的生 产，分离，应用等方面做了大量工作．并取得了不少成果和经验。 在果汁生产中果胶物质是影响果汁澄清和混浊的主要因素，利用果胶酶能有效的控制果汁的澄清和混浊。本文 试图就果胶酶在澄清果汁和混浊果汁中的应用及其作用机制作一综述。果胶酶果胶酶可分为作用于甲酯键的果胶酯(PE) 和分解α- 1 ,4 - 半乳糖醛酸苷键的解聚酶。解聚酶可分为水解酶 和裂解酶。其中对果汁澄清有效的是裂解酶类型中的内切果胶酶(endo - pL) 和水解酶类型的内切聚半乳糖醛酸 酶(endo - PG) 。使用 endo - PG 时,必须与 PE 协同作用才能起到澄清效果。果胶酶在果浆生产和澄清果汁生产 中的作用不同。果浆生产中使用果胶酶主要是软化果肉、提高果汁产量和可溶性固形物含量。而澄清果汁生产中, 常将果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等混合使用,以起到提高产品得率、协同降低果汁粘度、消除因纤维素造成的 混浊和降低酶的使用成本等作用。水果破碎物经酶处理后,可使果汁得率提高 10 %～35 % ,过滤速度提高 4～60 倍(取决于原料种类) ,同时使果汁澄清达到最佳状态。α- 淀粉酶和糖化酶生产中常将α- 淀粉酶和糖化酶用于解决高淀粉含量原料(莲子、马蹄、板栗) 和低淀粉含量原料(苹果、梨、 猕猴桃) 制作澄清饮料的稳定性问题。这类原料中的淀粉在淀粉酶和糖化酶作用下,转化为葡萄糖和可溶的小分子 糖类,从而避免了淀粉颗粒相互结合形成沉淀。柚苷酶和柠碱前体脱氢酶形成柑桔类果汁苦味的主要物质是柚皮苷和柠碱。通过柚苷酶的作用,可将柚皮苷分解为无苦味的鼠李糖、葡 萄糖和油皮素,通过柠碱前体脱氢酶的作用,可以使柠碱前体脱氢,从而防止苦味生成。16 / 20溶菌酶溶菌酶又称胞壁质酶或 N - 乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种化学性稳定的糖苷水解酶,在 pH310 时加热 96℃,15min 仍能维持 87%活力,它的最适 pH 值为 715。溶菌酶的杀菌机理在于能分解细菌细胞壁的肽聚糖,使细胞 壁疏松,细胞内渗透压增高, 最后导致细菌死亡,从而起到杀菌作用。 目前,市场上销售售的饮料,为延长其保质期,大都添加一定量的化学防腐剂。随着生活水平的提高,人们对防腐 剂已是“谈虎色变”。作为天然蛋白质的溶菌酶,既具有防腐作用又具有保健功能,故将它用于饮料加工,部分或完 全替代化学防腐剂,无疑会对饮料工业起到推动作用。生产中将溶菌酶与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用, 效果理想。溶菌酶使用量的确定,既要考虑其成本,又要考虑产品的卫生标准。有人试验蜜桔汁饮料中溶菌酶最低 用量不少于 160 mg/ kg ,黄瓜汁不低于 200 mg/ kg。此外,溶菌酶的防腐效果与饮料介质的 pH 值密切相关。pH 值过大过小,都会钝化酶的活性,因此,生产中应根据原料种类,寻找一个既可保持溶菌酶活力,又不影响饮料口感风 味的最佳 pH 值水平。溶液酶目前在我国饮料加工工业中尚未普及。但随着溶菌酶提取工艺的改进、成本的降低以 及在饮料工艺中技术指标的确立,作为天然防腐剂的一支奇葩,必将发挥重要作用。工艺流程：原料选果―清洗―破碎―榨汁―加热―冷却、加酶―静置―离心过滤―硅藻土过滤―浓缩―脱气灭菌―无菌灌装。 工艺讨论 ①不能使用病害、腐烂果疏加工,因其含有抑制果胶酶活性的物质,故应引起注意。 ②榨出的汁要在 15 min 内加热煮沸,以钝化酶的活性,防止酶促褐变。 ③为提高酶的亲和力,对于含高酯化果胶的苹果汁来说,pH 值调整为 5～6 时酶作用效果最好。 ④因苹果含有一定量的淀粉,因此在酶的使用上除了果胶酶、纤维素半纤维素酶之外,还应添加α- 淀粉酶。 在果胶酶中,应选用果胶裂解酶,因其对苹果汁中甲酯化程度很高的果胶效果特别好,只需要短时间作用即可完 成澄清过程。由于澄清时间短而使整个生产时间缩短,从而可有效地提高产品质量。此外,使用果胶裂解酶,由于没 有新的自由羧基产生,故不易引起二次沉淀。果胶酶与果汁中果胶物质作用机制果胶酶是―群复杂的酶，是诱导酶。商品果胶酶来自霉菌，是混合制剂 。果胶酶制剂对果汁中的果胶物质的 作用机制如下。 果汁中的果胶在聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)的作用下．裂解成可溶性的短链果胶．使果汁的粘度迅遗下 降。 果胶也可以在果胶酯酶（PE）的催化下，水解脱去甲基形成低酯果胶。低酯果胶在聚半乳糖醛酸酶(P G)的催 化下，水解成可溶性短链果胶酸。当低酯果胶的酯化度（DE 值)低于 时，与二价阳离子(如 Ca++，Mg++等等)形 成不溶性的果胶酸盐， 并和果胶中的混浊物一起沉淀，析出。 综上所述，果胶酶在澄清果汁和混浊果汁生产应用中， 关键在于如何控制各种酶的活性，抑制或加强某些酶 的活性，即可使果汁澄清或保持浑浊状态。 混浊果汁中， 混浊物质主要由直径在 10 微米以下的不溶性微细颗粒组成的。其中含有大量的色素．风味物质 和营养成分，是果汁色、香、味、体的重要组成部分。 但是在浑浊果汁中存在着果胶酯酶(PE)，会引起果汁的胶 体破坏，使得混浊物质的微细颗粒失去依托而产生沉淀和清液层。 为了维护浑浊果汁的稳定性，就要破坏导致浑浊果汁中破坏胶体而产生沉淀的因子。果汁生产中酶制品作用效果评价酶制剂的评价方法很多,生产中常用离心试验、酒精试验等方法测定果汁中果胶含量及其水解程度,对于含有淀 粉的原料在加工澄清果汁时,还应用加碘试验来确定果汁中所含淀粉的数量和降解程度。离心试验取不少于 100 ml 果汁放入透明刻度离心管内,离心分离,直接读出同沉淀的百分数,用以反映酶制剂作用的效 果。酒精试验在试管中加入酒精或甲醇、异丙醇,然后取 5 ml 果汁加入试管中,将管口堵住,上下轻轻倒转 3～5 次,使内容 物混合。混合之后,可根据沉絮凝片的大小、数量及沉淀的快慢来判断果胶降解的程度。一般混合 30 秒后方发生 少量凝聚现象的就认为已经进行了有效的净化。碘试验将 10 ml 待测果汁移试管,与 lml 碘―碘化钾溶液(1 g 碘和 20 g 碘化钾溶于 1 L 水中) 充分混合。如果颜 色变蓝,说明果汁中含有未水解的淀粉;若为紫到褐色,则说明已开始水解,红色说明大部分淀粉已经变成了糊精;黄 色说明淀粉已水解为葡萄糖。 ――引自《天津科技大学生物化学与分子生物学研究生结业论文》17 / 20附：叶片的结构表 皮 栅栏 叶 组织 肉 海绵 组织 叶 脉 特 点 具有角质层 排列紧密，无色透明 具有气孔 圆柱行，排列紧密，叶绿体多 形状不规则，排列疏松，叶绿体少 有导管 有筛管 功 保 能 护 组织类型 保护 组织气体交换的“窗口” 适于充分利用阳光 适于下表皮气孔的气体交换 输送水分和无机盐 输送有机物 支持作用 输导 作用营养 组织 输导 组织 机械组织保卫细胞与其他细胞不同：它们的细胞壁厚薄不均匀，靠气孔腔的外壁厚，不易伸展；背气孔腔的内壁薄，较易 伸展。细胞吸水膨胀时，内壁伸展拉长，牵动外壁向内凹陷，使气孔张开；当细胞失水收缩时，内外壁都拉直， 使气孔闭合。18 / 20被子植物的双受精:花粉管里的两个精子分别与胚囊里的卵细胞和极核融合，形成受精卵和受精极核的过程，叫做双受精。双受 精是被子植物特有的受精方式。经过开花、传粉，花粉落到雌蕊柱头上，在柱头分泌物的刺激下，花粉即开始萌发。这时，花粉粒的内壁自萌发 孔突出并逐渐伸长，形成花粉管。花粉管穿入柱头，沿花柱向胚珠方向生长。在生长过程中，花粉粒内的物质也 全部移入花粉管顶端。有 3 个细胞的花粉粒(1 个营养细胞和 2 个精子)都进入花粉管，有 2 个细胞的花粉粒，生殖 细胞进入花粉管后，立即分裂成两个精子。花粉管通过花柱，到达胚珠以后，从珠孔伸进珠心的胚囊，这时，花 粉管的前端破裂，两个精子移动出来，一个精子与卵细胞融合为受精卵(2n)；一个精子与极核(2n)融合为受精极核 (3n)，完成双受精，进入新个体发育阶段。 （大孢子母细胞） 减数分裂 有丝分裂 雌蕊：胚珠中胚囊母细胞(2N)――――→大孢子―――――→胚囊（N）[卵细胞（1 个）、助细胞（2 个）（退化 消失）、反足细胞（3 个）（退化消失）、极核（2 个）] 珠被（2N）――――――――――――――――→种皮（2N） 胚珠→卵细胞（N）+精子（N）―→受精卵（2N）――――→胚（2N） 极核（N，2 个）+精子（N）―→受精极核（3N）―→胚乳（3N） 请解释：1.大孢子分裂成胚囊为何要经历 3 次有丝分裂？ 2.何为助细胞与反足细胞？ 3.被子植物双受精的意义。 1。大孢子，全称是功能大孢子（更准确的说法应该是单核胚囊）经过 3 次有丝分裂形成八核胚囊，即有八个细 胞：卵细胞（1 个）、助细胞（2 个）反足细胞（3 个）、极核（2 个） 3。一方面，通过单倍体的精子和卵子的结合，形成了一个二倍体的合子，由合子发育成新一代的植物体，恢复了 各种植物原有的染色体数目，保持了物种的稳定性；并且将父母本具有差异的遗传物质组合在一起，形成具有双 重遗传性的合子，即加强了后代个体的生活力和适应性，为合子发育为新一代植株可能出现某些新性状，新变异 提供了基础；另一方面，由受精的中央细胞发育成三倍体的胚乳，同样兼有父母本的遗传性，作为新一代的植物 胚期的养料，可以使子代的生活力更强，适应性更广。 被子植物的雄配子体形成的两个精子，一个与卵融合形成二倍体的合子，另一个与中央细胞的极核(通常两个)融合 形成初生胚乳核的现象。双受精后由合子发育成胚，初生胚乳核发育成胚乳。 被子植物胚囊中极核同卵一样受精产生了具有父本和母本遗传性的通常是三倍体的胚乳，由这种胚乳“哺育”胚 可能使后代更加巩固它双亲的特性并更富有生命力，因此有人认为双受精是被子植物繁盛的一个重要原因。 配子配合前的阶段可见：①花粉萌发和花粉管在花柱中生长。花粉由各种媒介传到雌蕊的柱头上后，立即与雌蕊 发生相互作用。在亲和的情况下，花粉萌发长出花粉管并钻入柱头。花粉管进入柱头后，继续在花柱中生长。花 粉管依赖其末端生长，当生长到一定长度后，原来在花粉中含有的物质全部集中到花粉管的前端。在生长过程中 花粉管除利用自身的贮藏物质外，同时也可能从花柱中吸收营养。②花粉管进入胚囊和释放内容物。花粉管伸入 子房后，沿子房内壁或胎座继续生长，直达胚珠，经珠孔进入胚珠，最后到达胚囊。花粉管沿一定道路的生长， 一般认为是受助细胞分泌的化学物质的吸引。 通常把精子与卵的融合称为配子配合，而精子与极核的融合称为三核并合。这两种融合是差不多同时发生的。 1973 年，美国植物胚胎学家 W.A.詹森提出了被子植物双受精作用中精子转移至卵细胞和中央细胞的模式图。精子19 / 20先释放至退化的助细胞(质膜已经消失)，由于花粉管内容物释放时的力量，两个精子被分别转移至卵细胞的质膜和 中央细胞的质膜处并与之接触，接触处的质膜溶解，两个精核分别转移至卵和中央细胞的细胞质中。按詹森的精 子入卵模式，只是精子核转移至雌性细胞中。实际上在被子植物的受精作用中，精子的细胞质是否参加迄今尚无 定论。被子植物雄核与雌核融合的基本程序是：①雄性核与雌性核接触。②雄性核和雌性核之间的核膜融合。③ 精子核的染色质在卵核内分散和出现雄性核仁。④雄性核的染色质与雌性核的染色质混合。⑤雄性和雌性的核仁 融合为一个大的核仁。精核同极核（或次生核）的融合过程与精核同卵核的融合程序基本相同。 从花粉落到柱头上至雄性和雌性核完全融合所经历的时间，因植物不同而异。间隔期短的只有十几分钟，长的可 达一年。大多数植物为几小时至 48 小时之间。精卵融合与精子同极核融合通常是同时发生的，也可能精子同极核 的融合更早发生，而且一般更快完成融合和进入分裂。这样胚乳的发育早于胚，可以为胚的发育提供必需的营养 物质。传粉至受精间隔期的长短还受环境因素，特别是温度的影响。温度对花粉萌发和花粉管的生长速度有直接 的影响。 在正常的情况下，一个胚囊只接受两个精子，但是有时由于不止一个花粉管进入或是由于一个花粉管中形成不止 一对精子，于是胚囊中出现有多于一对精子的现象。胚囊中额外精子的存在将有可能引起下面两种异常受精作 用：①多精入卵。有两种不同的情况：一种是进入卵中多余的精子在卵中退化，另一种是附加的精子也与卵核融 合，这种异常的受精形式只在极少数植物中有细胞学的证据。②额外的精子与胚囊中的其他细胞受精。这种现象 曾在一种慈菇属植物报道过。这种植物的助细胞形态上与卵细胞相似，有两个花粉管进入胚囊并放出额外的两个 精子，在受精后的胚囊中有时看到 3 个原胚存在，并有两个花粉管在胚囊的上部。因此推测助细胞与进入的额外 精子受精而产生了多胚。 2012 年 4 月 21 日修订 第二版20 / 20}