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小弟现需设计一段基因的全长引物，网上所公布的序列只有一条，且此段全长基因即一个编码区，序列两端AT含量过高，请问各位大侠，想要扩增此段全长基因，该如何设计全长引物呢？因为下一步可能要做表达研究，所以不能分段扩增再拼接，请问如何设计？谢谢各位了~~~
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我觉得引物长度可以适当调整，Tm 55-65应该都还可以吧
不知道你的模板来源是什么，如果是反转录后的cDNA:
可以自己设计特异性的引物，就是你的反向引物进行反转录了,
如果确定只有一个编码区，可以做基因组PCR，看你的基因落在那段基因组上，在从两边适当延长看能不能找到GC含量合适的区域
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我觉得引物长度可以适当调整，Tm 55-65应该都还可以吧
不知道你的模板来源是什么，如果是反转录后的cDNA:
可以自己设计特异性的引物，就是你的反向引物进行反转录了,
如果确定只有一个编码区，可以做基因组PCR，看你的基因落在那段基因组上，在从两边适当延长看能不能找到GC含量合适的区域
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大量AT含量,就再往两端延伸一下,到时候看看能不能酶切一下.如果分开P,到时候也可以做融合PCR连起来的,我自己没试过.一般都觉得CG含量高而觉得麻烦~呵呵
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芦海平 发表于
大量AT含量,就再往两端延伸一下,到时候看看能不能酶切一下.如果分开P,到时候也可以做融合PCR连起来的,我自己 ...
主要问题就是两端根本没有公布的序列了，呵呵，那我试一下。谢谢了~~~
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yiteluo 发表于
我觉得引物长度可以适当调整，Tm 55-65应该都还可以吧
不知道你的模板来源是什么，如果是反转录后的cDNA:
我是准备直接从DNA中进行扩增，而现在所公布的序列只有一段，而且是一个完整的开放阅读框，5‘和3’端都没有其他序列了。
你讲的基因组PCR不是很明白，呵呵~~~
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spiritzs7 发表于
主要问题就是两端根本没有公布的序列了，呵呵，那我试一下。谢谢了~~~
两边不知道可以做反向PCR
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spiritzs7 发表于
我是准备直接从DNA中进行扩增，而现在所公布的序列只有一段，而且是一个完整的开放阅读框，5‘和3’端都没 ...
就是说，如果只有一个外显子的话，那么这段序列在基因组里应该也是连续的，
你blast一下它在基因组中的位置，然后两边延伸一些设计引物，
提取基因组DNA，以此为模板进行PCR，
待拿到正确的克隆后，在缩短直到一个完整的CDS序列
实时荧光定量PCR出现很多乱峰，求大神们帮电泳单引物跑出来为什么是这个样子电泳单引晒动图——活体细胞4D成像新手段，细胞筛选美开发细菌制造生物燃料技术你还在搬砖吗
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逛了这许久，何不进去瞧瞧？求助转录组测序完成后，后续荧光定量、基因克隆引物设计问题 - 实验交流 - 生物秀
标题: 求助转录组测序完成后，后续荧光定量、基因克隆引物设计问题
摘要: [求助转录组测序完成后，后续荧光定量、基因克隆引物设计问题] 我们课题组最近做了转录组测序，然后找到差异基因，这些基因都给出拼接出来的序列，我要克隆某些基因。1、我是需要3‘、5’、再全长这样的顺序来克隆还是直接设计一个全长引物直接克隆出来？2、我要怎样利用这样一条拼接出来的大概1000Kb的序列进行PCR引物设计和荧光定量PCR引物设计呢？是要直接拿这条 关键词:[引物设计 转录组 荧光定量 测序 序列 克隆 基因]……
我们课题组最近做了转录组测序，然后找到差异基因，这些基因都给出拼接出来的序列，我要克隆某些基因。
1、我是需要3‘、5’、再全长这样的顺序来克隆还是直接设计一个全长引物直接克隆出来？
2、我要怎样利用这样一条拼接出来的大概1000Kb的序列进行PCR引物设计和荧光引物设计呢？是要直接拿这条已给出的拼接出来的序列在primer5上直接设计呢？还是要先去NCBI上比对出相似序列，再比较着用man什么的设计？
求高人指点回复1000Kb...这么长。。。回复
1000Kb...这么长。。。 是啊，大概1000多，有什么建议回复我也很想知道方法，求高人指点！回复
1000Kb...这么长。。。 没人啊，没人啊
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电话：021-引物设计上有不懂得问题 求助(引物设计,引物) - PCR实验 - 生物秀
标题: 引物设计上有不懂得问题 求助(引物设计,引物)
摘要: [引物设计上有不懂得问题 求助(引物设计,引物)] 我用VECTOR NTI设计的引物但是对dH,
dS和dG不知道什么意思,对了 还有TaOpT不明白求教高手
3: Product of length 1656 (rating: 171)
Contains region of the molecule from 124 to 1779
Tm: 79 4 C
TaOpt: 56 4 C
Sense 关键词:[引物设计 引物]……
我用VECTOR NTI设计的引物但是对dH,
dS和dG不知道什么意思,对了 还有TaOpT不明白求教高手.#3: Product of length 1656 (rating: 171)
Contains region of the molecule from 124 to 1779
Tm: 79.4 C
TaOpt: 56.4 C
Sense Primer:
CTCCAGTCTCCAAAGCCGAT
Similarity: 100.0%
Length: 20
Tm: 53.2 C
dH: -154.5 kcal/mol
dS: -397.3 cal/mol
dG: -34.3 kcal/mol
Antisense Primer:
GCTGACCATTGTGGTTCCATA
Similarity: 100.0%
Length: 21
Tm: 52.3 C
dH: -153.0 kcal/mol
dS: -394.2 cal/mol
dG: -33.7 kcal/mol
Tm Difference: 1.0
GC Difference: 7.4
一些反应热动力学上的东西，也不太清楚，同问，呵呵。怎么没有回音啊 痛苦啊dH 是焓变，dS是熵变，dG是Gipps函数变 这些都是热动力学方面的，你可以不管它们。TaOpT推荐（最优化）的退火温度，你PCR时可在此温度上下浮动1-2度谢谢 朋友 我还是想了解 能详细的解释一下吗http://202.113.66.66/xjjpkpx_2005/gchhx/wlkejian/derzh/erzhsanjie.htmhttp://cache.baidu.com/c?word=%EC%D8%3B%B1%E4&url=http%3A//estar%2Erdfz%2Ecn/Resource/GZ/GZHX/HXBL/XDHXJC/zw%5F0044%2Ehtm&b=0&a=23&user=baiduhttp://www.xkwx.com/xjc/Html/Article/Class910/xxx/Class5083/Class5146/Class.html一. 吉布斯函数Ｇ的势能属性1.自发过程及其特征z以水自发地从高处（ｈ1）流向低处（ｈ2）为例 z推动力：位差Δｈ＝ｈ2－ｈ1&０ z特征：随着自发过程的进行，势能不断降低，重力势能转变为功；当Δｈ＝０即ｈ2＝ｈ1时，势能降到最低，达平衡态，无作功能力； z反向自发进行，Δｈ&０，需外力作功支持．
2.化学反应的自发性z反应：　Ｚｎ＋ＣｕＳＯ4　＝　Ｃｕ＋ＺｎＳＯ4 　　　　　─────────────→
　　　　　　　自发从左向右进行 z若该反应在电池中进行，正反应方向为放电过程， z可作电功，反向自发进行需外力作功，为充电过程．反应自发进行的推动力应是体系中某一具有势能性质的物理量（状态函数）的变化（ΔＧ）． *吉布斯函数Ｇ的势能属性 1878年，美国化学家Gibbs提出，恒温，恒压下的化学反应之所以能够自发进行，是由于反应中存在状态函数Ｇ，Ｇ在反应中不断降低（即ΔＧ&０）,Ｇ的降低转变为功(ΔG=W)，反应自发地进行下去，一直到Ｇ降至最低达到平衡．因此，Ｇ具有势能属性．
§２.３吉布斯自由能变化ΔＧ和反应方向的判断 二. 吉布斯自由能变判据（ΔＧ判据）1.G和DG的含义、G和DG的性质(1)定义
G ≡ H–TS
, 又DG =G2–G1
DG = (DH – TDS) & 0
正向自发 (2)吉布斯自由能变判据（ΔＧ判据） 恒温，恒压下，ΔＧ＝Ｗ′
ΔＧ&０　　　正向自发反应　　　　Ｗ′&０ 　　ΔＧ＝０　　　平衡态　　　　　　　Ｗ′＝０ 　　ΔＧ&０　　　反向自发反应　　　　Ｗ′&０ 最小自由能原理。2.吉布斯函数变（ΔＧ）判断反应的自发性对公式ΔＧ＝ΔＨ－ＴΔＳ的讨论 ΔＨ
Ｔ对ΔＧ的影响
ΔＨ&０（放热）
ΔＳ&０ （熵增）
任何温度下，都有ΔＧ&０ （正向自发）
ΔＨ&０ （吸热）
ΔＳ&０ （熵减）
任何温度下，都有ΔＧ&０ （反向自发）
ΔＨ&０ （吸热）
ΔＳ&０ （熵增）
升高温度，ΔＧ&０ （高温下正向自发）
ΔＨ&０ （放热）
ΔＳ&０ （熵减）
降低温度，ΔＧ&０ （低温下正向自发）
ΔＨ和ΔＳ同号时，存在转折温度。 正确理解反应热△H的单位的含义深圳市龙华中学
518109化学反应都伴随着能量的变化，通常表现为热量的变化。人们用热化学方程式来表示化学反应中放出或吸收的热量，用焓的变化来描述与反应热有关的能量变化。如N2
+ 3 H2 ≒2 N H3
△H = -92.2 kJ/mol。那么，我们怎样正确理解反应热△H的单位的含义呢？新世纪版《化学反应原理》（选修）第5页“资料在线”中“△H的单位中mol-1的含义”部分内容，用两个例子对“反应热△H的单位的含义”阐述得很清楚。但是“反应焓变单位中的mol-1表明参加反应的各物质的物质的量与化学方程式中各物质的化学式的系数相同”，语言过于抽象与罗嗦，着实让学生不得概念的要领，学生们在具体运用时也感到无所适从。对于反应热△H单位的含义，孟庆珍、胡鼎文等的《无机化学》(上册，北京师范大学出版社出版)第358页上的解释是：反应热△H的单位是kJ/mol，为每摩尔反应的热效应。对于a A+b B→c C+d D的反应，每摩尔反应是指a mol A与b mol B作用生成c mol C和d mol D的反应。从微观来看，它是反应式中所示的物质粒子以基本单元数N0为单位按其化学计量数的量进行的反应。因此，不能离开相应的具体反应式来说反应热△H。由上面的内容我们可清楚的这样理解反应热△H单位的含义：焓是容量性质，△H的大小与物质的量成正比，反应热△H的单位是kJ/mol。在书写反应化学方程式时须注意△H值应该与一定的反应式相对应(如在298K)。H2 + 1/2 O2
△H= -286 kJ/mol而 2 H2 + O2
═ 2H2O(l)
△H= -572 kJ/mol。此mol -1 已不是指1 mol H2或1mol O2 ，而是指“1mol反应”。所谓1mol反应可以是1 mol H2和1/2 mol O2起反应，也可以是2 mol H2和1mol O2起反应，前者放热286 kJ，后者放热572 kJ。所以△H应和某个热化学方程式相对应，从而使“1mol反应”有明确的含义，笼统地说反应热是多少kJ/mol容易引起误解。 同时，“燃烧热”和“中和热”是两种特殊反应热△H的概念，燃烧热是以1mol物质完全燃烧生成稳定的氧化物所放出的热量来定义的，而中和热是以生成1mol H2O(l)所放出的热量来定义的。因此在书写它们的热化学方程式时，应以燃烧1mol物质或生成1mol H2O(l)为标准来配平其余物质的化学计量数。
教学中我们还可以把反应热△H概念的涵义变通为：在对应的化学反应中，其中的某种物质的物质的量为1mol变化量时的热量变化值。如对于合成氨反应的热化学方程式可以有如下三种形式：
+ 3 H2 ≒2 N H3 △H1 = -92.2 kJ/mol
+ 3/2 H2 ≒ N H3 △H2 = -46.1 kJ/mol
+ H2 ≒ 2/3 N H3 △H3 = -30.7 kJ/mol
我们可以这样分别可看作：⑴式的△H1表示合成氨反应中每消耗1 mol 氮气可放出92.2kJ的热；⑵式的△H2表示合成氨反应中每生成1 mol氨气可放出热量46.1 kJ的热；⑶式的△H3表示合成氨反应中每消耗1 mol 氢气可放出30.7 kJ的热。三者的关系是 △H1 = 2 △H2 = 3 △H3 。
如此，在热化学方程式中的化学计量数不再是任意数比了，而是至少有一种物质(反应物或产物)前面的计量数要等于1，这时的△H (kJ/mol)才是与热化学方程式对应的确切值。当然其余物质的计量数可以是分数或整数。http://202.113.66.66/xjjpkpx_2005/gchhx/wlkejian/derzh/erzhsanjie.htmhttp://cache.baidu.com/c?word=%EC%D8%3B%B1%E4&url=http%3A//estar%2Erdfz%2Ecn/Resource/GZ/GZHX/HXBL/XDHXJC/zw%5F0044%2Ehtm&b=0&a=23&user=baiduhttp://www.xkwx.com/xjc/Html/Article/Class910/xxx/Class5083/Class5146/Class.html
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【求助】荧光定量PCR引物设计！急急急！！！
页码直达：
这个帖子发布于12年零212天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
设计荧光定量PCR引物时,对已知的基因序列有什么要求?我现在得到了一个基因的cDNA编码区的全序列.现在我想做该基因的时序表达.请问根据已知序列可以设计荧光定量PCR的引物吗?应该怎么设计? 多谢!不需要重复发这么多贴！能帮助你的战友自然可以看到的！所以把你的其他贴子锁定了！切记以后不要再这么反复发贴了！鉴于你是新手，第一次暂且给予告诫，再次出现同样问题，我们将给予适当的处理！希望你能配合！
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zhoujueyu 编辑于
我觉得对已知的基因序列要求并不严格，你要扩增的就是这个序列了，是没有办法改变的。至于根据你的基因序列当然可以设计引物了。首先看你的荧光定量是用的什么方法。荧光定量PCR分为以下几种：荧光染料直接与产物结合
1.SYBR green ——特异性结合双链，释放荧光信号
荧光标记探针
1.Taqman双荧光标记探针
2.molecular Beacon荧光标记探针
3.荧光标记杂交双探针所以说不同的方法设计稍有区别，但是基本原则都差不多：以下列出18条原则，可供参考：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，有以下一些要点：1.&&引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。2.&&引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。3.&&引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。4.&&引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55－80℃之间5.&&ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。6.&&可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。7.&&Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。8.&&引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。9.&&以公式(4×G/C + 2×A/T–5)计算Tm值，即退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度。4-6℃的差别似乎对PCR产量影响不大。最好，保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内10.&&要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。11.&&在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。12.&&如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。13.&&引物的唯一性：为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。14.&&引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。15.&&对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。16.&&值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。17.&&在设计克隆PCR引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低，这种PCR需要灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。18.&&如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下）要提醒的一点是如果用发夹形的寡聚核苷酸探针 ，那么要设计成发夹的结构，有一个loop和一个stem,Loop 能和靶序列互补,而Stem 是由互补序列组成的，再者就是标记染料，那就和引物设计关系不大了。
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这里有一个primer3在线网址，你可以将cDNA序列粘贴到空框里，然后点击pick
primers就行。
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