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HPVl6E7E6 重组腺病毒的构建及免疫效果评价[J].pdf 6页
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．疫苗学．
HPVl6E7E6重组腺病毒的构建及免疫效果评价
任皎赵莉 田厚文 高见冯靖庞正 吴小兵谭文杰 阮力
目的构建用于宫颈癌治疗的HPVl6E7E6蓐组腺病毒并评价其免疫效果。方法
根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计HPVl6E7E6融合蛋白表达优势密码子基因序列并合成。将
合成的E7E6基因插人腺病毒重组穿棱质粒pOD316后，与AdS腺病毒骨架质粒共转染293细胞，重
组病毒经单斑纯化并进行目的基因插入及表达的鉴定。扩增纯化重组病毒后免疫小鼠，评价其免疫
活性。结果PCR试验证明E7E6密码子优化基因成功插入AdS病毒；Westernblot检测结果表明重
组腺病毒中E7E6优化基因能高效表达，该重组腺病毒免疫C57小鼠后，可诱发强特异性T细胞免疫
应答，在小鼠体内能完全抑制5x104TC一1移植瘤细胞的生长。结论重组HPVl6E7E6腺病毒可作
为治疗HPV慢性感染或宫颈癌的候选疫苗。
【关键词】人乳头瘤病毒16型；宫颈癌；免疫治疗；腺病毒载体
andantitumoroftherecombinantadenoviras E7andE6fussion
Immunogenicityefficacy
expressing
ofHPV16inmiceREN
proteins type
Jiao．zHAok。TlANHou—wen。GAOJian．FENGJing。PANG
l矗ralDiseaseControland
Zheng，WUXiao—bing，TANWen-jie，R矾ⅣLi．Institutefor
Prevention，China
cDC．Be日讯glO0052．China
Correspondingauthor：TIAN
ttou-wn．Email：houwentian@yahoo．cor／t．cn
ToconstructonerecombinantadenovirusAdE7E6 HPVl6E6
IAbstract】0bjective
expressing
andE7fusion ascandidateforHPVl6
vaccine．MethodsThe
therapeutic
codon．optimized
fusedtocreateone
insertedintoadenovirusvector
gene，were
frame。then
strainofrecombinantadenoviruswasconstructed
recombinant293cells．and
throughhomologous
fled PCRandWestern
blot．Finally．itemployedstudyimmunogenicityactivity
ThePERresultshowedthatE6E7fusion hadbeen inre．
growthregression．Results
integrated
cambinantAd5DNA．WestemblottestCOIlfinedthatIheE6E7fusion
wag iII293
proteinhighlyexpressed
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& 香港九价HPV宫颈癌疫苗真的断货了吗?还能预约吗？现在终 ...
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1. 宫颈癌是仅次于卵巢癌的生殖道恶性肿瘤，全球每年新发病例近 60 万，死亡约 30 万。中国每年新增病例约 13.5 万，其中 8 万人因此死亡。
2. 几乎所有（99.7%）的宫颈癌都是 HPV 感染所引起，2008 年诺贝尔医学奖授予发现 HPV 与宫颈癌关系的德国科学家 Harald zur Hausen，他首先发现了 HPV 导致宫颈癌 ，并对其机制进行了深入研究，最终证明 HPV 感染是引起宫颈癌发生的主要病因，这一重大发现是日后 HPV 疫苗研发的根本依据。
3. HPV 感染不仅仅导致宫颈癌，90% 的肛门癌，40% 的外阴 / 阴道癌和 12% 的头颈癌与 HPV 感染密切相关。
4. 性是 HPV 感染主要途径，但不是唯一途径。避孕套并不能完全阻断 HPV 的传播。
5.HPV 感染非常普遍，只要开始性，一生中被 HPV 感染的概率非常高，性活跃期妇女 HPV 感染率约占 50％～80％ 。HPV 感染通常没有任何症状，所以无法被自己察觉。
6. 并不是感染了 HPV 就一定会发展成宫颈癌，HPV 有 100 多种亚型，分为低危型和高危型，50％～90％的 HPV 感染可在感染后的数月至 2 年内被免疫系统清除，不会导致长期的危害。
7. 只有高危型 HPV 的持续感染，才会进展为恶性病变。HPV 持续感染的定义：间隔一年以上的时间连续两次检测出同一高危型的 HPV 被认为是持续性感染。
8.HPV l6 和 18 是最主要的高危型 HPV，70％的宫颈癌都是由这两型 HPV 导致的，所以目前的 HPV 疫苗主要是针对这两型 HPV，换句话说，目前的疫苗或许只能预防 70% 的宫颈癌。
9. HPV 疫苗是人类首次尝试通过疫苗消灭一种癌症，具有划时代的意义。
10. 严格的说，现在还不能下“HPV 疫苗可以预防宫颈癌”的结论，因为持续 HPV 感染演变到宫颈癌的过程可长达 15~20 年，所以第一个以宫颈癌发生率为研究终点的临床试验数据要到 2020 年才能获得。
11. 美国和欧洲，目前都是基于是否能够预防 HPV 持续感染作为评估标准的，因为理论上能够预防 HPV 持续感染，就应该可以预防宫颈癌。15 年的等待，可能意味着 2~3 待年轻丧失预防宫颈癌的机会，这也是促成欧美尽快批准 HPV 疫苗上市的主要原因。“不伤害和有利”原则，是 HPV 疫苗获批的伦理依据。
12. 目前全球上市的两种 HPV 疫苗分别默克公司的 Gardasil 和葛兰素史克的 Cervarix。这两种疫苗已经在 100 多个国家和地区上市，全球使用达数千万例。
13. 对尚未感染 HPV 的而言，两种疫苗在预防宫颈癌、癌前病变以及其他生殖器疾病均显示出长期高度的有效性（&95%），目前认为两种疫苗效果相当，Gardasil 额外预防尖锐湿疣等生殖器疣。
14. 适合接种 HPV 疫苗的年龄，各个国家，或者同一国家的不同机构建议都不一样，全球范围内是 9~45 岁。FDA 批准的年龄是 9~26 岁，有机构建议 11~12 岁是最佳接种年龄。因为，在美国，中学以后，性似乎随时都有可能发生。
15. 年龄的限制并不是绝对的，关键是看有没有性，HPV 疫苗对于无性生活史的效果最佳，如果到 35 岁仍没有性生活，那么这个时候接种也完全是划算的。而如果有人打算一辈子都不过性生活，那么注射疫苗的必要性也就非常小了。
16. 有过性生活以后就不能接种 HPV 疫苗了吗？不是，基本上随时都可以接种，只是性生活一旦开始，感染 HPV 的机会大大增加，官方机构从药物经济学角度来考虑，虽然药性没有在性生活之间接种效果那么好，但还是建议接种。
17. 免疫接种作为一项公共政策，官方机构一定会考虑其投入收益，这也是为何大部分国家以及 WHO 官方文件中并未推荐男性接种 HPV 疫苗的原因，因为：1. 对于男性的获益主要是预防生殖器疣，而此类疾病并不致死；2. 目前看看不到男性接种对女性宫颈癌预防的作用。
18. 所以，不管是否有性生活，或是否已经感染过 HPV，疫苗是花钱买一种预防的可能性，鉴于 HPV 疫苗并不便宜，官方机构会考虑整体投入产出，个人也应该根据自己的情况进行选择。
19. 大部分 HPV 会被人体免疫系统清除，且并无治疗 HPV 的特效药物，所以一般 HPV 感染无需治疗。
20. 接种过 HPV 疫苗依然要定期做宫颈癌筛查，因为 HPV 疫苗并不能预防所有高危型 HPV。
21. 宫颈癌的发生是一个漫长的过程，而现在的宫颈癌筛查技术（其中包括 HPV 检测）已经相当成熟，所以 30 岁以后定期宫颈癌筛查对于已经有性生活或 HPV 感染的女性更加重要。遗憾的是，我国宫颈癌筛查的覆盖率不到适龄女性的 14%。
22. 接种 HPV 疫苗以前是不需要先检测自己是否已经感染 HPV。麻疹病毒感染过一次会有终身免疫，而 HPV 并不是，所以接种疫苗前的检测没有必要。
23. HPV 疫苗安全吗？从这 8 年几千万的使用来看，它经受住了考验。至于更加远期的安全性，需要时间来回答了。
24. 由于没有足够的数据支持，目前并不推荐孕妇接种 HPV 疫苗。
25. 目前没有发现 HPV 疫苗对胎儿的不利影响，所以如果在疫苗接种的 6 个月发现怀孕不用担心胎儿的健康，但是建议停止继续注射尚未注射的疫苗，直到生完孩子。
26. 接种完 HPV 疫苗以后可以马上怀孕，无需等待。
27. HPV 疫苗接种后的保护期有多长？美国疾控中心的数据是 6 年，而且保护效果并不随着时间的推移而减弱。6 年的数据主要是因为该疫苗上市才 8 年，还需要更长的时间来观察，HPV 疫苗是否有更长的保护期甚至终生有效也只有留给时间来回答。
28. 默克（默沙东）和葛兰素史克 2006 年开始在中国申请上市，截止当期尚未获批，丁香园的 Insight 数据库已经实时监控审批进度，一旦获批我们将会第一时间告诉大家。
29. HPV 疫苗在中国之所以迟迟未能获批，其主要原因是我国的药物评审中心坚持采用与欧美和 WHO 不同的疗效判断标准。观点是这样的：既然是宫颈癌疫苗，那么就要看到确切的对宫颈癌发生的预防效果，至少要看到对癌前病变（宫颈上皮内瘤变）的预防效果。而 HPV 感染到出现出现癌前病变，平均要 5 年，甚至 10 年的时间，那么疫苗上市前临床试验至少要 5 年以上的时间。
<font color="#cc13 年 7 月《中华肿瘤杂志》刊文，呼吁药物评审中心修改当前的 HPV 疫苗有效性评估标准，与欧美和 WHO 接轨，加快 HPV 疫苗在中国大陆的上市进度。假设我们相信 HPV 疫苗确实是有效的，那么在推迟上市的这些年，中国有几千万适龄女性失去了选择预防接种的机会。很难说中国的新药审评制度有什么错，规则放在哪里，想改动并不容易，需要异乎寻常的能力和勇气。
31. 有一些大陆的女性选择去接种 HPV 疫苗，她们问如果正好遇上经期是否可以接种，答案是肯定的：可以。
32. 从台湾和的经验来看，HPV 疫苗对中国人一样有效，和欧美几乎没有什么差别。
33. HPV 疫苗通常分３次给药注射，共需要６个月左右的时间完成，即开始的第 1 次、第２个月注射第 2 次，６个月后注射最后一次。 所以去接种的话，至少要往返 3 次，疫苗本身的费用大约
34. 有一些体检机构开设了赴港接种 HPV 疫苗的业务，但是否值得，请大家根据情况参考以上的内容自己考虑吧，为避免利益冲突，这里就不做推荐了。
35. HPV 疫苗还有伦理方面的争论，比如：有人认为给十几岁的孩子接种是变相鼓励她们提前开始性生活。如果**业无法禁止，那么就应该提倡**易带安全套，这些人连基本的逻辑都不明白，还一副怜爱下一代的样子。
36. 目前已经上市的疫苗都是预防性的不具有治疗作用。治疗性的 HPV 疫苗也已经在研发当中，部分疫苗在临床试验中表现出了较好的效果。
同时成为全港HPV疫苗第一大接种中心！
香港HPV预约网站：
香港仁和体检控股公司医思医疗集团(香港上市编号2138）
香港健康医疗：香港一站式医学健康管理：香港hpv疫苗，医学体检，医学美容，咨询预约热线（微信）：
得意生活 & 得意 & 得意DEYI &
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HPV16L1%5cE7+L2%5cE7疫苗构建及在毕赤酵母中表达和HPV16L1%5cE7疫苗免疫原性初步的研究.pdf 62页
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囝麓嬲步毒硕士研究生论文
宫颈癌是女性死于恶性肿瘤的重要因素。研究证明90％左右的宫颈癌的组织
可以检测到HPVl6亚型，HPVl6型与鳞癌有着密切关系，而90％的宫颈癌为鳞
癌，所以HPVl6是女性宫颈癌发病的主要原因。
巴斯德毕赤酵母表达系统是现目前广泛应用的异源蛋白真核表达系统，其具
有稳定性好、表达高效、分泌量大、规模化容易和成本低廉等优点，且具有糖基
化等翻译后修饰功能。
本研究主要开展了以下几方面工作：①克隆HPVl6L1／E7和L2／E7基因及
发酵罐规模下建立了HPVl6L1／E7发酵工艺；④研究该疫苗的免疫原性和抗肿瘤
效果。主要研究结果如下：
pPIC9k-L2／E7克隆质粒，经酶切鉴定和测序鉴定方法验证，证明克隆质粒构建
‘二、稳定高效分泌表达毕赤酵母菌种的筛选与鉴定
1．毕赤酵母感受态的制备及电转化(按照毕赤酵母表达手册操作进行)。确
证实后，线性化重组质粒，电转化毕赤酵母菌株GSll5。
2．重组毕赤酵母菌种的筛选。在MM和MD培养基上确定其生长表型；然
行PCR鉴定。
@麓嘲虫孥硕士研究生论文
检测了表达蛋白。实验结果显示只有HPVl6．L1／E7融合蛋白得到成功表达，
WESTERN．BLOT显示在出现正确的特异条带并有较好的抗原性，与推导的蛋白
条带大小一致，说明在毕赤酵母表达系统中成功的表达了pPIC9k．L1／E7蛋白。
为50ng／ul。
4．外源蛋白表达单一实验条件优化。毕赤酵母对外源蛋白的表达受很多因
素的影响，但主要是pH值、甲醇浓度和诱导时间，所以本研究从这三个方面进
行了实验的优化。实验结果表明该外源蛋白在毕赤酵母中的表达在pH值为6．0、
诱导时间为60小时和甲醇浓度为0．5％的时候表达最为显著。
融合蛋白的免疫原性和抗肿瘤方面进行了初步研究
1．为检测HPVl6．L1／E7融合蛋白的免疫原性，实验中用纯化的融合蛋白免
疫C57BL／6小鼠，然后检测其诱导产生的体液和细胞免疫反应。结果说明该蛋
白疫苗具有很好的免疫性，产生了能够维持较长时间和较高滴度的抗血清，表明
能够诱发小鼠机体的体液免疫。
2．为研究疫苗的预防性效果，本研究先对小鼠注射蛋白疫苗免疫，然后荷
瘤。结果显示，免疫了重组蛋白疫苗的那组，肿瘤生长缓慢质量小，平均肿瘤质
量为2．089：而佐剂对照组生长快质量大，平均质量为2．999。
3．对小鼠的治疗性免疫效应中，本研究先对小鼠荷瘤，等肿瘤长到一定大
小，然后给小鼠注射疫苗免疫。结果显示小鼠免疫了重组蛋白疫苗的一组得到较
明显的抑制肿瘤发展的效果，平均肿瘤质量为2．579：而注射PBS的一组没有抑
瘤作用，平均肿瘤质量为3．039。
综上所述，说明HPVl6L1／E7蛋白疫苗对宫颈癌具有良好的预防和治疗效
果，这一研究结果为宫颈癌及相关疾病的治疗及相关药物的研发奠定了基础。
关键词：人类乳头瘤病毒；宫颈癌； L1；L2；E7；毕赤酵母；表达；免疫原性
@麓嘲步雾硕士研究生论文
Cervicalcancb=目risoneofthe
important cancerdeathin
womgn．Many
studieshave
shownabout90％ofc删calcanoertissue
couldbedetectedinthe
subtype,which
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hpv16 cl表位e7&,49-57&以hsp110为分子伴侣的免疫原性研究.pdf 39页
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hpv16 cl表位e7
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温州医学院学位论文
CTL表位口4蛐，以HSPlO为分子伴侣的免疫原性研究
mttSPll0为分子伴侣的HPVl6CTL表位E7。}玎的免疫原性，为HPVl6多肽
疫苗的研制提供新的参考。
blot鉴定。
方法将mtlSPll0基因克隆、原核表达和纯化，SDS—PAGE和Western
在热休克状态与E7撕，结合形成复合物，HPLC(高压液相色谱)鉴定其结合
合物的抗肿瘤作用。
结果克隆mI-ISPl
2577bp；经SDS和Westernblot证实mHSPl10表达、纯化成功，HPLC
分析E7。蝴能够与mHSPl10形成复合物。复合物免疫小鼠的脾淋巴细胞中
组和PBS组。复合物免疫小鼠可明显抑制TC-1肿瘤的生长，其他三组基本
无抑瘤作用。
型上，免疫小鼠后显示出的抑制肿瘤生长的治疗效应。
【关键词】乳头状瘤病毒，人；表位，细胞毒性T淋巴细胞；热休克蛋白110；免
温州医学院学位论文
ofImmunodominantTLymphocyte
Immunogenicity
OncoproteinChaperoned
ofimmunodominant
objectiveinvestigateimmunogenicity
Lymphocyteepitope
oncoproteinchaperoned
MethodsMouseHSP110
prokaryoticexpression
Ni—NTAcolumn．The
pQE-80L．The proteinpurifedusing
Western··blot
wasconfirmedSDS·and
wasincubatedwithE7
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我市首批4价宫颈癌疫苗下周抵达接种点，专家提醒——
预防宫颈癌除了打针还需远离HPV
1月30日，记者从市疾控中心获悉，全市首批冷链4 价宫颈癌疫苗，预计在春节前后分发至各镇区的接种点。昨日，中山市博爱医院回复称，4价宫颈癌疫苗预计在2月7日起供有需要的市民接种。医学专家提醒，女性预防宫颈癌的关键是远离HPV 病毒的持续反复感染；对此，丈夫也需要远离不良卫生习惯，爱护伴侣。
　　“4价”疫苗是什么？病毒预防范围比“2价”多
　　今年1月初，全市首批1000支冷链2价宫颈癌疫苗，已全部派发至分布在多个镇区的14个接种点。据疾控部门透露，首批冷链4价宫颈癌疫苗，预计在春节前后派发至各镇区的接种点。
　　两种疫苗的名称，区别在于“2价”和“4价”，两者有何区别？
　　“‘HPV病毒’的全称是‘人乳头瘤病毒’，有40种细分病毒，医学界确认其与各类生殖器感染相关。主要由性传播感染。”市疾控中心公共卫生专家陈雪琴解释说，2价宫颈癌疫苗针对HPV16型、HPV18型两种病毒，这两种细分病毒的持续反复感染，被确认与宫颈癌、膀胱癌、生殖器癌密切相关。4价宫颈癌疫苗在2价疫苗的基础上，加入HPV6、HPV11两种病毒的预防，因为HPV6、HPV11与90%的尖锐湿疣相关。
　　所有女性都能接种？接种年龄有差别
　　陈雪琴分析说，女性感染HPV病毒不一定会得宫颈癌，然而，持续反复感染是致病的高危因素。每年，我国新发宫颈癌病例约10万人次，其中3万名女性因此去世。中山市疾控部门监测2016年户籍居民死因时发现，宫颈癌位列女性恶性肿瘤死因的第5位，市民对此切勿轻视。
　　据介绍，2价宫颈癌疫苗的接种性质是自愿和自费。接种群体是9岁至25岁的女性，已婚、已育、曾有性行为的女性均可接种。合计接种3支，时间严格限定为当月、1个月、6个月。
　　记者获悉，至于4价宫颈癌疫苗，接种群体是20岁至45岁的女性。合计接种3支，时间严格限定为当月、2个月、6个月。
　　陈雪琴强调说：“ 年龄是一道‘红线’，超龄者绝对不能接种宫颈癌疫苗。”
　　它是“万能疫苗”吗？关键是预防HPV 病毒持续反复的感染
　　接受记者采访的多名医生均表示，宫颈癌疫苗绝对不是“万能疫苗”，女性预防宫颈癌的关键是远离HPV病毒的持续反复感染。
　　“HPV病毒是一种常见的性传播病毒，70%至80%的女性在一生中曾有过感染HPV病毒的经历。”中山市中医院保健科医生王山云指出，多数低危型HPV病毒感染最终将被清除，通常不会进展为恶性肿瘤。人体对高危型病毒的清除能力有限，HPV病毒若持续反复感染，有机会发生癌变。目前，高危型HPV病毒有19种，HPVl6、HPV18、HPV31、HPV45与宫颈癌关系紧密。
　　对此，王山云建议，女性定期接受规范的宫颈筛查，90%以上宫颈癌能被扼杀。此外，女性的另一半——丈夫，也有可能充当让女性感染HPV病毒的源头。王山云举例说：“经常住酒店、洗桑拿、坐浴缸，甚至还有裸睡，都是容易接触HPV病毒的生活方式。此外，丈夫有包皮过长或者包茎，不注意个人卫生，将给伴侣带来感染HPV病毒的较大风险。”
来源：中山商报　作者：记者范展颢 通讯员王蓉 黄琳 黄海航
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