论文:反相高效液相色谱法测定全血中环孢素A的浓度-中大网校论文网反相高效液相色谱法检测除虫菊酯
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摘要：天然除虫菊酯具有高效、低毒、低残留等优良杀虫特性，对人、温血动物和环境没有危害，已成为当今无公害生物杀虫剂之一。天然除虫菊酯含有6种有效成分，但结构相似，分离困难。本研究以除虫菊酯精油为原料，通过优化反相高效液相色谱分离条件，建立能够准确检测除虫菊素六个成分的反相高效液相色谱分离纯化方法 ,为天然除虫菊酯除虫菊酯检测提供了准确的判断标准,为阐明天然除虫菊酯 6种单一有效成分的杀虫机理研究奠定了基础 ,也为除虫菊酯6种单一有效成分纯品的生产提供了重要的方法参考。 http://www.paper51.com
关键词：液相色谱 &除虫菊酯& 检测　研究 内容来自论文无忧网 www.paper51.com
High Performance Liquid Chromatography pyrethrins http://www.paper51.com
Guo Yuan&&&& &Supervisor: AI Hua-lin http://www.paper51.com
&(Yunnan Yuxi Teachers College Resourcesand Environment paper51.com
06 agricultural classes) http://www.paper51.com
Abstract: Natural pyrethrins with high efficiency, low toxicity and residue andother excellent insecticidal properties, human, warm-blooded animals and theenvironment is not harmful, has become one of today's pollution-free biologicalpesticides. Natural pyrethrins with 6 active ingredients, but structurallysimilar, separation difficulties. In this study, pyrethrins oil as rawmaterial, by optimizing the HPLC separation conditions, the establishment wasable to measure the six components Pyrethrins phase high performance liquidchromatography separation and purification methods for the detection of naturalpyrethrins pyrethrins provides accurate The judging criteria for the 6 toclarify the natural pyrethrins single mechanism of insecticidal activeingredients laid the foundation for the pyrethrins six kinds of single pureactive ingredient production provides an important method of reference. paper51.com
Keywords: liquid chromatography&& pyrethrins& test &research copyright paper51.com
1 引言 paper51.com
除虫菊 (Ch rysanthem umCineraraef lium )为菊科多年生草本植物 ,是目前世界上唯一集约化种植的杀虫植物。从除虫菊花中提取的天然除虫菊酯具有高效、 低毒、 低残留等优良杀虫特性。 对人、 温血动物和环境没有危害 ,已成为当今无公害生物杀虫剂的研究热点之一[1]。除虫菊的杀虫活性物质除虫菊酯 (pyrethrins)包括除虫菊酯 Ⅰ、 Ⅱ,瓜叶菊酯 Ⅰ、 Ⅱ 和茉酮菊酯 Ⅰ、 Ⅱ共 6种杀虫有效成分。但由于结构相似 ,要同时制备出 6种化合物的标准品非常困难。虽然已有研究表明利用毛细管电色谱法、 胶束电动色谱法、 正相高效液相色谱法，可以分离、 检测除虫菊酯 ,但均具有设备及色谱分离柱不普及、 条件要求高、消耗大及操作繁琐等缺点[2]。而利用反相高效液相色谱分离、 检测天然除虫菊酯 6种有效成分 ,分离过程中始终存在瓜叶菊酯和茉酮菊酯这两类峰不能有效分离的问题。 http://www.paper51.com
20世纪50年代以来，国际上出现了大量分析鉴定天然除虫菊醋的方法，美国AOAC标准是最早用于除虫菊醋检测的参考标准[3]。随着色谱技术的发展，先后出现了气相色谱法、液相色谱法以及联用技术等简单、快速的检测分析手段。 copyright paper51.com
此外 ,目前还没有制备天然除虫菊酯 6种单一标准品成分的详细研究报道，也没有除虫菊酯单一成分的标准品出售。随着人们健康意识的不断增强，对产品的安全性要求也越来越高，进而对残留量的限制要求也越来越严，因此对残留检测技术的需求也在不断提高[4]。 内容来自www.paper51.com
高效液相色谱法是20世纪70年代迅速发展起来的一项高效、快速的分离分析检测技术。由于除虫菊醋类具有挥发性及热不稳定性，而气相色谱方法需要较高的气化温度，在进样后的气化过程中立体结构易发生变化，所得数据可靠性差，因此用高效液相色谱方法分析除虫菊醋类具有一定的优势[5]。Bushway等利用正相HPLC 检测天然除虫菊醋6种有效成分，该方法已成为美国AOAC检测天然除虫菊醋残留的标准[6]。反相HPLC检测天然除虫菊醋，通过不断改变流动相比例、流速以及检测波长等条件，有效地分离了天然除虫菊醋6种有效成分，并能有效地检测6种单一成分[7]。如Wang等利用反相HPLC配带二级管阵列检测器有效地对天然除虫菊醋6种有效成分进行了分离与检测。段伟等采用二元流动相梯度洗脱，也成功地检测和分离纯化了天然除虫菊醋6种有效成分。所以说用在检测除虫菊酯上运用液相法具有其他方法不具备的优势[8]。 paper51.com
本实验采用反相高效液相色谱开展了天然除虫菊酯的分离和 6种单一有效成分的制备研究，用实验来证明使用液相色谱法来检测除虫菊酯比较理想。以期为天然除虫菊酯的残留检测和单一成分的杀虫机理研究奠定基础。 内容来自论文无忧网 www.paper51.com
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反相高效液相色谱法测定雷米普利胶囊的含量及有关物质
□ 郑国钢 李会林
摘　要:目的采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定雷米普利胶囊的含量及有关物质。方法色谱柱为Alltech AlltimaC18柱（250mm×4.6mm,5μm）,流动相为缓冲溶液（在1000mL的2%高氯酸钠溶液中加0.5mL三乙胺,用磷酸调pH至2.2）-乙腈,流速1.0mL/min,检测波长为210nm。结果雷米普利质量浓度的线性范围为20.7～207.0μg/mL（r=1.0）;平均回收率为99.6%,RSD为0.7%（n=9）;日内和日间精密度RSD分别为0.4%和0.9%（n=6）。结论RP-HPLC法简便、快速,准确、可靠。
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周一至周五
9：00&22：00
反相高效液相色谱法同时测定来曲唑含量及有关物质
　　摘要　目的：采用反相高效液相色谱法同时测定来曲唑含量及有关物质。方法：使用Agilent1100型高效液相色谱仪和ZORBAXXDB-C18色谱柱(150×4.6mm，5μm)，在流动相为水：乙腈=60：40、流速为1.0mL／min、紫外检测波长为230n／n的条件下测定来曲唑含量及有关物质。结果：来曲唑含量测定的线性范围为2～100μg／mL，相关系数为0.99996。日内和日间精密度均良好(RSD<1.0％)，且杂质和中间体对来曲唑及含量测定没有影响。结论：本方法测定来曲唑含量及有关物质操作简便，结果正确，灵敏度高。 中国论文网 http://www.xzbu.com/6/view-2464034.htm　　关键词　来曲唑　有关物质　RP-HPLC　含量测定 　　中图分类号：TQ460.72；O657.72　文献标识码：A　文章编号：10)03-0136-02 　　 　　来曲唑(letrozole)是Novartis公司开发上市的一种非甾体类芳香酶抑制剂，主要用于治疗晚期乳腺癌。在美国药典(USP)27版中，来曲唑含量和有关物质测定均采用高效液相色谱法(HPLC)梯度洗脱法。但在国内，来曲唑含量测定采用容量滴定法，而有关物质测定采用HPLC法。笔者在实际工作中经对上述两种方法进行比较，建立了更为简便的HPLC方法，可以同时进行来曲唑含量及有关物质的测定。经方法学验证，证实此方法简单、灵敏，专属性强，定量结果准确。 　　 　　1　仪器与试药 　　 　　1.1仪器 　　Agilent1100型高效液相色谱仪，包括G1314AVWD检测器、G1315BDAD检测器、G1311A型四元泵、G1329A型自动进样器、G1316A型柱温箱和G1322A型脱气机。 　　 　　1.2试药 　　来曲唑对照品(USPreferencestandard，CATNO：35697；LOT：FOB170；USPROCKVILLE,MD)，来曲唑杂质对照品(USPreferencestandard，CATNO：1356982：LOT：GOD298；USPROCKVILLE,MD)，来曲唑(本公司研制样品)及各中间体(本公司研制)，乙腈(色谱纯)和水(超纯水)。 　　 　　2　方法与结果 　　 　　2，1色谱条件 　　色谱柱：C18(ZORBAXEclipseXDB-C1mm，5μm)；流动相：乙腈：水--40：60；检测波长：230nm；流速：1.0mL／min；进样量：20μL；稀释剂：流动相。 　　 　　2.2波长的选择 　　根据来曲唑与各杂质及中间体在DAD上的光谱扫描可以看出，来曲唑及其杂质在230～240nm有较大吸收，而苄唑在240nm处的吸收较小且对氟苯腈在240nm处几乎没有吸收。考虑以上杂质(即中间体)因素，选定波长为230nm。 　　 　　2.3专属性试验 　　分别取来曲唑对照品、来曲唑杂质及各中间体适量，用溶剂溶解、稀释制取每毫升含0.01mg的溶液，进行定位。另取来曲唑对照品、来曲唑杂质及各中间体配制成含来曲唑8μg／mL及含其它各组分4μg／mL的溶液作为专属性试验用溶液。进样测定结果显示，主成分峰不脱尾，理论塔板数大于5000，且能与4个中间体和杂质完全分离，各峰之间的分离度均大于1.5，各组分出峰时间均在主成分峰保留时间2.5倍以内，溶剂对测定无干扰，证明本色谱系统的专属性良好。 　　此外，再分别取来曲唑精制品适量，分别用2％过氧化氢溶液、1mol／L盐酸溶液和1mol／L氢氧化钠溶液充分浸润后放置24h，在60℃下烘干；另取来曲唑精制品适量，在紫外灯下照射36h，进行破坏试验。测定结果显示，本色谱条件可以将各破坏条件下的降解产物与主成分完全分离，由此进一步证明本色谱系统的专属性良好。 　　 　　2.4最低检测限 　　取来曲唑样品适量，用流动相溶解并稀释配置成一定浓度的溶液进行测定，测得其最低检测限为0.2ng。 　　 　　2.5线性范围 　　取来曲唑样品20mg至100mL容量瓶中，用稀释剂溶解，摇匀，精密量取1、3、5、7、10、15、25、35、50mL分别置于100mL棕色量瓶中，用稀释剂定容，摇匀。取上述溶液在选定的色谱条件下，进样20μL，记录色谱图，根据峰面积计算，测得数据经线性回归得回归方程：y=113.91x+24.396，r=0.99996，说明来曲唑在2～100μg／mL浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。 　　 　　2.6精密度和稳定性试验 　　精密吸取来曲唑样品溶液(浓度为10μg／mL)20μL，注入液相色谱仪，重复进样5次，记录色谱图，发现来曲唑样品峰的RSD值为0.04％。连续测定3d，日间精密度RSD为0.24％。 　　另外，在第0、第2、第4、第8、第16和第24h分别取10μg／mL的来曲唑样品溶液20μL注入液相色谱仪。记录色谱图，结果见峰面积基本没有变化，RSD为0.22(N=6)，表明样品溶液在24h内稳定性良好。 　　 　　2.7有关物质测定 　　取来曲唑样品10mg至100mL容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取适量，加稀释剂制成每1mL中含1μg的溶液作为自身对照溶液。另外，取来曲唑对照品和来曲唑杂质A适量，用稀释剂制成浓度为每1mL含10μg来曲唑和每1mL含2μg来曲唑杂质A的溶液作为系统适用性溶液。分别精密量取供试品溶液与自身对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，且其中来曲唑和来曲唑杂质的分离度应大于1.5。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，则除溶剂峰外，杂质A的峰面积不得大于自身对照溶液主峰面积的0.3％，其它单个杂质不得大于自身对照溶液主峰面积的0.1％，其它总杂质不得大于自身对照溶液主峰面积的0.3％。3批样品测定结果，总杂质分别为0.10％、0.07％和0.03％。 　　 　　2.8含量测定 　　取来曲唑样品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1mL中约含10μg的溶液，精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取来曲唑对照品，同法测定，按外标法以峰面积计算样品含量。结果显示，3批样品中的来曲唑含量分别为99.06％、98.76％和98.45％。 　　 　　3　讨论 　　 　　按USP27版方法使用梯度洗脱法测定来曲唑含量及有关物质，基线有一定的漂移，影响杂质的判断，且色谱柱也需采用非常规的柱子，成本较高，操作较烦琐。国内采用滴定法测定含量，用色谱法测定有关物质，检测的条件不一致，也较繁琐。笔者采用本文方法测定来曲唑含量和有关物质，可以达到满意的效果。经方法学研究，此法简便，结果准确，灵敏度高。 　　在各专属性试验中，均采用二极管阵列检测器检测来曲唑峰的纯度，结果发现纯度系数均良好，证明本色谱系统的专属性良好。
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ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
蛋白质与蛋白质组学实验指南 第五章
试剂、试剂盒
仪器、耗材
1.进行空白或对照层析谱分析（即在步骤①中不加样）。一般这是进行一天层析工作的开始。下面是推荐使用的用于 RP-HPLC 系统评估的标准色谱条件。
（1）线性梯度：从 0~100% 的溶剂 B，溶剂 A 是 0.1% 的 TFA 水溶液 (体积分数），溶剂 B 是含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液；
（2）梯度率：1%B/min(即 60 min 内溶剂 B 从 O 到 100%);
（3）流速：lml/min(4.6 mm 内径层析柱）；0.lml/min(2.1 mm 内径层析柱）
（4）温度：40~45°C。
2.标样蛋白（对照组）色谱分析。在步骤①中，对于 4.6 mm 层析柱来说，注入 1OOul 标样蛋白（0.lmg/ml)(即每标样蛋白为 10ug，流速为 lml/min 时 1ug=1OOmAU); 对于 2.1 mm 层析柱，加入 l0W 浓度为 0.lmg/ml 的标样蛋白，即每种标样蛋白 1ug(在流速为 0.lml/min 时，1ug=100mAU)。
3.消化肽的混合物色谱分析，用与步骤②中相同的条件。
4.样品的收集。在有盖的聚丙烯微量离心管中收集洗脱下来的肽峰，盖紧盖子，于-20°C 保存，以便进一步研究。如果是人工收集样品，检测器的流动池与出口管间的死体积必须精确计算。
5.对于要长期保存的层析柱，先将层析柱冲洗干净，然后储存于亲水性有机溶剂中（如 50% 丙酮水溶液）。对于过夜保存的层析柱，可以用溶剂 B 以非常低的流速冲洗层析柱（如流速为 50ul/min)。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、毛细管液相色谱系统的构造
下面所用的溶剂传送系统（见图 5.10，AHewlett-Packard HP1090M 液相色谱仪）被用作「辅助（slave)」泵来形成微梯度。
二、流体的形成
1.为使通过毛细管柱的流速精确到0.05~20ul/min，并能形成可重复的梯度，可以安装一个预加样分流器（l/16in[1.59 mm] 的 T 形管），引导 95% 以上的溶液通过一个长约为 1OOcm(内径 0.1OmmX 外径 0.26 mm) 的溶合桂胶管流人废液池。
2.直接将毛细管柱连接到带有0.2~1.Oul 内置样品转子的 Rheodyne7520 型加样器或装有0.5~50ul 加样环的 8125 型加样器上。
3.将层析柱的流速精确设置到 0.4~4ul/min 可通过调节熔合硅胶管到废液池的长度或改变栗的流速（100~500ul/min) 来完成。
对于这种分流的方法，定期（如每天）监控层析柱的实际流速是很重要的。可以通过在出口处安装一个 10ul 的色谱注射器，对层析柱中液体的弯月面的推进进行精确计时。有关该系统构造中所提到的各种部件及其供货商的详细情况在「2.1 材料」中列出。
三、UV 检测器
1.采用 ThemoGalactic/SpectraPhysics 正向光学扫描检测器，以 214nm 吸收值来检测毛细管 HPLC 系统的洗脱情况，该检测器装有一 U 形纵向毛细管流动池（路径长度 6 mm，容积约 26.5 ml)。
2.Spectra Focus 软件传输到个人电脑上，或者同时用多波长模式（195~340 mm，5 mm 间隔）来记录。
3.对于毛细管液相色谱/质谱仪（LC/MS) 联用，用一根 50 cm 长的熔合硅管 (内径 0.05 mm X 外径 0.19 mm) 将 UV 检测器直接与电喷雾入口连接起来。
该管替代了标准不锈钢电喷雾针，可一直延伸到喷射针的顶端。
4.对于纳流（nanoflow) 毛细管 HPLC, 纳流端直接与出口相连。
四、毛细管柱的构造
大量的文献已介绍了构成微柱的多种物质，如 Teflon 管（Ishii，etal，1977)、玻璃不锈钢（Chervet，et al，1989) 以及有聚酰亚胺外壳的溶合桂管（Yang,1982)。我们一般采用后者来制备微柱。与上面所提到的其他材料相比，具有聚酰亚胺外壳的熔合硅管具有许多显著的优点（见表 5.8)，如具有灵活性、易于处理和可通透性，且有商品化的各种不同内径和外径的型号，其价格相对低廉。
下面以 250 mmX0.20 mm 内径的层析柱为例，分步介绍0.1~0.32 mm 内径熔合硅微柱的组装过程。
1.切两段不同长度的聚酰亚胺熔合硅管，其中一段长为 250 mm(内径 0.200 mm，外径0.340 mm) 作为柱体，另一段长为 20.0 mm(内径 0.050 mm X 外径 0.190 mm) 作为层析柱的出口管。
注意：在填充层析柱的过程中，要戴防护眼镜，并遵循推荐使用的安全程序。
（1）用悬浆填充法将色谱支持物填充到薄壁毛细管的过程中，毛细管因受到高压（约 40MPa) 而易于折断。例如，在本实验中，内径0.32 mmX 外径 0.540 mm 和内径 0.200 mmX 外径 0.340 mm 的熔合硅管可耐受高达 45MPa 的局压，而内径 0.320 mmX 外径 0?450 mm 的管子在同样的压力下却容易折断，其填充压不得超过 5MPa。最后，还必须注意使用厚壁的熔、合硅管，因其可以以较高的压力填充，从而能够使层析柱获得良好的工作效率。
（2）为避免毛细管末端参差不齐，可以用蓝宝石刀来代替较为普通的玻璃刀。末端参差不齐的管子将会导致玻璃料定位不精确。
（3）用 Teflon 管来连接熔合硅管（见图 5.10)。由于来自不同厂家的熔合硅管的外径有细微的差别，通常加固这些接头以达到紧密连接。一般可以方便地采用两个钳子来夹紧内径稍大的 Teflon 管。
2.用一较短（50 mm) 的溶合桂管（内径 0.32 mm 或 0.20 mmX 外径 0.45 mm 或 0.34 mm) 作为圆盘切割器，从一大张 PVDF 膜上切下 PVDF 封管膜片，即通过将 PVDF 膜置于硅胶隔膜上，然后在 PVDF 膜上打孔而制成 PVDF 封管膜片。一般用柱的出口管将 PVDF 封管膜片插入到微柱中，约 1Omm 深。
另外，有很多有孔膜物质可用作微柱的封管膜片，包括 Zitex 膜（Davis 和 Lee，1 卯 2)、玻璃纤维滤纸（Davis 和 Lee，1992)、亲水性的聚偏二氟乙稀（PVDF) 膜（Moritz 和 Simpson,1992a，1992b)。在本实验中，采用了 0.45um 的多孔性亲水 PVDF 膜。
3.永久固定微柱体和微柱出口管：在两管接头处滴一小滴预处理过的环氧树脂。
环氧树脂已部分聚合或用加热枪处理使其塑化，以增加其黏度，因此不会渗人毛细管造成阻塞。
五、层析柱的填充
当将 PVDF 封管膜片固定好，熔合硅毛细管柱制备完成，便可以开始用悬浆填充法的程序来填充微柱。
1.用带有标准的内置液相色谱柱（0.5 mm 内径的流通孔以及 l/4in(0.635 cm) 柱末端接口）的中空 50 mmX2 mm 内径的玻璃衬里不镑钢管制备一个悬浆槽。
2.用 vespel 材料/石墨和手拧螺母将熔合硅微柱与标准的 1/4111 液相色谱末端接口连接起来。
3.在 I.5 ml 聚丙婦管中将反相桂胶浆在 n—丙醇（Aomg/zoojul) 中超声处理 15 min。
4.在填充层析柱之前，先按标准色谱柱填充法，用填充溶剂（n_丙醇）在高压下（40MPa) 填充毛细管柱。
这一步使用填充溶剂预填充微柱，可检测系统的密封性。
5.从层析柱填充机和微柱上将悬桨槽卸下，倒空，再复位，装入备好的 150ul 的反相硅胶浆混合物。
6.在恒压 40MPa 下，装柱 20 在相同压力下再用 50% 甲醇溶液固定 20 min，然后就可以给层析柱减压了。
7.小心地拆下层析柱，将其顶端和底端都插入硅胶隔膜中，以使之密封。
仪器、耗材
一、用于 RP-HPLC 纯化的大分子非极性多肽或蛋白质样品的制备
1.将多肽样品（如果蛋白质是通过固相化学合成法得到的，质量在 30~50 mg 之间，尽管其量低至 mg 级，方法与其他来源的蛋白相似）在微量离心管中用洗脱液溶解（使用溶液 B，如果样品在 30~50 mg 之间，则应用 1ml 溶液 B 来溶解；如样品量更少，则相应减少溶液 B 的用量）。
根据多肽或蛋白的疏水性，如疏水性较大，则应提高缓冲液中乙腈的浓度，一般含有 0.1%TFA 的 60% 乙腈水溶液可以满足要求。对可溶性很差的多肽，则需使用含有 0.1%TFA 的 90% 乙腈水溶液，或许也必须使用去垢剂、脲、盐酸胍或 60% 甲酸溶液。详细研究表明（Heam，1991a)，对于 RP-HPLC 中所用的许多大分子量多肤或小蛋白，溶解的最佳 TFA 浓度一般为 25 mmol/L。
2.用微量离心机离心粗提样品，2000 g 离心 5 min，确保所有不溶物和沉淀在上样則全部被除去。
方案 4、方案 5、方案 6 中给出了一些附加的实验程序，这些实验程序可获得相当高的分辨率。
二、大分子量非极性多肽和蛋白的分析
分析只需少量的样品（50ul)。
1.采用不同型号的 RP-HPLC 吸附剂，在不同洗脱条件下，准备 5~10 份样品来评估分离条件（如不同的流速、温度或梯度斜率参数）。
2.每次进样约为 5ul。
三、大分子量非极性多肽或蛋白的纯化
1.在每个盛缓冲液的容器中以 100 ml/min 的速度通氮气 20 min。
该步骤的目的是除去所有气泡，防止其进人 HPLC 体系。当体系在运打时，氣气的速度可减小到 20 ml/min。
在整个 HPLC 体系中，保证没有气泡是很重要的。系统中的气泡将导致缓冲液流速的不稳定。如果用新配置的缓冲液灌满所有管道，则泵的压力传感器应该指示稳定的柱后压。在连接好层析柱以前，每个泵抽取一些缓冲液，从而可在出口处检查流速的稳定性。
2.接好色谱柱，先用洗脱液以 6 ml/min 的流速洗 15 min，以确保除去层析柱中的杂质，然后就可以加样了。
3.启动数据采集软件，检查检测器是否被校准到所需波长。
对于含有芳香侧链氨基酸的多肽可用 254nm 的波长，其他情况则可用 230nm 波长。配有光电二极管阵列检测器为获得不同的、衍生的、较髙阶的谱线以及有效的峰轨迹跟踪算法提供了灵活的选择。
4.在电脑上设置溶剂洗脱梯度。
一般使用 60 mm 内梯度变化为 2%?98% 的缓冲液 B。通常在分离邻近的峰时采用非常平缓的梯度。
5.保持上样缓冲液 A 的流速在 6 ml/min，用手动加样器上样。
6.当出现多重峰时（通过色谱的高吸收值），在试管中收集小片段（1~2ul) 作进一步分析。如图 5.11 所示。
7.将收集到的组分分装到样品管中，以进行下面的分析，包括 RP-HPLC、高效毛细管电泳（HPCZE)、毛细管电色谱（CEC) 或质谱（ESI-MS 或 MALDI-MS) 等，这些分析步骤可以常规实施。一般而言，每个样品应保留 50ul 用于评估峰纯度等，而一次进样 30ul 通常可满足所有的分析需要。
8.如对收集到的组分进行 RP-HPLC 分析，要重复步骤①?⑥来准备 HPLC 体系，但应以稳定的分析柱代替预制柱，并将流速降低到 1ml/min，在波长为 214nm 处进行检测。
如要进行快速分析分离，分析时洗脱时间可缩短到 25 min，重新平衡的时间为 10~15 min，以确保系统为下一次分析作好准备。
9.当制备好分析所用的组分时，就可以将样品置于管中，在冷冻干燥机上冻干样品过夜。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、流动相的配制
1.分别配制 1L 的洗脱液 A(弱流动相）和洗脱液 B(强流动相）。例如：
洗脱液 A 为 0.1%TFA 水溶液
洗脱液 B 为含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液要点：用于蛋白质测序的 TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于 RPHPLC 样品的洗脱。
有机溶剂和水必须分别用两个量筒来测量，然后再混匀，因为混合时体积将会减小，最多可减少 3 〇 ml/L 总体积（由溶剂的特性决定）。如果没有按正确方法配液，将会导致流动相成分比例的偏差。
实验提示：在用水和有机溶剂洗脱时，为补偿梯度洗脱中基线的变化 (因为在短波长下，大多数有机溶剂吸收的光比水多），要降低洗脱液 B 中离子对试剂的量（TFA，H3P04)。与洗脱液 A 相比要降低 10%~15%，从而产生平坦的基线（Dolan，1991)。
2.在容量瓶中，用 Teflon 包被的磁力转子搅拌将溶液混勻。
警告：在任何情况下都不能用封口膜封闭装有 RP-HPLC 洗脱液的长颈瓶或量筒。因为有机溶剂与洗脱液中酸性离子对试剂会溶解封口膜，使色谱出现非特异的峰。
3.用 0.2ul PTFE 过滤器先过滤洗脱液 A，然后过滤洗脱液 B。过滤洗脱液将会增加层析柱的使用寿命，有助于排出气泡。
4.用塞子塞紧装有洗脱液的瓶子，避免有机溶剂的挥发。
二、肽样品的制备
1.先用终体积的一半的洗脱液 A 溶解样品以达到所需浓度。如果样品不容易溶解，加入少量（&25% 总体积）溶液B。
少量强流动相将造成样品的预洗脱，洗脱程度由样品环的大小、柱内径、流动相梯度的起始成分决定。
2.检验样品纯度，如果含有不溶的乳光物质或固体颗粒，则要用0.2)umPTFE过滤器过滤样品，或者离心后取上清液。
要点：如果样品未完全溶解就不能加样，否则会堵塞加样器和层析柱。
3.样品在不用时存放于4°C或-2°C，要依保存时间和使用情况而定。肽和蛋白质在室温下会发生降解。
要避免样品的反复冻融。将样品分装成小包装，一20°C 保存，每次取出一次所用量。
三、RP-HPLC纯化固相合成的多肽
1.检测HPLC系统设备
以下的检测能评价柱床完整性[低完整性与峰的分裂、峰的前伸(fronting) 或拖尾有关]和柱性能（根据塔板数），也能检测柱的寿命(如果以相同的间隔时间重复检测），并评估柱填充物批与批之间的差异。
（1）用空白对照进样（进洗脱液A)并用与多肽或蛋白质相同的洗脱梯度（100%A—100%B) 进行洗脱，如果出现「鬼峰」（即假峰）就重复此操作。该步骤旨在清洗前次分离多肽和蛋白时可能遗留下的杂质。
（2）用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积（或用其他不会导致交叉影响的溶剂）。
（3）在合适的检测温度下采用梯度法来检测柱性能。例如采用下面的RP-HPLC测试混合物：
1.5 g/L二甲基邻苯二甲酸
1.5 g/L二乙基邻苯二甲酸
0.lg/L联苯
0.3 g/L邻三联苯
3.2 g/L邻苯二甲酸二辛酯（用甲醇溶解）
（4）通过梯度法和标准肽样品检测柱性能，如采用Mant和Hodgs(1991b)所描述的方法。
2.用RP-HPLC 分析多肽粗制样
（1）在正式分析样品之前，要先在同样条件下至少做一组的空白对照。
如果出现峰，则重复该步骤。
（2）以分析型 RP-HPLC的程序分离粗制样（约loo^g)。按以下信息框中列举的实验条件，根据纯度、色谱峰图、洗脱条件来评估样品。
（3）鉴定所要纯化的成分。
3.准备RP-HPLC
（1）按列出的实验条件，用制备型RP-HPLC程序来分离粗制肽混合物（约25?IOOmg)。
为避免检测器发生过载，一般用230?280nm的波长，但是在溶解粗制肽时，所加入的少量化学杂质（在SPPS步骤中使用）则会在该波长范围内有非常强的吸收。应先进行一次预分离并在214nm处检测，以确定主要肽产物的确切保留时间—虽然会有几微克的样品损失，但也是值得的。
（2）收集HPLC组分（3~7.5 ml)。
4.进行分析性RP-HPLC
（1）用分析性RP-HPLC对所收集到的组分（30~50ul）进行分析。
分别对空白对照、粗制样溶液、目标组分及其前两个组分和后两个组分进行分析。
（2）通过比较纯化后成分的保留时间和粗制样中靶成分在色谱的保留时间，来确定收集到的含有在有效纯度范围内（即&95%) 目的蛋白的组分。
（3）将得到的多肽定量分装在微量离心管中，一20°C保存，用于进一步研究。
5.进一步分析
（1）将纯度在 95% 以上的样品冻干。该纯度是通过分析型RP-HPLC分离、尚效毛细管电泳（HP-CZE)(Sitaram，etal，1999;Hearn，etal，2002) 或毛细管电层析（HP-CEC)(Walhagen，etal，2000a，2000b，2001) 或其他适当的高分辨率分析技术评估出来的。
（2）对最纯的组分进行离线（off-line)或在线（on-line) 电喷雾离子化质谱（ESI-MS) 分析，以确定合成的肽或蛋白是否正确，或者正确鉴别所要纯化的成分。
如果得到的样品质量与预期的不同，则有必要用 ESI-MS 再检测一下其他组分。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、流动相的配制
1.配制缓冲液 A(弱流动相）和缓冲液 B(强流动相）各 1L，例如：
缓冲液 A:0.1%TFA 水溶液。
缓冲液 B:0.09%TFA 的 2-丙醇溶液。
要点：用于蛋白质测序的 TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于 RPHPLC 样品的洗脱。
2.在备好的量筒中用 Teflon 包被的磁转子将溶液搅拌均勻（时间视体积而定）。
3.用 0.2ul PTFE 过滤器过滤缓冲液 A 和 B。
4.将洗脱液瓶用塞子封闭，以防止有机溶剂挥发。
二、多肽和蛋白质样品的制备
1.检查样品的纯度。
2.如果存在不溶的蛋白、固体颗粒，则要用 0.2ul PTFE 滤膜过滤，或者离心样品后取上清液。
三、用 RP-HPLC 进行蛋白质脱盐
1.检测 HPLC 系统。
（1）进空白样（用洗脱液 A 进样），先在 100% 洗脱液 A 中等梯度洗脱，再在 100% 洗脱液 B 中等梯度洗脱，所有条件都与蛋白样品相同。
（2）用硫脲或硝酸钠（或其他不会发生交叉反应的溶液，例如盐溶液）来测量柱的死体积，从而确定盐的洗脱时间。
2.蛋白质脱盐。
（1）将含盐样品注入反相柱中，用 100% 洗脱液 A 洗脱，盐洗脱时间接近或正好是柱的死时间。
类似的方法可用于洗脱脲、盐酸胍等或样品中的许多低分子量成分，以备用于还原烷基化反应后或溶解/重折叠研究。它们来源于化学衍生反应、主链解离或部分还原反应、亚基-亚基解离，此外还可能来源于离子交换色谱、生物特异性亲和色谱或疏水相互作用色谱。
（2）用 100% 洗脱液 B—步洗脱或多步梯度洗脱蛋白。
（3）收集含蛋白的组分，以便进一步分析。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、配制流动相
以下因素与用于洗脱含有肽及蛋白质的样品的流动相的制备有关。
1.配制各 1L 的洗脱液 A(弱流动相）和洗脱液 B(强流动相）。例如：
洗脱液 A:0.1%TFA 水溶液
洗脱液 B: 含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液（体积分数）
有机溶剂和水必须分别用两个量筒来量，然后再混匀，因为混合时体积将会减小，最多每升可减少 30 ml(具体由溶剂的特性决定）。如果没有按正确方法配液，将会导致流动相成分比例的偏差。
当用水/有机溶剂进行梯度洗脱时，为补偿基线的变化（因为有机溶剂在短波下吸收更多的光），通常要减小洗脱液 B 中的离子对试剂的量 (TFA，H3P04)。与洗脱液 A 相比，一般减小 10%?15%(Dolan,1999)，以得到平坦的基线。
要点：用于蛋白质测序的 TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于 RPHPLC 样品的洗脱。
2.在有塞量筒内摇动混匀溶液，或用 Teflon 包被的磁转子搅拌均勻（时间依溶液体积而定）。
注意：在任何情况下都不能用封口膜封闭装有 RP-HPLC 洗脱液的长颈瓶或量筒。因为有机溶剂和洗脱液中的酸性离子对试剂会溶解封口膜，使色谱出现非特异的峰：
3.用 0.2um PTFE 过滤器过滤洗脱液 A 和 B。
过滤洗脱液可延长柱寿命，并有助于排气。
4.未用的洗脱液瓶子用塞子密封，以防有机溶剂蒸发。
二、蛋白质样品的制备
1.用终体积一半的洗脱液 A 溶解样品，达到所需浓度。如果样品不易溶，则加人少量（&25% 总体积）洗脱液B。
少量强流动相将造成样品的预洗脱，洗脱程度由进样环大小、柱内径、流动相梯度的起始成分决定。
2.检测样品纯度。如果含有不溶的乳光物、蛋白质或固体颗粒，则要用0.2/um PTFE滤器过滤样品，或者离心取上清液加样。
警告：如果样品未完全溶解则不能上样，否则会堵塞加样器和层析柱。
3.样品应存放于4°C或一20°C，可依预计保存的时间和使用情况而定。肽和蛋白在室温下会发生降解。
应避免样品的反复冻融，将样品分装成小包装于一20°C保存，每次取出一份使用。
三、检测 HPLC 系统中的仪器
以下实验步骤与检测适用于分离多肽和蛋白的 HPLC系统。
1.在与分离目的肽或蛋白样品相同的条件下，做一组空白对照（用洗脱液A进样），以梯度l00%A—100%B洗脱。如果出现峰，则要重复该步骤。
该步骤旨在清洗前次分离多肽和蛋白时没能被洗脱的杂质。
2.用硫脲或硝酸钠（或其他不会导致交叉影响的溶剂）来测量柱的死体积。
3.用梯度洗脱和适当的测试用混合物来检测柱的工作性能。
例如下面的测试混合物：1.5 g/L二甲基邻苯二甲酸，1.5 g/L二乙基邻苯二甲酸，0.1 g/L联苯，0.3 g/L邻三联苯，3.2 g/L邻苯二甲酸二辛酯(用甲醇溶解）。
通过检测能评价柱床完整性[低完整性与峰的分裂、峰的前伸（fronting)或拖尾有关]和柱性能（与塔板数有关），也能检测柱的寿命（如果以相同的间隔时间重复检测），并评估柱填充物批与批之间的差异。
用于检测柱性能的肤的标准品，如Mant和Hodges(1991b)所述。
4.测量HPLC系统的梯度延迟（滞留体积）（可用另一种方法来完成此目的，见第7章）。下列几步实验必须在色谱柱与HPLC仪器未连接的状态下进行。
（1）用unionpiece(相当于零长度[zero-length]柱）将加样器直接与检测器相连。
（2）分别配制200 ml洗脱液A和洗脱液B。
洗脱液A: 乙腈；
洗脱液B: 乙腈，0.2% 丙酮
（3）以流速20 ml/min，洗脱液B梯度洗10 min, 在254nm处检测。
加样技术将影响滞留体积的测量结果。如果加样后阀值仍维持在注人样品时的位置，则滞留体积将包括进样环的体积；如果阀被拨到上样的位置，则滞留体积就不再包括进样环的体积。若进样环&100沁，就会产生错误。如果进行分析性分离（如样品环为50W)和半制备性分离（如进样环&500ul) 的进样环被弄混了，也会造成这种后果。
（4）测定梯度延迟时间，将结果绘制成类似于图 5.18 所示。
滞留体积即 VD，是从泵的头部到层析柱人口处之间的洗脱体积（包括混合室体积）。滞留体积的大小（为 2~7 ml) 不等。自动进样器对滞留体积有很大影响，应该补偿±0.5 ml 的校正值。得到的曲线图可用于分析评价梯度延迟时间，因为泵传送体积的精确度也是严格控制的。
了解梯度延迟时间对于实验方法的建立是十分必要的，因为这是精确计算 S 和 b 值（loc.cit) 的基础。当建立分步梯度（此时会出现很多错误）或者将一台仪器上的HPLC系统转移到其他机器上时，梯度延迟时间的测定显得尤为重要。
四、进行蛋白质样品的分析性 RP-HPLC
1.在分析样品之前，在同样条件下至少做一组空白对照。
2.用两个因子 3 不同的分析性 RP-HPLC 过程来分离肽和蛋白质样品（约 100ug)。
五、梯度条件的优化
1.起始实验
在起始实验中，将肽或蛋白质样品在两个不同的线性梯度条件下分离，两个条件的不同之处在于其梯度洗脱时间把的因子 3 有所不同（其他所有的色谱参数均相同）(Dolan,etal，1989;Boysen，etal,1998)，这样就能够获得每个肽或蛋白质的 RP-HPLC 滞留时间。先不考虑最佳策略，建议最好用至少两种不同的梯度洗脱时间以鉴定重叠峰。为了优化梯度模式以获得邻近峰之间的最大分辨率，则有必要提高多肽或蛋白质的滞留时间的准确度，并将反映流动相组分分布和柱直径的参数进行分类 (见表 5.9)(GhristandSnyder,1988a，1988b;Ghrist，etal,1988)。尽管确定 Vmix 非常有用（Stadalius，etal，1984)，但还是有必要确定死体积和梯度延迟时间 (Sryder，1980;Boysen，etal，1998)。
2.起始条件的选择
3.从起始色谱图中计算 Inko 和 S 值
4.峰的示踪和鉴别
5.在整个梯度范围内优化梯度时间 tG
6.新的梯度范围的确定
7.新的梯度滞留时间的计算
在已知 S 和 Inko 知值的基础上，可以算出新的梯度滞留时间。
8.梯度范围的变换（可选）
在测量梯度延迟时间时，应只进行多步梯度。此时，每一梯度的起始和结尾处的梯度延迟时间将会重复出现误差。而且，在 DryLabG/plus 模拟实验中（依 Ghrist 所列出的程序而定；Ghfist，etal，1988)，用于调节梯度起始和结束处（梯度范围的边缘）梯度组成的 Vmix，其产生的影响能够使实验中测定的滞留时间偏离预期的理想滞留时间。
9.结果的验证
优化程序完成后，可用预期的色谱条件来模拟验证色谱的分离效果。
(共0个问题)
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