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文章标题：HPLC-ELSD法测定蜂蜜中的糖分博弈作者简介：余娟（1984－），女，四川邻水人，广西大学轻工与食品工程学院硕士研究生，主要研究方向：糖品工业分析。摘要：本文建立了同时测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的高效液相－蒸发光散射检测方法。样品溶解后，采用HypersilNH2柱分离，以乙腈/水（80/20，体积比）为流动相，使用激光蒸发光散射检测器进行检测。结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的线性范围分别为15～00、5～500和5～500mg/mL，检出限为0.5～4mg/mL，样品的加标平均回收率为92.4～98.5，相对标准偏差为2.1～3.5。该法用于实际样品的测定，结果令人满意。关键词：高效液相色谱；蒸发光散射监测器；蜂蜜；果糖；葡萄糖；蔗糖；麦芽糖中图分类号：TS207.3蜂蜜是一种传统的营养、保健食品，其主要成分是葡萄糖、果糖以及多种活性物质。经常食用蜂蜜，能提高人体的消化功能，止咳润肺，增强机体免疫能力。因此，蜂蜜具有较高的食用价值和药用价值。20xx年3月1日，我国首个蜂蜜强制性标准GB18796-20xx[1]正式实施。新标准要求，蜂蜜中果糖和葡萄糖总糖量应达到60以上，蔗糖含量要求在5以下。目前，蜂蜜中糖的测定方法主要有以下几种，一是以SN/T0852－20xx出口蜂蜜检验方法为代表的化学法[2]；二是以AOAC标准3]为代表的气相色谱法；三是以AOAC标准和GB/Txx为代表的液相色谱示差折光检测法（HPLC-RID）[4]。另外，离子色谱脉冲安培法用于蜂蜜中糖的测定也略有报道[5]。化学法操作繁琐，无选择性，且测得的葡萄糖、果糖值比实际值略高，极有可能到影响蜂蜜品质的判断[6]。气相色谱法则由于糖为未挥发性物质，需要进行衍生处理，操作繁琐。液相色谱示差折光检测法为较常用的方法，但存在示差折光检测器（RID）灵敏度低、基线噪音大、系统平衡时间长、不能进行梯度洗脱、有溶剂前伸效应、正负峰同时存在，且对室温敏感，易引起波动等缺点。相反，蒸发光散射检测器（ELSD）在测量半挥发或不挥发样品的光散射之前首先把流动相蒸发掉，所以检测器的响应不受溶剂和样品特殊性质的影响，因此对糖类的灵敏度大大高于RID[7]。本文采用液相色谱法分离、蒸发光散射检测器检测，外标法定量测定蜂蜜中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖的含量，结果准确，单个样品测定时间为20min。1材料与方法1.1仪器设备与试剂Waters600E高效液相色谱仪；AlltechELSD20xx检测器；Labconco90008-01超纯水仪；SartoriusMETTLERTOLEDOAL204电子天平等。乙腈色谱纯；葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖标准物质（均购于Sigma公司）；实验用水均为超纯水（电阻为18.2MΩ?cm）。1.2标准溶液配制果糖、葡萄糖标准储备液：准确称取0.5g果糖标准物质和0.4g葡萄糖标准物质，精确至0.0001g，用乙腈 水（40 60）溶解定容到10mL容量瓶，摇匀，置于4℃冰箱中保存。蔗糖、麦芽糖标准储备液：准确称取0.2g果糖标准物质和0.2g葡萄糖标准物质，精确至0.0001g，用乙腈 水（40 60）溶解定容到10mL容量瓶，摇匀，置于4℃冰箱中保存。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液：吸取不同体积的果糖、葡萄糖标准储备液和蔗糖、麦芽糖标准储备液，用乙腈 水（40 60）稀释至体积，配成不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液。各种标准储备液的用量和定容体积见表1：表1标准工作溶液配制参照表序号果、葡储备溶液体积/mL蔗、麦储备溶液体积/mL定容体积/mL标准工作溶液浓度/（mg/mL）果糖葡萄糖蔗糖麦芽糖123450.20.30.40.51.50.0250.050.10.20.711112.510.015.020.025.030.08.012.016.020.024.00.501.02.04.06.00.501.02.04.06.1.3样品处理准确称取样品5g，精确至0.001g。置于100mL烧
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　　1、葡萄糖（是一种六碳一元醛糖，水溶液中存在缩合平衡：大部分分子内醛基和5-羟基发生缩合形成吡喃糖，含苷羟基）分子中含有醛基（-CHO）或苷羟基，具有还原作用，是最典型的还原性糖。　　2、果糖（是一种六碳一元酮糖，水溶液中存在缩合平衡：部分分子内酮基和4-羟基发生缩合形成呋喃糖，不含醛基或苷羟基）分子中虽然不含有上述基团，但在水溶液非酸性环境下存在平衡能部分转化为醛糖（甘露糖/葡萄糖）和醛（甲醛；副产物二羟基丙酮,是最简单的酮糖,非还原性糖），转化产物中含醛基,所以果糖也是还原性糖。　　3、一分子蔗糖（α-D-葡萄吡喃苷基-β-D-呋喃果糖苷）由一分子β-D-呋喃果糖和一分子α-D-吡喃葡萄糖缩合（脱1分子H2O）形成，其中不含醛基或苷羟基（本来像麦芽糖一样会有的地方缩合掉了），因此不是还原糖。　　4.麦芽糖（β-D-呋喃果糖基- α-D-吡喃葡萄糖苷）分子中含有苷羟基，是还原糖；　　第一步、首先来说明一下这几种糖的性质，还原性糖种类：还原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等。非还原性糖有蔗糖、淀粉、纤维素等。还原性糖概念：还原糖是指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。　　葡萄糖分子中含有游离醛基，果糖分子中含有游离酮基，乳糖和麦芽糖分子中含有游离的醛基，故它们都是还原糖。　　第二步、由于葡萄糖、麦芽糖、果糖这三种都是还原性糖，而蔗糖是非还原性糖，所以用斐林试剂、班氏试剂、银氨溶液就能鉴别分类出其中有特征反应的三种还原性糖，没有特征反应的为蔗糖。　　第三步、对葡萄糖、麦芽糖、果糖这三种物质的鉴别。两种方法：　　（1）将这三种物质的水溶液分别加入到澄清石灰水中，产生白色沉淀的为果糖，因为果糖会与Ca(OH)2结合形成难溶性物质,，而其他二种糖没有这种现象发生。　　（2）用溴水鉴别，葡萄糖、麦芽糖能使溴水褪色，与溴水反应生成相应的糖酸，而果糖是酮糖（只有在碱性条件下才能发生异构化反应生成醛糖），在酸性条件下不能被溴水氧化,所以不能使溴水褪色。　　第四步、两种方法：　　（1）将相同质量的葡萄糖和麦芽糖分别与H2在镍的催化下加热反应，消耗的H2多的为葡萄糖,，少的为麦芽糖。　　（2）葡萄糖、麦芽糖二者与苯肼反应，形成糖脎，成脎较快的为葡萄糖，成脎较慢的为麦芽糖。
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、葡萄糖：斐林试剂.水浴加热有砖红色沉淀.、果糖：这个和葡萄糖区分不开吧.、蔗糖：浓硫酸.会炭化.、麦芽糖：加斐林试剂.无反应.因为它要加硫酸水解才能和斐林试剂反应、淀粉：加碘水.淀粉遇碘变蓝.老师说,高中阶段不要求掌握.实在要鉴别果糖和葡萄糖可以用质普仪.因为果糖是多羟基酮,葡萄糖是多羟基醛银镜反应要在碱性条件下.而酮在碱性条件下会变成醛.
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HPLC-ELSD法与HPLC-RID法检测蜂蜜中糖分的比较
来源：互联网
贡献&责任编辑：王小亮 &
第28卷第1期 2009年2月中国野生植物资源Chinese删Pknt Resources V01.28No.1 Feb.2009HPLC―ELSD法与HPLC―RID法检测蜂蜜中糖分的比较 张英1,一,石雪萍“,张卫明2(1.南京农业大学食品科技学院,江苏南京.南京野生植物综合利用研究院,江苏南京210042)摘要采用高效液相一蒸发光散射检测方法测定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量,从而判断蜂蜜中 的糖是否符合国家标准有无掺假。采用ELSD法检测结果表明,果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的线性范围均是0.6― 10mg/mL,相对标准偏差分别为0.308%、0.424%、0.327%、0.539%。并将ELSD法与国标中的RID法进行比较, 结果显示前者的灵敏度更高,检出限更低。线性范围更广。由此看来,蒸发光散射检测器的比示差折光检测器的在 我们检测糖项目上应用较好。关键词高效液相色谱;蒸发光散射检测;示差折光检测;蜂蜜;糖中图分类号:’IS207.3文献标识码:A 文章编号:{43―05Comparison of HPLC―ELSD and HPLC―lUD Methods inDetecting the Sugar of HoneyZhang Yin91”,Shi Xuepin92,Zhang Weimin92(1.School of Food and Technology of Nanjing Agricultural University,Nanjing .Nan-jing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plant,Nanjing 210042,China)Abstract In this paper.the HPLC―ELSD method WaS studied in detecting the mount of the fructose, sluco眈,sucrose and maltose in honey to judge whether the sugar amount in honey is accord with the na-tional standards.Using the detector ELSD。the results show the linearity ranges of tlIe fructose,slucose, SUCrOSe andmaltose眦all 0.6―10mg/lIlL,the relative standard deviations of them黜0.308%, 0.424%,0.327%,0.539%.Comparing with HPLC―ELSD and HPLC―RID,we found that the sen― sitivity was obviously higher if using ELSD,the detection limit is lower,and the linearity range is bma― der.From the result we drew a conclusion:the ELSD is better than RID in detecting the sugar of honey. Key words HPLC;ELSD;RID;sugar蜂蜜是种天然食品,蜜蜂采集植物的花蜜、分泌 物或蜜露,与自身分泌物结合后,经过在巢脾内转 化、脱水、贮存至成熟的过程而成的天然甜物质…。 蜂蜜中最主要的成分是糖类,其中有单糖、双糖、低 聚糖和多糖,其中单糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜总 糖的85%一95%[2J。现代医学认为蜂蜜可以促迸 食欲、改善肠胃功能、促进消化吸收、镇静安神、提高收稿日期:作者简介:张英(1984一),女,硕士研究生,主要研究方向 为:食品功能成分研究与开发?通讯作者:石雪萍,助理研究员,主要研究方向为功能性食 品及天然产物研究与开发。
机体免疫力,促进儿童生长发育;不仅对幼儿、老年、 体弱多病者及运动员、重体力劳动者、高强度脑力劳 动者来说是一种直接有效的营养补充来源,而且对 伤口愈合有辅助疗效旧j。蜂蜜的营养性决定了市场需求性,但是在利益 的驱动下蜂蜜的掺假现象越来越严重,掺假的手段 和花样越来越多,例如掺水、蔗糖、人工转化糖等,所 以国标中规定了要对蜂蜜中的果糖葡萄糖蔗糖麦芽 糖这4种糖检测,从而判断是否人为得掺人糖或水 等。目前,包括北京在内的大中城市的商场、超市出 售的蜂蜜50%以上是人造的或者掺假的假冒蜂 蜜【4J。因此,必须建立一系列的检测方法检测掺假 ..――43..一中国野生植物资源 第28卷物质,既保证可消费者的利益,又规范可我国的蜂蜜 市场,对我国蜂蜜产品的出口和我国在世界贸易中 的信誉也起了一定的保障作用。目前对蜂蜜的掺假检测的方法很多,有稳定碳 同位素比值分析法、薄层色谱分析法、淀粉酶鉴别 法【5。6J、同工酶凝胶电泳法和高效液相色谱法等等。 目前外国又研究了CCP检测法在检测蜂蜜中糖分 的应用071。本文后面将介绍高效液相色谱蒸发光 散射检测器法(HPLC―ELSD)和国标中的示差折光 检测器法(HPLC―RID)对蔗糖等低级掺假进行检 测区分。1材料与方法1.1实验材料1.1.1原料与试剂老山洋槐蜜:南京老山营养保健品有限公司。 紫云英蜜:南京嘉瑞保健食品有限公司。乙腈:色谱 纯,美国Fisher公司;果糖:分析纯,SIGMA公司;葡 萄糖:分析纯,广东西陇化工厂;蔗糖:分析纯,天津 化学试剂一厂;麦芽糖:分析纯,国药集团(标准物 质的纯度均t>99%)。1.1.2仪器设备Waters 2695高效液相色谱仪:美国Waters公 司;Waters 2410示差折光检测器:美国Waters公司; Allheeh ELSD2000检测器:美国奥泰科技(中国)有 限公司;Liehrospher NH2色谱柱:大连江申分离科 学技术公司;MiUipore ZROS5005Y超纯水器:北京 北方伟业发展有限公司;Metder AEl63电子天平:瑞士Metder Toledo公司o1.2实验方法1.2.1标准溶液的配制果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准储备液:精确称 取1.0g果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的标准物质,用 蒸馏水溶解定容到100mL的容量瓶中,摇匀,备用。 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作液:分别吸 取10、8、6、4、2、l、0.8、0.6、0.4、0.2mL的上述果 糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准储备液,用蒸馏水定容 至10mL,并标号备用。1.2.2样品处理准确称取5g样品蜂蜜置于100mL烧杯中,加 入30mL水,用玻璃棒搅拌使样品完全溶解,转移至 100mL容量瓶中,然后用水润洗定容,混匀。再从 中吸取l mL定容到10mL,摇匀,待用。‘1.2.3国标RID法的标准溶液的配制p1(1)果糖、葡萄糖标准储备溶液:准确称取5g 果糖标准物质和4g葡萄糖标准物质,精确0.0001 g,放入100mL容量瓶,加入60mL水溶解,用乙腈 定容至体积,摇匀。?(2)蔗糖、麦芽糖标准储备溶液:分别称取2g 蔗糖和2g麦芽糖标准物质,精确0.000l g,放人同 一100mL容量瓶,加入60mL水溶解,用乙腈定容 至体积,摇匀。(3)果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液t 吸取不同体积的果糖、葡萄糖标准储备溶液和蔗糖、 麦芽糖标准储备溶液,用乙腈/水(40/60)稀释至体 积,配成不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准 工作溶液,用于绘制标准工作曲线。每种标准储备 溶液的用量和定容体积见表1。表1工作曲线标准液配制参照表1.2.4RID法的样品处理称取5g试样,精确至0.001g,置于100mL烧 ?―-一44?-――
杯中,加入30mL水。用玻璃棒搅拌至溶解,转移至 100mL容量瓶中,然后再用10mL水洗烧杯3次并第l期 张英,等:HPLC―ELsD法与HPLC―RID法检测蜂蜜中糖分的比较转移至上述容量瓶中,用乙腈定容至体积,摇匀。1.2.5RID法的色谱条件色谱柱:碳水化合物分析柱;流动相:乙腈/水(77/23);流速:1.0mL/柱温:25℃;检测器池温度:35℃;进样量:15ttL。2结果与讨论2.1HPLC―ELSD法检测糖分2.1.1色谱条件的选择 ?(1)流动相配比的选择参考相关文献对蜂蜜中糖分检测的流动相配比峥】,从而设定了3种配比:(乙腈/水的体积比)80/20;85/15;90/10。实验结果见图1,2,3。90.0080.0070.00-l、r40.0030.0020.0010.OO8∞. 600. Mv 400. 200. 0.30.25. Mv20. 15.圈l流动相配比为80/20的色谱图l..一 扒从8.14.20.OO 22.∞ l果糖 2葡萄糖圈2流动相配比为85/15的色谱图I 1’\\八 、J/\\--......10..oo 16.∞18..oo 24.oo l果糖 2葡萄糖图3流动相配比为90/20的色谱图表2果糖和葡萄糖的出峰时间和分离度注:。?”分离度R计算公式:R=2(t2一t1)/(WI+W2)。卜一出 峰时问,W-一峰宽。结果表明流动相中水的比例越大分离度越小但 出峰越快,如表3所示,因为根据ELSD的原理可 知,水分越多溶质颗粒就会越少,它们穿过激光光束 散射的光被光电倍增管收集得也就趱陕。但如果流 动相中水的比例越大,则其相对保留值即分配系数 比就越小,根据影响分离度的三因素之一的柱选择 项可知,相对保留值变小,分离度也变小。为使较难 分离的果糖和葡萄糖的两个峰分离,又考虑到出峰 时间,所以最终选择了85/15的流动相配比。因为 流动相配比为80/20时分离度R=1.0(如图1),即 两种物质有98%的分离。当R≥1.5时说明两峰完 全分离,而且85/15的流动相配比(如图2)比90/10的流动相配比(如图3)所需的分离时问短,如表2。 所以为保证分离效果同时提高分离检测效率,最终 采用乙腈/水为85/15的配比。(2)检测器温度的选择在确定最佳流动相配比后,据参考相关文献一1从而考虑设定3种不同的检测池的温度,80、85、 90℃。结果显示3种不同温度对分离度、响应值无明显 影响,本来理论上是应该有影响的,可能使实验条件 的综合影响看不出明显变化。鉴于较低温度下仪器 能耗较低、升温时间短,故采用80℃作为最佳温度。 2.1.2线性范围和检出限取一系列标准工作溶液进样分析,以标准峰面 积对标准工作溶液浓度进行线性回归,得到4种标 准品的线性回归方程和相关系数。设色谱仪最低响 应值为S=3N(N为仪器上噪音水平),则检出限= S/b(b为标准曲线方程斜率)。根据实验结果计算 的4种糖的线性回归方程、相关系数、检出限、线性 范围如表3。一45―中国野生植物资源 第28卷从上表可以看出果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的 相关系数逐渐下降。另外从实验结果来看当4种糖 浓度都小于0.6mg/mL时,他们在线性回归方程的 趋势线中的点大大偏离了趋势线,使相关系数降低, 因此小于0.6mg/mL的浓度不在线性范围内。 表34种糖的线性回归方程、相关系数、检出限、线性范围 待溯组分 线性方程相鬻数差鉴。= 0.308%、0.424%、0.327%、0.539%。2.1.4回收率实验.经样品处理后,往已知糖含量的蜂蜜样品中加 入已知量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准溶液后, 色谱条件不变,按照外标定量法计算各自的回收率。 结果如表4。表4样品加标回收率2.1.3精密度实验精密配制果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的浓度均 2.1.5样品检测结果为4n[19/mL的混合对照品溶液,平行测定8次。然 在相同的色谱条件下对样品测定,结果见图4, 后计算各组分的峰面积的相对标准偏差(RSD%)为 5和表5。L八….350.00 300.00 2翮.00 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00 2.004.006。008.14.20.26.紫云英蜜HPLC检测结果从 .... .-● ●. 2.004.006.008.14.20.0022.oo 24..∞图5洋槐蜜HPLC检测结果表5样品检测结果??-――46?―---从表5中可以看出,样品中的糖分主要是单糖 中的果糖和葡萄糖,以及少量的麦芽糖,有的能检测 出蔗糖。根据国家标准规定果糖和葡萄糖总和应大 于60%,蔗糖应小于5%,所以这2种蜂蜜均符合国 家标准。第l期 张英,等:HPLC―ELSD法与HPLC―RID法检测蜂蜜中糖分的比较2.2HPLC―RID法检测糖分取一系列标准工作溶液进样分析,以标准峰面 积对标准工作溶液浓度进行线性回归,得到4种标 准品的线性回归方程、相关系数和检出限如表6。 表64种糖的线性回归方程、相关系数、检出限 待测组分 线形方程 相关系数(R)检出限/mg?mL_13结论(1)灵敏度。由蒸发光散射检测器和示差折光 检测器检测所得的线形回归方程中比较可知,将同 一种糖用ELSD和RID两种检测器检测所得的线性 回归方程进行比较,前者的斜率要比后者大,即响应 信号对进样量的变化率要大,亦即ELSD的灵敏度 比RID大。(2)检出限。检测器的灵敏度只能反映出检测 器对某种物质产生的响应信号的大小,并没有反映 出检测器本身的噪声。所谓噪声是指在没有试样通 过检测器时基线的波动范围。检测器的输出信号可 由电子放大器放大,这时,检测器的噪声也同时放 大。所以检测器的质量的好坏,不仅要看其灵敏度 的高低,而且还要看其检出限的大小。所谓检出限, 是指检测器的响应信号恰等于噪声的3倍时,单位 时间所需引入检测器中某种组分的质量,或单位体 积载气中所含组分的质量。计算公式为D=3R。/S。 式中D为检测器检出限,尺N为检测器的噪声,S为 检测器的灵敏度。一般来说,检出限越小。说明检测 越灵敏¨“o用蒸发光散射检测器法检测时,果糖、葡萄糖、 蔗糖、麦芽糖的检出限分别为0.9、 0.7mg/mL。用示差折光检测器法检 测时,果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的检出限分别为
O.25、0.25、O.25、O.1mg/mL。由此看来,蒸发光散射检测器的检出限要比示 差折光检测器的检出限要低。(3)线性范围。检测器的线性范围,是指响应 信号与被测组分浓度之间保持线性关系的范围,其 具体定义为检测器的响应在线性范围内,最大允许 进样量与最小进样量(即最小检出量)之比,或被测 物质的最大浓度(或量)与最低浓度(或量)之比。 其值越大,线性范围就越好[1¨。用蒸发光散射检测 器检测时,果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的线性范围均 为0.6~10mg/mL。用示差折光检测器检测时,果 糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的线性范围分别为lO一 30、8~24、O.5―6、O.5―6mg/mL。由此看来,蒸发 光散射检测器的比示差折光检测器的在我们检测糖 项目上应用较好。参考文献:【1】GBl,蜂蜜[s】.[2】许然.为谁辛苦为谁甜――解读蜂蜜的标准化之路[J].上 海标准化,-45.[3】卢太白,陈玲,张中满.蜂蜜品质检测与掺假鉴别[J】.陕西 农业科学,―25.[4]粘新.解读“蜂蜜”新国标[J】.农产品市场周刊,2006, (2):14一15.[5]Bonvehi.Determination《methyl anthranilate incimlshoney 0f eastern 8pain and its influence OII the diastase activity of the holy [J】.Alimentaria.-40.[6】Huidobro.Enzymatic determination of 0y∞'r,a in honey[J].Jour-hal of Agricultural and Food Chemistry。―559. [7】Anna Basa,Manta Magntmzewska,Tadeusz Krosulec,Andr:ej s. Bararmki.Cyclic chronopotentiometrie determinationofSUgtU'g at Au and Pt miemelectrodes in flowing solutions【J】.Jounud ofChronmtography A.2-309.[8】CB/T03,蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量 的测定方法一液相色谱示差折光检测法[s】.[9】余娟,莫海涛,武金良。等.HPLC―ELSD法检测蜂蜜中的 糖分[J】.广西轻工业,-21.[10】 中国食品工业协会.食品安全保障技术【M】.中国食品工业 协会出版,2006.[1l】杨银元.实用仪器分析[M】.北京:北京大学出版社,2001. ?--――47?--―-以下内容为系统自动转化的文字版，可能排版等有问题，仅供您参考：第２８卷第１期 ２００９年２月Ｃｈｉｎｅｓｅ删Ｐｋｎｔ中国野生植物资源ＲｅｓｏｕｒｃｅｓＶ０１．２８ Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２００９ＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ法与ＨＰＬＣ―ＲＩＤ法检测蜂蜜中糖分的比较张英１，一，石雪萍“，张卫明２（１．南京农业大学食品科技学院，江苏南京２１００９５；２．南京野生植物综合利用研究院，江苏南京２１００４２）摘要采用高效液相一蒸发光散射检测方法测定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量，从而判断蜂蜜中 的糖是否符合国家标准有无掺假。采用ＥＬＳＤ法检测结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的线性范围均是０．６―１０ ｍｇ／ｍＬ，相对标准偏差分别为０．３０８％、０．４２４％、０．３２７％、０．５３９％。并将ＥＬＳＤ法与国标中的ＲＩＤ法进行比较，结果显示前者的灵敏度更高，检出限更低。线性范围更广。由此看来，蒸发光散射检测器的比示差折光检测器的在我们检测糖项目上应用较好。 关键词高效液相色谱；蒸发光散射检测；示差折光检测；蜂蜜；糖 中图分类号：’ＩＳ２０７．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６―９６９０｛２００９）０１―００４３―０５Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ ＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ ａｎｄ ＨＰＬＣ―ｌＵＤ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｕｇａｒ ｏｆ ＨｏｎｅｙＺｈａｎｇ Ｙｉｎ９１”，Ｓｈｉ Ｘｕｅｐｉｎ９２，Ｚｈａｎｇ Ｗｅｉｍｉｎ９２Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｊｉｎｇｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｎａｎ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＷｉｌｄＰｌａｎｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００４２，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ．ｔｈｅ ＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ ｍｅｔｈｏｄ ＷａＳ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｌｔｏｓｅ ｉｎ ｈｏｎｅｙ ｔｏｍｏｕｎｔｏｆ ｔｈｅ ｆｒｕｃｔｏｓｅ，ｎａ－ｓｌｕｃｏ眈，ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄｊｕｄｇｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ａｍｏｕｎｔ ｉｎ ｈｏｎｅｙ ｉｓ ａｃｃｏｒｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ｏｆｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＥＬＳＤ。ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｌＩｅ ｆｒｕｃｔｏｓｅ，ｓｌｕｃｏｓｅ，ＳＵＣｒＯＳｅａｎｄｍａｌｔｏｓｅ眦ａｌｌ０．６―１０ｍｇ／ｌＩｌＬ，ｔｈｅｔｈｅｍ黜０．３０８％，０．４２４％，０．３２７％，０．５３９％．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ ａｎｄ ＨＰＬＣ―ＲＩＤ，ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎ―ｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｆ ｕｓｉｎｇ ＥＬＳＤ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｉｓ ｄｅｒ．Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｗｅ ｄｒｅｗａｌｏｗｅｒ，ａｎｄｔｈｅ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｒａｎｇｅ ｉｓ ｂｍａ―ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｔｈｅ ＥＬＳＤ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ＲＩＤ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ｏｆ ｈｏｎｅｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓＨＰＬＣ；ＥＬＳＤ；ＲＩＤ；ｈｏｎｅｙ；ｓｕｇａｒ蜂蜜是种天然食品，蜜蜂采集植物的花蜜、分泌机体免疫力，促进儿童生长发育；不仅对幼儿、老年、 体弱多病者及运动员、重体力劳动者、高强度脑力劳 动者来说是一种直接有效的营养补充来源，而且对伤口愈合有辅助疗效旧ｊ。物或蜜露，与自身分泌物结合后，经过在巢脾内转 化、脱水、贮存至成熟的过程而成的天然甜物质…。 蜂蜜中最主要的成分是糖类，其中有单糖、双糖、低 聚糖和多糖，其中单糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜总糖的８５％一９５％［２Ｊ。现代医学认为蜂蜜可以促迸蜂蜜的营养性决定了市场需求性，但是在利益 的驱动下蜂蜜的掺假现象越来越严重，掺假的手段 和花样越来越多，例如掺水、蔗糖、人工转化糖等，所 以国标中规定了要对蜂蜜中的果糖葡萄糖蔗糖麦芽 糖这４种糖检测，从而判断是否人为得掺人糖或水等。目前，包括北京在内的大中城市的商场、超市出食欲、改善肠胃功能、促进消化吸收、镇静安神、提高收稿日期：２００８―０４―１５作者简介：张英（１９８４一），女，硕士研究生，主要研究方向为：食品功能成分研究与开发 ?通讯作者：石雪萍，助理研究员，主要研究方向为功能性食 品及天然产物研究与开发。售的蜂蜜５０％以上是人造的或者掺假的假冒蜂 蜜【４Ｊ。因此，必须建立一系列的检测方法检测掺假．．――４３．．一万方数据 　中国野生植物资源第２８卷物质，既保证可消费者的利益，又规范可我国的蜂蜜 市场，对我国蜂蜜产品的出口和我国在世界贸易中 的信誉也起了一定的保障作用。 目前对蜂蜜的掺假检测的方法很多，有稳定碳 同位素比值分析法、薄层色谱分析法、淀粉酶鉴别 法【５。６Ｊ、同工酶凝胶电泳法和高效液相色谱法等等。１．２实验方法 １．２．１标准溶液的配制果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准储备液：精确称 取１．０ ｇ果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的标准物质，用蒸馏水溶解定容到１００ ｍＬ的容量瓶中，摇匀，备用。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作液：分别吸取１０、８、６、４、２、ｌ、０．８、０．６、０．４、０．２ ｍＬ的上述果目前外国又研究了ＣＣＰ检测法在检测蜂蜜中糖分的应用０７１。本文后面将介绍高效液相色谱蒸发光 散射检测器法（ＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ）和国标中的示差折光 检测器法（ＨＰＬＣ―ＲＩＤ）对蔗糖等低级掺假进行检糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准储备液，用蒸馏水定容至１０ ｍＬ，并标号备用。 １．２．２样品处理 准确称取５ ｇ样品蜂蜜置于１００ ｍＬ烧杯中，加测区分。１材料与方法１．１实验材料 １．１．１原料与试剂 老山洋槐蜜：南京老山营养保健品有限公司。入３０ ｍＬ水，用玻璃棒搅拌使样品完全溶解，转移至１００ｍＬ容量瓶中，然后用水润洗定容，混匀。再从 国标ＲＩＤ法的标准溶液的配制ｐ１ｇ １中吸取ｌ ｍＬ定容到１０ ｍＬ，摇匀，待用。‘１．２．３（１）果糖、葡萄糖标准储备溶液：准确称取５紫云英蜜：南京嘉瑞保健食品有限公司。乙腈：色谱 纯，美国Ｆｉｓｈｅｒ公司；果糖：分析纯，ＳＩＧＭＡ公司；葡 萄糖：分析纯，广东西陇化工厂；蔗糖：分析纯，天津 化学试剂一厂；麦芽糖：分析纯，国药集团（标准物 质的纯度均ｔ＞９９％）。 １．１．２仪器设备Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色谱仪：美国Ｗａｔｅｒｓ公 司；Ｗａｔｅｒｓ ２４１０示差折光检测器：美国Ｗａｔｅｒｓ公司；Ａｌｌｈｅｅｈ果糖标准物质和４ ｇ葡萄糖标准物质，精确０．０００定容至体积，摇匀。?ｇ，放入１００ ｍＬ容量瓶，加入６０ ｍＬ水溶解，用乙腈（２）蔗糖、麦芽糖标准储备溶液：分别称取２蔗糖和２ ｇ麦芽糖标准物质，精确０．０００ 至体积，摇匀。ｌｇｇ，放人同一１００ ｍＬ容量瓶，加入６０ ｍＬ水溶解，用乙腈定容 （３）果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液ｔ 吸取不同体积的果糖、葡萄糖标准储备溶液和蔗糖、麦芽糖标准储备溶液，用乙腈／水（４０／６０）稀释至体ＥＬＳＤ２０００检测器：美国奥泰科技（中国）有限公司；Ｌｉｅｈｒｏｓｐｈｅｒ ＮＨ２色谱柱：大连江申分离科 学技术公司；ＭｉＵｉｐｏｒｅ ＺＲＯＳ５００５Ｙ超纯水器：北京积，配成不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准 工作溶液，用于绘制标准工作曲线。每种标准储备 溶液的用量和定容体积见表１。北方伟业发展有限公司；Ｍｅｔｄｅｒ ＡＥｌ６３电子天平： 瑞士Ｍｅｔｄｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ公司ｏ表１工作曲线标准液配制参照表１．２．４ＲＩＤ法的样品处理杯中，加入３０ ｍＬ水。用玻璃棒搅拌至溶解，转移至１００称取５ ｇ试样，精确至０．００１ ｇ，置于１００ ｍＬ烧?―－一４４?－――ｍＬ容量瓶中，然后再用１０ ｍＬ水洗烧杯３次并万方数据 　第ｌ期张英，等：ＨＰＬＣ―ＥＬｓＤ法与ＨＰＬＣ―ＲＩＤ法检测蜂蜜中糖分的比较 表２果糖和葡萄糖的出峰时间和分离度转移至上述容量瓶中，用乙腈定容至体积，摇匀。１．２．５ＲＩＤ法的色谱条件色谱柱：碳水化合物分析柱；流动相：乙腈／水 （７７／２３）；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：２５℃；检测器池 温度：３５℃；进样量：１５ｔｔＬ。２结果与讨论注：。?”分离度Ｒ计算公式：Ｒ＝２（ｔ２一ｔ１）／（ＷＩ＋Ｗ２）。卜一出２．１ ２．１．１ＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ法检测糖分峰时问，Ｗ－一峰宽。结果表明流动相中水的比例越大分离度越小但 出峰越快，如表３所示，因为根据ＥＬＳＤ的原理可 知，水分越多溶质颗粒就会越少，它们穿过激光光束色谱条件的选择?（１）流动相配比的选择参考相关文献对蜂蜜中糖分检测的流动相配比峥】，从而设定了３种配比：（乙腈／水的体积比） ８０／２０；８５／１５；９０／１０。实验结果见图１，２，３。９０．００８０．００散射的光被光电倍增管收集得也就趱陕。但如果流动相中水的比例越大，则其相对保留值即分配系数 比就越小，根据影响分离度的三因素之一的柱选择项可知，相对保留值变小，分离度也变小。为使较难７０．００－ｌ、ｒ６５００．．００００分离的果糖和葡萄糖的两个峰分离，又考虑到出峰时间，所以最终选择了８５／１５的流动相配比。因为 流动相配比为８０／２０时分离度Ｒ＝１．０（如图１），即４０．００３０．００ ２０．００ １０．ＯＯ两种物质有９８％的分离。当Ｒ≥１．５时说明两峰完全分离，而且８５／１５的流动相配比（如图２）比９０／１０圈ｌ流动相配比为８０／２０的色谱图的流动相配比（如图３）所需的分离时问短，如表２。 所以为保证分离效果同时提高分离检测效率，最终采用乙腈／水为８５／１５的配比。 （２）检测器温度的选择８∞．６００．ｌＭｖ４００．２００．０．．．一８．００扒１０．００１２．００ １４．００ １６．００从１８．００ ２０．ＯＯ－－ ．．．．．．在确定最佳流动相配比后，据参考相关文献一１从而考虑设定３种不同的检测池的温度，８０、８５、９０℃。２２．∞结果显示３种不同温度对分离度、响应值无明显ｌ果糖２葡萄糖影响，本来理论上是应该有影响的，可能使实验条件的综合影响看不出明显变化。鉴于较低温度下仪器 能耗较低、升温时间短，故采用８０℃作为最佳温度。圈２流动相配比为８５／１５的色谱图３０．Ｉ１’２５．Ｍｖ ２０．１５． １０．００＼１２．００２．１．２线性范围和检出限、Ｊ／八取一系列标准工作溶液进样分析，以标准峰面积对标准工作溶液浓度进行线性回归，得到４种标准品的线性回归方程和相关系数。设色谱仪最低响 应值为Ｓ＝３Ｎ（Ｎ为仪器上噪音水平），则检出限＝２０．００ ２２．ｏｏ ２４．ｏｏ＼１４．ｏｏ１６．∞１８．００ ２葡萄糖ｌ果糖Ｓ／ｂ（ｂ为标准曲线方程斜率）。根据实验结果计算图３流动相配比为９０／２０的色谱图的４种糖的线性回归方程、相关系数、检出限、线性范围如表３。一４５―万方数据 　中国野生植物资源第２８卷从上表可以看出果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的相关系数逐渐下降。另外从实验结果来看当４种糖 浓度都小于０．６ ｍｇ／ｍＬ时，他们在线性回归方程的 趋势线中的点大大偏离了趋势线，使相关系数降低， 因此小于０．６ ｍｇ／ｍＬ的浓度不在线性范围内。表３待溯 组分０．３０８％、０．４２４％、０．３２７％、０．５３９％。２．１．４回收率实验． 经样品处理后，往已知糖含量的蜂蜜样品中加入已知量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准溶液后， 色谱条件不变，按照外标定量法计算各自的回收率。结果如表４。表４样品加标回收率４种糖的线性回归方程、相关系数、检出限、线性范围线性方程相鬻数差鉴。＝２．１．３精密度实验精密配制果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的浓度均为４ ｎ［１９／ｍＬ的混合对照品溶液，平行测定８次。然 后计算各组分的峰面积的相对标准偏差（ＲＳＤ％）为２．１．５样品检测结果在相同的色谱条件下对样品测定，结果见图４，５和表５。Ｌ八…．２．００４．００６。００８．００１０．００１２．００１４．００１６．００１８．００２０．００２２．００２４．００２６．００２８．００图４紫云英蜜ＨＰＬＣ检测结果３５０．００ ３００．００２翮．００２００．００１５０．００１００．００５０．０００．００ ２．００ ４．００从６．００８．００ １０．００ １２．００ １４．００ １６．００ １８．００．．．．．－●●．２０．００２２．ｏｏ２４．００２６．００２８．∞图５洋槐蜜ＨＰＬＣ检测结果 表５样品检测结果从表５中可以看出，样品中的糖分主要是单糖中的果糖和葡萄糖，以及少量的麦芽糖，有的能检测 出蔗糖。根据国家标准规定果糖和葡萄糖总和应大于６０％，蔗糖应小于５％，所以这２种蜂蜜均符合国家标准。??－――４６?―－－－万方数据 　第ｌ期张英，等：ＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ法与ＨＰＬＣ―ＲＩＤ法检测蜂蜜中糖分的比较２．２ＨＰＬＣ―ＲＩＤ法检测糖分 取一系列标准工作溶液进样分析，以标准峰面Ｏ．２５、０．２５、Ｏ．２５、Ｏ．１ ｍｇ／ｍＬ。由此看来，蒸发光散射检测器的检出限要比示 差折光检测器的检出限要低。 （３）线性范围。检测器的线性范围，是指响应积对标准工作溶液浓度进行线性回归，得到４种标 准品的线性回归方程、相关系数和检出限如表６。表６待测组分４种糖的线性回归方程、相关系数、检出限线形方程 相关系数（Ｒ）检出限／ｍｇ?ｍＬ＿１信号与被测组分浓度之间保持线性关系的范围，其 具体定义为检测器的响应在线性范围内，最大允许 进样量与最小进样量（即最小检出量）之比，或被测物质的最大浓度（或量）与最低浓度（或量）之比。 其值越大，线性范围就越好［１¨。用蒸发光散射检测器检测时，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的线性范围均为０．６～１０ ｍｇ／ｍＬ。用示差折光检测器检测时，果３结论（１）灵敏度。由蒸发光散射检测器和示差折光检测器检测所得的线形回归方程中比较可知，将同 一种糖用ＥＬＳＤ和ＲＩＤ两种检测器检测所得的线性 回归方程进行比较，前者的斜率要比后者大，即响应 信号对进样量的变化率要大，亦即ＥＬＳＤ的灵敏度糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的线性范围分别为ｌＯ一３０、８～２４、Ｏ．５―６、Ｏ．５―６ｍｇ／ｍＬ。由此看来，蒸发光散射检测器的比示差折光检测器的在我们检测糖项目上应用较好。参考文献：【１】ＧＢｌ８７９６―２００５，蜂蜜［ｓ】． ［２】许然．为谁辛苦为谁甜――解读蜂蜜的标准化之路［Ｊ］．上海标准化，２００５（１２）：４３－４５．比ＲＩＤ大。（２）检出限。检测器的灵敏度只能反映出检测 器对某种物质产生的响应信号的大小，并没有反映［３】卢太白，陈玲，张中满．蜂蜜品质检测与掺假鉴别［Ｊ】．陕西农业科学，２００６（２）：２４―２５．出检测器本身的噪声。所谓噪声是指在没有试样通过检测器时基线的波动范围。检测器的输出信号可 由电子放大器放大，这时，检测器的噪声也同时放［４］粘新．解读“蜂蜜”新国标［Ｊ】．农产品市场周刊，２００６，（２）：１４一１５．Ｂｏｎｖｅｈｉ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ《ｍｅｔｈｙｌ ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｉｎｃｉｍｌｓｈｏｎｅｙ ０ｆｅａｓｔｅｒｎ ８ｐａｉｎ［５］ａｎｄｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ＯＩＩ ｔｈｅ ｄｉａｓｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｈｏｌｙ大。所以检测器的质量的好坏，不仅要看其灵敏度的高低，而且还要看其检出限的大小。所谓检出限，［Ｊ】．Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉａ．１９８６．１９７：３７－４０． ［６】Ｈｕｉｄｏｂｒｏ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ［７】Ａｎｎａ Ｂａｓａ，ＭａｎｔａＡｕ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ０ｙ∞＇ｒ，ａｉｎｈｏｎｅｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ－是指检测器的响应信号恰等于噪声的３倍时，单位时间所需引入检测器中某种组分的质量，或单位体ｈａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。１９９３。４１：５５７―５５９． Ｍａｇｎｔｍｚｅｗｓｋａ，Ｔａｄｅｕｓｚ Ｋｒｏｓｕｌｅｃ，Ａｎｄｒ：ｅｊ ｓ．ＳＵｇｔＵ＇ｇ ａｔｏｆ Ｂａｒａｒｍｋｉ．Ｃｙｃｌｉｃ ｃｈｒｏｎｏｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＰｔ积载气中所含组分的质量。计算公式为Ｄ＝３Ｒ。／Ｓ。式中Ｄ为检测器检出限，尺Ｎ为检测器的噪声，Ｓ为ｍｉｅｍｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｉｎｆｌｏｗｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎｓ【Ｊ】．ＪｏｕｎｕｄｏｆＣｈｒｏｎｍｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ．２００７，１ １５０：３１２－３０９．检测器的灵敏度。一般来说，检出限越小。说明检测越灵敏¨“ｏ［８】ＣＢ／Ｔ１８９３２．２２―２００３，蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量 的测定方法一液相色谱示差折光检测法［ｓ】． ［９】余娟，莫海涛，武金良。等．ＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ法检测蜂蜜中的 糖分［Ｊ】．广西轻工业，２００６（６）：２０－２１．［１０】用蒸发光散射检测器法检测时，果糖、葡萄糖、 蔗糖、麦芽糖的检出限分别为０．０１００．０１０ ９、０．０１３ ７ ９、０．０１０ ９、中国食品工业协会．食品安全保障技术【Ｍ】．中国食品工业 协会出版，２００６．ｍｇ／ｍＬ。用示差折光检测器法检测时，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的检出限分别为［１ｌ】杨银元．实用仪器分析［Ｍ】．北京：北京大学出版社，２００１．?－－――４７?－－―－万方数据 　
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