告检测出来有一个嗜酸性嗜酸性粒细胞计数偏低最高300与600。
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1000cells/mL能用计数板检测出来吗？
& && &&&最近在做细胞毒性实验，要对细胞进行计数，想请教3个问题。
& && &&&1、细胞计数有哪些方法，哪种精度高？
& && &&&2、血球细胞计数板法对样品细胞浓度要求是什么范围？
& && &&&3、如果我的样品种细胞被我的药品毒害死了大部分，我要检测剩余少许活细胞，除了浓缩，还有什么好办法。
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用CCK8或者 CellTiter-Glo®应该可以测出来
(正式写手)
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虫号: 2724676
★ cxq2011(金币+3): 谢谢参与
细胞计数一个就是血球计数板 还有自动的计数仪器，1000cells/mL&&你这细胞密度也太低了吧 ，台盼蓝染色可以区分死活细胞
cxq2011(金币+3): 谢谢参与
cxq2011(金币+3): 谢谢参与
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细 胞 周 期 的 检 测 (Pagano et al.2000)
细 胞 计 数
0.25% 胰蛋白酶溶液、无血清培养液。
显微镜、计数板。
3 ) 操作规程
(1) 准备计数板：用乙醇清洁计数板和专用盖玻片，用绸布轻轻擦干。
⑵制备细胞悬液：制备单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于 IO4 个/ml。如果细胞数很少，应将悬液离心，重悬浮于少量培养液中。
(3) 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。
⑷ 计 数 ：在显微镜下，用 IOx 物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
计算：细胞数/毫升原液=(4 大格细胞数之和/4)xl 〇4 x 稀释倍数。
4 ) 注意事项
⑴消化单层贴壁细胞，要分散良好。
(2) 取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤其要注意这一点。镜下计数时，遇见 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占 K )%以上，说明消化不充分，或细胞数少于 200 个/I O m m 2 或多于 500 个/I O m m 2 时，说明稀
释不当，需要重新制备细胞悬液。
5 ) 结果判读
一般根据计数结果能够绘制出细胞的生长曲线，从而算出倍增时间。值得注意的是，倍增时间只能反映细胞周期，但是并不等同于细胞周期。
细 胞 生 长 曲 线
只有生长稳定的细胞才能绘制细胞生长曲线 (司徒镇强等 1996)。此处介绍用 MTT 法来进行生长曲线测定的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 M T T 还原为难溶性的蓝紫色结晶物(formazan) 并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。 DMSO 能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在 490n m 波长测定其 OD值 ，可以间接反映活细胞数量。在一定范围内， MTT 结晶物形成的量和细胞数成正比。此方法灵敏度高、重复性好、操作简单且没有放射性污染。
(1) M T T 溶液: 称取 250mg M T T ，加人 50 ml P B S (0.01mol/L ，p H 7. 4)，磁力搅拌 3 〇 min，
用 0.22 um的滤器除菌，分装，代 保 存 。 2 周内有效。
(2) 含 10% 胎牛血清的 R P M I 1640 培养液、 0.25% 胰蛋白酶、 D M S O 。
显微镜、振荡仪、酶联免疫检测仪、 96 孔培养板、移濟器、吸管、离心管。
4 ) 操作规程
(1) 接种细胞、培养细胞。
(2) 呈 色 ：培 养 3? 5 天后，每孔加入 M T T 溶液 (5m g /ml)20ul， 3 7 ℃ 继续孵育 4 h ，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮培养的细胞，需要离心、弃去孔内培养液。每孔加入 150ul D M S O , 振 荡 lOmin，使结晶物充分溶解。
(3) 比色、记录结果。以时间为横轴、光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
5 ) 注意事项
(1) 选择适当的细胞接种浓度。在进行 MTT 试验前，对细胞要测定其贴壁率、倍增时间和不同接种细胞数时的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样才能保证 M T T 结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。
(2) 避免血清干扰。 一 般选择小于 10% 胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余的培养液。
(3) 设定空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，其他试验步骤保持一致。最后呈色时，以空白孔为零。
6 ) 结果判读
细胞周期与细胞群体倍增时间是不同的概念。倍增时间是指在对数生长期细胞数量 增 加 1 倍所用的时间，这一时间内一般有些细胞参与分裂，有些细胞可能不分裂，有些可能分裂两次或数次，但是细胞总数增加 1 倍。一般来说，细胞周期短于细胞倍增时间。
流 式 细 胞 术
流式细胞仪能够分析细胞或颗粒物的各种参数，如 DNA、 RNA、 蛋白质含量及这些物质在细胞周期中的变化。用 D N A 直方图可以得网细胞周期中各时相细胞的百分比及 D N A 含量。 G 0 /G1 期细胞 的 D N A 含量是 2n ， G 2/M 期细胞的 D N A 含量是 4n ， S 期细胞的 D N A 含量介于 2n 和4n 之间。
在细胞周期中用 PI 单独染色无法将 G0、 G1期细胞分开，可 以 用 DNA/RNA 双染色将两者分开，这是因为 G0期细胞不合成 RNA。
流式细胞仪还能够定量细胞总蛋白、定量细胞特定功能蛋白、定量细胞内钙离子等，结合细胞周期的检测，可以观察这些物质在细胞周期中的变化
1 ) 制备单个细胞悬液
⑴悬浮生长细胞。用 P B S 洗漆、配制成 IxlO6? 2xl 〇 6个/m l 的细胞悬液备用。
(2) 单层培养的细胞。通常采用酶消化法分散细胞，制成单个细胞悬液，备用。
(3) 实体组织可采用机械法、化学法、酶消化法分散组织细胞。通常是联合应用。细胞悬液用 P B S 洗涤，备用。
2 ) 样品固定
除了分选活细胞或分析活细胞外，都应该固定细胞。
⑴ 甲 醛 法 ：在细胞悬液中，加人等体积的 8 % 甲醛-盐水 G ，代 固 定 12? 18 h。 常用于 Fuelgen 染色。
⑵ 乙 醇 法 ：细胞悬液离心，弃上清，用 5m l 4℃ 预 冷 的 盐 水 G 重悬，缓慢加入-20℃ 的 9 5 % 乙 醇 15m l ，使其终浓度为 7 0 % ，冰 浴 30 min。常 用 于 Hoechst、 溴化乙键、碘化丙锭 (PI)、异硫氰酸荧光素等染色。
(3) 丙酮法：用生理盐水悬浮细胞，加入冷丙酮，使其终浓度为 8 5 % 。常用于免疫荧光染色。
盐水 G 的配制：葡萄糖 1.lg、 NaCl 8 g 、 KCl 0.4 g 、 Na2 H P O 4 o 12 H 20 0.39 g 、 K H 2P 〇 4 0.15 g ，加 蒸 馏 水 至 1L 。待完全溶解后，称 取 M g S O 4 J H 2O L 54 g 、 C a Cl2. H 2O 0. 16 g ，依次溶解于上述 I L 盐溶液中。
3 ) 细胞染色
这里仅介绍几种常见的染色。
(1) PI 染 色 。 P I 能嵌人双螺旋之间，不能通过完整的细胞膜。在染活细胞时要将细胞固定或打孔，另外，染 D N A 时需要用 R N A 酶处理细胞。激发波长为 488n m 。
a. P I 15 mg，枸橼酸钠 O.lg ， NP-40 0.3mI，加 蒸 馏水至 100 ml, 4 ℃ 避光保存。
b. 将等体积的单细胞悬液和 PI 染液混合， 4 ℃ 放 置 15——20 min。
c. 测量前将样品用 3 0 0 目尼龙膜过滤。
(2) 光辉霉素 (M I ) 染色。 M I 只 与 D N A 以非共价键结合。激发波长为 488n m 。
a.M I 染液的配制：商品 M I 每支含 M I 2.5m g ，用 15 mmol/L M g C l 2 及 150 mmol/L N a C l 溶 液 将 M I 配 制 成 100pg/m l 溶液， 4 ℃ 避光保存。
b. 制备单细胞悬液：活细胞悬浮于含有 5%——10% 胎牛血清的培养液中；经 7 0 % 乙醇固定的死细胞悬浮于生理盐水。细胞密度为 IO5 ? IO7 个/ml。
c. 将细胞悬液与等体积的 M I 染液混合，室 温 染 15——20 min。
d测量前将样品用 3 0 0 目尼龙膜过滤。
&3) D N A 和 R N A 双重染色。
a. 制备活细胞悬液，悬浮于培养液或 P B S 中；用 蒸 馏 水 溶 解 Hoechst33258, 用P B S 稀 释 成 lmmolTL 的储存液，代 避 光 保 存 。
b.将 5 UMol/L 的 Hoechst33258 染液与等体积细胞悬液混合，37℃ ，避 光 60? 90 min。
c. 继 续 加 人 5umol/L 的 P Y 染 液 ， 37℃静 置 45 min。
d. IOOOg 离 心 lmin，除去染液，用 RPMI1640 培养液悬浮细胞。
e. 用紫外光 (351? 363n m ) 激 发 Hoechst33258 测 定 D N A ，用 476n m 波长激发 P Y 测定 R N A 。
4 ) 注意事项
⑴ 在 制 备 样 品 时 ，离心次数不要过多，防止细胞丢失或凝集成块。
(2) 消化细胞时应该注意各种不利因素，注意酶的浓度和活性。
(3) 细胞固定时间不能过长。不要使用冰醋酸-乙醇、苦味酸及含汞固定剂。
(4) 调 试 F C M 时 ，应使用理想的标准品，以便获得较高的分辨率。
分 离 、检 测 处 于 不 同 时 相 的 细 胞
离心淘洗法
有些细胞』处于不同时相时的体积和重量会有明显差别，可以通过密度梯度离心来分离。该方法操作简单、省 时 ，得到的细胞群体均一性较好，成本低，并且不扰乱细胞生长。但 是 ，对于多数种类的细胞并不适用。
2 ) 操作规程
(1) 细胞培养⑵淘洗前将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，并 重 悬 于 20m l(5 ml 分离室)或 100 ml(5 〇 m I 分离室) 冷的组织培养液中。
(3) 分 离 所 需 的 最 佳 细 胞 数 ， 5 ml 分 离 室 为 4xl 〇 7? 6xl07 个 细 胞 ， 50m l 分离室为
4XlO8? 6xl 〇 8 个细胞。
(4) 这里给出分离 CHO 细胞的步骤：
a用冰浴冷却的含血清的完全培养基淘洗 (血清含量根据细胞类型的不同来决定)。
b. 调转速和流速，使细胞停留在分离室。
c. 借助泵的作用加入样本，不要使标本进入气泡清除室。
d. 加样后即开始收集每一个转速下洗脱出的液体，转速的增加要使各组分洗出细胞的体积稳步增加。
e. 分离过程中，每一流分细胞数、细胞体积均需检测。
f.对每一流分，从体积分布以校准常数求出中位数体积。校准常数由统一大小和密度的乳胶颗粒推导出。
g.以体积中位数为基准，选择处于不同时相的细胞以备进—步研究。每一流分的均一性都用流式细胞仪来评估。
3 ) 注意事项
淘洗系统应在实验前 12? 24 h 内消毒，以免细菌或酵母污染。
M 期细胞振荡脱落法
单层生长细胞在 M 期变圆，对瓶壁的锚着减弱，易于游离到悬浮液中。该方法不干扰细胞生长，但是分离的细胞数少且只能用于贴壁生长的细胞。
2 ) 操作规程
轻轻摇动或在边台上叩击培养瓶。使培养液冲刷瓶壁，然后吸出培养液以收集頁期M胞 。从 各 培 麵 中 收 集 培 养 液 、集中、离 心 ，使 皿 期 细 臓 积 林 。细 胞 重 悬 用 流式细胞仪来评估均一性，供进一步的分析。
药物诱导同步化——同步化在 G 0/G1 期
血清撤离可以使细胞停滞在 G0 期 ，添加后重新进人细胞周期。
2 ) 操作规程
⑴ 以 汇 合 密 度 的 3 〇% 重悬细胞、培养，血清浓度依细胞种类的不同选定，一般是0—— 0 . 5 %
(2) 血清饥饿 24? 48 h 后 ，细胞进人 G0 期样的状态
⑶ 重 悬 细 胞 ，用含血清培养基培养，细胞将重新进入细胞周期不同时间取样流式细朦 评 估 均 —性
3 ) 注意事项
⑴ 首 先 蔚 請 楚 雛 生 长 細 麵 倍 獅 间 雜 可 麵 的 汇 合 優 大 细 胞
(2) 血清撤出需要掌握最佳的撤除量及撤除时间
(3) 有些细胞不适合用血清饥饿法。 °
药物诱导同步化一 同步化在 G 1 期早期
Lovastatin 抑 制 HMG-CoA 还原酶，可使细胞停滞在极早的 G1 期。
用 9 5 % 乙醇稀释 Lovastatin 到 50m g /m l ，溶 液 中 加 入 lm ol/L 的 NaOH 调 高 pH，再用 lm ol/L 的 H C l 中和。活化后用无菌去离子水稀释至 10 mm 〇 l/L ， -20℃储存备用。
3 ) 操作规程
(1) 以最大细胞密度的 3 0 % 培养细胞，培养液中加入 Lovastatin。浓度依照细胞种类的不同而调整，一般 是 10? 60umol/L 。
(2) 用 PB S 洗 2 次以解除 Lovastatin 的作用，然后用含有甲经戊酸的培养基培养，密 度 是 汇 合 密 度 的 30%——40%。甲轻戊酸的浓度应在所用 Lovastatin 浓度的 1 〇〇倍以上。
4 ) 注意事项
很多细胞经 Lovastatin 处理后，在恢复中 G1 期被延长了。
药物诱导同步化一 同步化在 G 1 期晚期
Mimosine 是从植物中获得的，能将细胞阻滞在 G1 期晚期。
Mimosine 用P B S 溶 解 ，终 浓 度 是 100 mmol/L ， 4 ℃储存备用。
3 ) 操作规程
(1) 指数生长期细胞在含 1 〇〇 ?400^imol/LMimosine 的培养液终，培 养 16——24 h。
(2) 用 PBS 洗 2 次 ，解 除 Mimosine 的阻滞作用，以汇合密度的 3 0 % ? 4 0 % 重悬于培养液中，继续培养。
药物诱导同步化—同步化在 G 1/ S 期交界点
T d R 是 D N A 合成抑制剂，加 人 T d R 后一段时间，所有细胞将处于 S 期 ，但是可能处 于 S 期的任何时期。
2 ) 操作规程
(1) 用 P B S 将 T d R 稀 释 ，过滤除菌， -2O ℃ 储存备用。
⑵ 将 指 数 生 长 期 细 胞 用 含 有 2 mmol/L T dR 的新鲜培养液培养 (TG 2+TM +TGl)， 此时细胞位于 G 1A 期交界点和 S 期的任何时期。
(3) 用 P B S 洗 2 次 ，解 除 T d R 的抑制作用。用新鲜培养液培养一段时间 (要 小 于 t G1)，使得原来处于 S 期末的细胞没有进入 S 期 ，原来处于 G 1A 期交界点的细胞离开 s 期 。
⑷ 再 次 进 行 TdR 抑 制 ， l 2——l4 h。 这时所有细胞都处于 G1A 期交界点。取 样 ，用流式细胞仪评估细胞周期时相。
(5) 除去二次 T d R 的抑制作用，释放后不同时间取样，可以获得需要的、位于不同时相的细胞，用流式细胞仪评估后，可供进一步检测。
3 ) 注意事项
这是应用最广泛、也是最被认可的细胞周期同步化技术。第一次的释放时间长短是至关重要的。
M 期细胞同步化
用秋水仙素、秋水仙胺或 nocodazole 等 ，能抑制细胞分裂，将细胞阻断在 M 期 。该法常常与 M 期细胞振荡脱落法联合应用。
2 ) 注意事项
(1) 由于该方法常常造成细胞的不可逆变化，所以此方法有一定争议。
(2) 药物浓度、作用时间都需要摸索
干细胞的研究也需要从分子生物学水平上进行，一些基本的分子生物学实验，如凝胶电泳、载体的构建、转染细胞等，在干细胞实验中也频繁用到。由于生命科学研究的发 展 ，分子生物学研究技术也越来越多，越来越完善，分子生物学实验指南就概括了所有基本的实验操作，各种反应试剂盒的出现使实验操作更加简便，也提高了实验的效率。本节就干细胞实验中用到的常规操作进行简单的描述。
细 胞 组 分 的 提 取
细胞组分的提取主要包括核酸的提取、蛋白质和细胞器的提取 (奥斯伯等 2001)。核酸的提取又包括 D N A 的提取和 R N A 的提取。D N A 的提取中常用的是细菌质粒 D N A 的提取和细胞基因组 D N A 的提取。
D N A 的提取
质 粒 D N A 的提取
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒 D N A 分子。其基本原理为：当菌体在 N a O H 和 S D S 溶液中裂解时，蛋 白 质 与 D N A发生变性，当加入中和液后，质 粒 D N A 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体 D N A 不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。质 粒 D N A 的提取可分为小量制备质粒 D N A 和大量制备 D N A 。小量制备 D N A 采用Promega 公 司 的 Plus S V Minipreps D N A 纯化提取试剂盒，大量制备 D N A 采用碱裂解法以及氯化铯/溴化乙锭平衡离心法，碱裂解法可能是最常用的质粒制备方法，该法不仅相当快捷可靠，而且可获得相当纯净的粗制 D N A ，而氯化铯/漠化乙锭平衡离心法则可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒 D N A 。但它需要使用溴化乙锭，并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。
1 ) 小量制备
质 粒 D N A 的小量制备主要采取 Promega 公 司 的 D N A 小量提取试剂盒 (WizardR PlusS V Minipreps D N A Purification System)
(I) 材料：含 抗 生 素 的 L B 琼脂糖平板、含 抗 生 素 的 L B 的培养液、 9 5 % 乙醇、离心 机 、 1.5 ml E p 管 。
⑵ 方 法 (图 6.1):
a. 从 L B 琼脂糖平板上挑选单克隆菌落，转 入 1? IOml L B 培养液中培养。对于高拷贝质粒，建议培养液不要超过 5m l ，因为培养液再多，由于试剂盒的微型柱的限制，质 粒 D N A 的得率不会再有提高；对于低拷贝质粒，可多加培养液，但 不 要 超 过 IOml, 因为培养液过多很容易导致细胞裂解液难以有效分离和质粒D N A 的污染
b.将培养管在摇床中 3 7 ℃ 过夜培养，培养时间可以根据培养液容量进行最优化以提 高 质 粒 D N A 的得率，但如果培养时间过长，则会由于细菌营养不良、老化而死亡、裂解导致质粒 D N A 的得率下降。
c. 收 集 l——5 ml(高拷贝质粒) 或 IOml(低拷贝质粒滴液于1.5 ml E p 管中， 1 〇〇〇 g 离心 5 min，弃上清，将 E p 管倒置于吸水纸上以除去残存的液体。
d.加入 2 5 0 ul 细胞重悬液，剧烈振荡将沉淀重悬，这一步非常重要，一定要完全重悬细胞。
e.再 加 入 2 5 0 ul细胞裂解液，轻轻颠倒混勻 4 次 ，静 置 l——5 min 至细胞悬液变清。
f.加 入 1 0 0 碱性蛋白酶液，颠倒混勻 4 次 ，室温静置 5 min。
g.加入 350 ul中和液，然后立即颠倒混勻 4 次 。
h.室 温 、14 00g离 心 1 〇 min。
i.将圆形柱放入 2m l 的收集管中，每个样品一套。
j.将 步 骤 h 离心后的上清液移入步骤 i 的圆形柱中，注意不要移入白色沉淀。
k.室温、 14 OOOg 离 心 lmin，拿开圆形柱，将收集管中的液体倒掉，再将圆形柱放入收集管中。
l.向圆形柱中加入 750 ul 用 95% 乙醇稀释的清洗液。
m.重复步骤 k 。
n.用 2 5 0 ul 柱洗液重复清洗步骤。
o.室 温 、 14 OOOg 离心 2 min。
P.将圆形柱转移到一个新的 1.5 ml 的 E p 管 中 ，注意圆形柱不要带有柱洗液，如果有的话就室温下 14 OOOg 再 离 心 lmin。
q.向 圆 形 柱 中 加 人 1 〇〇u;双蒸水，室 温 下 14 OOOg 离 心 lmin，以 便 质 粒 DNA 从圆形柱中洗脱。离心后弃去圆形柱。
r . 测定质粒 DNA 的浓度， - 2 0 ℃或更低温度保存。
2) 大量制备
(1) 材 料 ：带 有 质 粒 的 大肠杆菌菌株、含 有 适 当 抗 生 素 的 L B 培 养 基 、葡萄糖/Tris/EDTA 溶液、卵清溶菌酶、 NaOH/SDS 溶液、 pH 约 5 .5 的 3mol/L 乙酸钾溶液、异丙醇、 TE 缓冲液、 CsCl、 10 mg/ml 溴化乙锭溶液、 DowexAG50W-X8 阳离子交换树脂、
CsCl/ TE溶 液 ： 100gCsCl 溶 于 100mlTE 缓 冲 液 中 、TE 缓冲液/0.2mol/L NaCl,100% 乙醇 和 70% 乙醇。
⑵ 方 法 ：
a.往 2L 烧瓶中加入 500 ml 含有适当抗生素的 L B 培养基，然后加入 5 ml 过夜培养的带有所需质粒的大肠杆菌培养物，再 于 3 7 ℃培养至饱和状态。
b. 4℃ 、 6000 g 离 心 IOmin， 用 4 ml G T E 溶液重悬沉淀，并转移到一个容积不小于 20m l 的高速离心管中。
c. 加 入 Iml 新配的含 25m g /m l 溶菌酶的 G T E 溶 液 ，重悬沉淀，于室温放置 l 〇 min。
d . 加 入 IOml 新 配 的 NaOH/SDS 溶液，并且轻轻混勻直至液体变得均一、清亮而黏稠，于冰上放置 l 〇 min。
e . 加 入 7.5 ml 乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰 上 放 置 IOmin。
f. 4 ℃ 、 2000 g 离 心 IOmin, 将上清轻轻倒入另一个干净的离心管中，如果有可见的漂浮物可用数层纱布过滤。
g. 加 入 0.6 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 5? 10 min。
h.室 温 、 1500 g 离心 10 min。
i.加入 2 ml 70% 乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥。
j.将沉淀溶于 4 mlTE 缓冲液中，加 人 4.4 gCsCl， 溶解后，再 加 入 0.4 mllOmg/ml 溴化乙锭
注意:、溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染，操作时应戴手套，并且妥善处理。
k.将溶液转入一个 5m l 的 qUick-seal 快速封口的超离心管中，酌情往管中加入CsCl/T E 溶液，封好离心管， 2 0℃ 、 500000g 离 心 3.5h或 2 〇℃ 、 350000g 离心4 h 以上。
l.首先从管的顶端插入一支 20 G 针头，然后用带另一 20 G 针 头 的 3m l 注射器将质粒带吸出
注意：为了防止紫外线对眼睛的严重损伤，应戴紫外防护眼镜或面罩。操作溴化乙锭时要戴手套。
m.进行第二次超速离心 (步骤 k 和 1)，除去混杂的 R N a 和染色体 D N A 以获得更高纯度的质粒。
n. 将 质 粒 D N A /E B 溶液的 1.5?2 倍体积装 Dowex A G 5 〇 W -X 8 柱 子 ，用数倍体积的 T E /0.2mol/L NaCl 溶液清洗和平衡柱子。
o. 用注射器将混有溴化乙锭的质粒 D N A 溶液直接加到树脂的顶部，注意不要摇动树脂。
P立即收集流出液，然 后 用 2 倍于上样体积的 TE/0.2mol/L N a C l 溶液洗脱柱子 2次 。
q.加 入 2 倍 体 积 100% 乙醇于室温或一 20℃沉淀质粒 D N A 。4℃ 10 0 00g 离心IOmin
r. 沉 淀 用 7 0 % 乙醇洗涤 1 遍 ，真空干燥，溶 解 于 T E 缓冲液，并 于4℃ 保 存 。
基 因 组 D N A 的提取
基因 组 D N A 的提取主要采用的是 Promega 公司的基因组 D N A 提取试剂盒 (WizardR D N A Purification Kit)
I) 造血干细胞及血细胞基因组的提取
(1) 材 料 ： 5 〇 m l 离心管，异丙醇， 7 0 % 乙醇， 37℃ 和 65℃ 水 浴 。
(2) 方法：
a. 向 50m l 离心管中加入 30m l 细胞裂解液。
b.轻轻摇晃装有血液的管子让血液混匀，然后将样品 (IOml) 加入含有裂解液的离心管中，颠 倒 5? 6 次混匀。
c.室温下静置 IOmin 以充分裂解细胞，然后室温、 2000 g 离 心 l 〇 min 。
d. 在不触及肉眼可见的白色沉淀的基础上尽可能吸弃上清，尽管这样，还会有大约 1.4m l 的液体残留。
e. 剧烈振荡离心管直至沉淀全部重悬。
f. 向离心管中加入 IOml 核裂解液，吹打溶液 5——6 次以便细胞充分地裂解。溶液这时应该非常黏稠，如果仍有细胞团存在，那么将离心管放入 37℃温箱中直至细胞团溶解。如 果 放 入 温 箱 I h 后仍有细胞团，那就再加入 3m l 核裂解液，然后再放入温箱中至细胞裂解。
g. 加 入 RNase A 至终浓度为 20ug/m l , 将离心管颠倒 2? 5 次 ，然后将离心管放入37℃ 温 箱 15 min，然后取出冷却至室温。
下 ， 13 000——16 OOOg 离心 lmin。
j.小心地吸弃乙醇。由 于 D N A 沉淀非常松散，在吸弃乙醇时要避免将沉淀吸入移液管中。
k.将 E p 管倒置在吸水纸上，室温干燥沉淀 10—— 15 min。
1.向离心管中加入 800 ul DNA 再水化液，在 65 丈水浴锅中孵育 I h 或 过 夜 ，让 DNA 再度水化，期间间歇性地轻轻敲打离心管使沉淀溶液充分混合。
m.2——8℃ 保存基因组 DNA。
3 ) 酵母基因组 D N A 的提取
( 1 ) 材 料 ：YPD 肉汤培养基、，5 〇 mmol /L EDTA(pH 8.0)、 2 20mg/mL 裂 解 酶 、异 丙 醇 、7 〇% 乙醇、 1.5mIEp 管 、 37 3/4
和 6 5 ℃水浴。
⑵ 方 法 :
a.从在 Y P D 肉汤培养基中培养 2 0 h 的培养液中取 Im I 放 入 1.5 ml E p 管中
b.室温、 13 000? 16 OOOg 离心，吸弃上清。
c.加入 293 叫 50 mmol/L E D T A ，使沉淀彻底重悬。
d. 加 入 7.5ul 20m g /m l 的裂解酶液，轻轻摇晃 E p 管 4 次使溶液混合。
e. 将样品放入 37 ℃温箱中孵育 30? 60 min，让细胞壁彻底消化，然后冷却至室温。
f。13 000? 16 OOOg 离心 2 min，弃上清
g. 向 E p 管中加入 300ul 的核裂解液，轻轻颠倒 E p 管混合。
h. 再 加 入 IOOul 蛋白质沉淀液，高速剧烈振荡 20s。
i . 冰上静置 5 min。
j. 13 000——16 OOOg 离心 3 min。
k. 将上清移入一个新的 E p 管中，并 加 人 3 0 0 ul 异丙醇。
1.轻轻地混合溶液直至白色的丝状 D N A 形成可见的团块。
m. 13 000? 16 OOOg 离心 2 min
n. 小心弃去上清，用吸水纸吸干残余液体，然 后 向 E p 管中加入
% 乙醇，轻轻颠倒 E p 管 ，让乙醇清洗 D N A 沉淀。
o. 13 000? 16 OOOg 离 心 2 min。 小心弃去乙醇。
P.用吸水纸吸去多余液体，空气中干燥沉淀 10——15 min。
q . 向 E p 管中加入 50ul D N A 再水化液。
r. 加 入 1.5 ul 的 R N a s e 液以纯化 D N A 样品。剧烈振荡样品 ls，高速离心 5s，收集 液 体 3 7 1 孵 育 15 min。
s. 65上升到水浴锅中孵育 I h 或 4
过夜，让 D N A 再度水化，期间间歇性地轻轻敲打离心管使沉淀溶液充分混合。
t. 2? 8上升到保存基因组 DNA。
R N A 的 提 取
分离纯净、完 整 的 R N A 分子对于干细胞的分子生物学方面的实验是很重要的，是进行基因表达分析的基础。 R N A 可以拷贝成双链 D N A ，并克隆，最终获得相应于干细胞 的 c D N A 文库。对 R N A 结构和生物合成的分析有助于干细胞基因表达的研究。本节只简单介绍 Trizol 法提取干细胞总 R N A ，参考了 Invitrogen 公 司 的 Trizol 操作手册。
口罩，手 套 ， D E P C 水 ， E p 管 ，枪头， D E P C 水高压后配制的 7 0 % 乙醇。
(1) 去离子水配制 D E P C 水 。
(2) E p 管 ，枪头完全浸泡于 D E P C 水中，过夜后取出高压，烤干后使用。
(3) 浸泡后的 D E P C 水高压后还原成无 R N A 酶的水， 4 ℃ 保存。
(4) 25c m 2 培 养 瓶 内 细 胞 ，如果是 贴 壁 细 胞 ，吸 弃 培 养 液 ，加 人 Iml Trizol 液吹打 细 胞 至 细 胞 脱 落 ；如果是悬浮细胞，将 溶 液 离 心 后 去 上 清 ，加 入 Iml Trizol 吹悬沉 淀 。
(5) 加 入 0.2ml 氯仿/ml Trizol，剧 烈 振 荡 15s，室 温 静 置 1 〇 min 。
(6) 4℃ 、 12 OOOg 离 心 15 min，离心后溶液分为 3 层 ，下层为酔/氯仿层，中间为蛋白质层，无色水相的上层是 R N A 层 ，占溶液总体积的 6 0 % 。
(7) 吸取最上层入一新 E p 管 ，注意勿将中间层的蛋白质吸出。
(8) 加 入 0.5m l 异丙醇/ml Trizol 液 ，颠倒混勻，静 置 lOmin。
(9) 4℃ ；、 12 OOOg 离心 lOmin。
(10) 弃上清，加 入 Iml 7 5 % 乙醇/ml Trizol 液 ，轻轻混匀勿振荡，用于洗涤 R N A 沉淀。
(11) 4℃ 7500 g 离心 5 min。
(12) 弃上清，小心吸去 E p 管壁的乙醇，室温干燥。
(13) 加入步骤 (3) 中的 D E P C 水 30——4 〇 ul 溶解沉淀。
(14) 步骤 (13) 得到的溶液用核酸分析仪检测浓度以及纯度。
(15) - 2 0 ℃ 或更低温度保存提取的 R N A 溶液。
蛋 白 质 和 细 胞 器 的 提 取
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理有两方面：①用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；②将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱 、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下三个阶段：细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓缩、干燥和保存。
① 超 声 波 ；② 0.02? 0.05mol/L 磷酸盐和碳酸盐；③凝胶过滤层析柱及相应的介质和缓冲液；④装柱配套用具或凝胶 C 槽 ；⑤缓冲液槽；⑥ 蠕 动 泵 ；⑦ U V 紫外检测器；⑧ 分部收集器；⑨ Diaflo 超滤膜。
⑴细胞的破碎及细胞器的分离：将细胞在-20 丈以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎，差速离心弃去部分杂质。
(2) 蛋白质的粗提：向溶液中加入磷酸盐和碳酸盐 (磷酸铵和碳酸铵)，随着盐浓度的升高，蛋白质从溶液中析出，收集沉淀。
(3) 在盐析蛋白质的同时准备凝胶过滤层析柱，如果凝胶过滤的介质是干粉，则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。切勿用磁力搅拌器搅拌，让凝胶颗粒自然沉降，吸去或倾去不沉降的细小颗粒，或者根据厂商的使用指南进行处理。对预溶胀的凝胶，在布氏漏斗或玻璃烧结漏斗中用大量缓冲液洗去防腐剂。重悬于等体积的凝胶过滤缓冲液，倾人细颈过滤瓶中，使用前进行脱气。
在远离过往通道及直接光照的恒温环境，将层析柱垂直安装在稳固的实验室支架上。用一注射器将凝胶过滤缓冲液从柱子的输出管注入柱子，至缓冲液达到柱子支持体平面之上，注射器留在输出端以堵住柱子。
沿着一根顺柱子内壁而放的玻璃棒将凝胶混悬物倒人柱子至所设高度，再小心往凝胶顶部加入 I c m 高的一层缓冲液，并连接缓冲液储存容器，取去堵着柱子输出管的注射器 ，用 2? 3 倍柱床体积的缓冲液洗柱子。
(4) 流尽柱子凝胶顶部上面的缓冲液，关 闭 其 输 出 管 。加 人 相 当 于 柱 床 体 积 1%——5%的蛋白质样品。开放输出管，让样品流进柱床，凝胶上面的柱子内壁以缓冲液冲洗，然 后 在 凝 胶 顶 上 用 吸 管 加 入 I c m 高的缓冲液层，重新与缓冲液储存容器连接，开始洗 脱 。
(5) 分 部 收 集 流 出 液 。每分部相当于 1 % 总柱床体积，分别测每分部的 A 280, 并各取小份样品测生物活性。选出有活性的分部用 SDS-PAGE 检测所含蛋白质的数量和质量。合并所需蛋白质的部分。
(6) 用 2? 3 个柱床体积的凝胶过滤缓冲液洗柱，柱子保存在含 0.02% 叠氮化钠的缓冲液中，柱子可无限次使用。
(7) 步骤 (5) 所得蛋白质相对较稀，将溶液放入 Diaflo 超滤膜中进行浓缩。
(8) 紫外分光光度计测蛋白质的浓度，溶 液 4℃ 保存。
核 酸 杂 交
核酸分子杂交分子单链之间的互补碱基通过非共价键 (主要是氢键) 的形成即出现稳定的双链区。分子杂交可在 D N A 与 D N A 、 R N A 与 R N A 或 R N A 与 D N A 的两条单链之间进行 (奥斯伯等 2001)。核酸分子杂交按作用环境分为固相杂交和液相杂交。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交时，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上的杂交物有容易检测和能防止靶 D N A 自我复性等优点，故该法最为常用。常用的固相杂交的类型有菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹、 Northern 印迹、组织原位杂交和夹心杂交等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。
11) 倒掉杂交管中 A P H 溶 液 ，换上预热 (68 3/4 ) 的 A P H 溶 液 ，加人变性探针， 6 8℃滚动下杂交过夜。
(12) 倒 掉 A P H 液 ，加人等体积的 2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，室温下滚动孵育 lOmin，5 min 后更换洗膜液。
(13) 倒掉 2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，换上等体积的 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，重复步骤(12)
(14) 必要时，在 42T ：用 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S 进 行 15m i n 的中等严谨度的洗膜 2 次。
(15) 必要时，在 6 8 1 用 O.lxSSC/0.1%(m /V)S D S 进 行 15m i n 的高度严谨度的洗膜 2 次。
(16) 倒掉洗膜液，室温下 2x S S C 漂洗膜，吸干多余液体，用塑料膜包裹后放射自显影
(13) 将润湿了的膜放在凝胶表面，排去气泡，以 20x S S C 流洗膜表面。切 5 张与膜大小相当的 Whatman 3M M 滤纸，放于膜的表面，然后将切得与膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高 约 4c m 。
(14) 在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物，放置过夜。
(15) 拆卸转移用的滤纸、海绵等，回收膜和压扁了的凝胶。在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。
(16) 用 2x S S C 洗 膜 ，然后放在一张 W h a t m a n S M M 滤纸上，让膜完全干燥。
(17) 将 膜 夹 在 2 张 Whatman 3M M 滤纸中间， 8 0 ℃真 空 烤 膜 2 h 。
(18) 如果需要的话，凝胶可按步骤 (5)，用溴化乙锭染色以检查转印效率。
(19) 制备放射比活在 108dpm/ug 以上的寡核苷酸探针，并除去未标记的寡核苷酸。
(20) 用 6x S S C 液润湿携带 R N A 的膜。
(21) 将 膜 带 R N A 的面朝上，放入杂交管中，每 IOcm2 膜 面 积 加 入 I m l 甲酰胺预杂交液/杂交液，旋 转 保 温 3 h ，温度设定在 42℃ (D N A 探针) 或 60℃：(R N A 探针)。
(22) 如果是双链探针的话，需在水浴或加热器中加热至 100SC，保 温 lOmin，置于冰上。
(23) 吸所需要体积的探针加人杂交管中， 42℃ (D N A 探 针 烕 60℃ (R N A 探针) 过夜。
(24) 倒出杂交液，按以下程序依次洗膜：
2xSSC/0.1%S D S 室温旋转洗涤 5 minx2 次 ；
0.2xSSC/0.1%S D S 室温旋转洗涤 5 minx2 次 (低严谨度洗涤)；
在 42℃ 用 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S 洗 涤 15 minx2 次 (中严谨度洗涤，可选)；
在 68℃用 0.1xSSC/a i %(m /V)S D S 洗 涤 15 minx2 次 (高严谨度洗涤，可选)。
(25 ) 在 室 温 以 2X S S C 洗 膜 ，吸干多余液体，盖上可透过紫外线的塑料保鲜膜，进行放射自显影。
逆转录技术就是利用逆转录酶的活性，以 R N A 为 模 板合成 c D N A 的技术 ， 一 般情况下提取的 R N A 经过逆转录后紧接着就进行 P C R 反 应 ，所以逆转录、 P C R 技术的组合就 是 R T -P C R 技术。
模板 R N A 、 5x A M V buffer、 2.5 mmol/L d N T P 、 RNase 抑制剂 (40U /ul)、 200ug/ml oligo d T 、 A M V R T N a s e (5U /ul)、 D E P C 处理水、 P C R 管和 P C R 仪 。
(1) 取 PCR尺管加入 0.5 ul 模 板 RNA、 1 ul oligo d T,5ul处理水。
⑵ 将 P C R 管 7 0 ℃ 水 浴 lOmin。
(3) 取出冰浴 2 min。
⑷ 再 向 P C R 管中加入4ul 5x A M V 缓冲液、8 ul d N T P 、0.5ul R N a s e 抑制剂、1 ul A M VRTNase, 离心混匀。
酶联免疫吸附反应 (ELISA) 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本 (测定其中的抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
常 用 ELISA 方法有：双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体、 ABS-ELISA 法 。
① PBS(pH 7.3);② 包被液 [0.1mol/LNa2CO3 (pH9.6) 以及 0.02% 叠氮化钠];③洗脱液[0.9% NaCl-0.05% Tween 20(N a C l/T )];④ PBS-T A [PBS-Tween 20(0.05%)-叠氮化钠 (0. 02%)p H 7.3];⑤ A P (碱性磷酸酶) 缓冲液 [0.05mol/L Na2C 0 3-0.001mol/L MgCl2 (p H 9.3)];⑥ H R P (辣根过氧化物酶) 底物 [混合等量的四甲基联苯胺 (T M B ) 底物以及 T M B 过氧化物酶溶液]。
注意：①叠氮化钠不能用来反映 H R P 的变化；②洗脱循环步骤对于清除背景干扰非常重要。
⑴ 将 含 有 抗 原 (5? 20ug/ml) 的包被液加入到塑料管或微型皿中 (目前常用的是 Linbro微孔板或 C 〇 starSer 〇 d u Ster「U 」聚乙烯微孔板)。 37℃ ：孵 育 4 h ，4℃保 存 (可 保 存 2 周)。
如果是聚乙烯微孔板，用 洗 脱 液 洗 3 次 ，然后吸水纸吸干多余的液体，封闭好- 7 0
保存 ，一般情况下聚乙烯微孔板可保存 6 个月。
⑵ 酶 标 抗 体 的 准 备 ：
a. 8000 g 离心 0.3 ml 碱性磷酸酶 (A P ， SigmatypeVII， 1140U /ml)2 min。
b. 沉 淀 中 加 人 0.1m l 亲和纯化的特异性抗体 (动物特异性，细菌特异性)，这样酶和抗体的比例是 3 : 1。
c. P B S 透析过夜。
d. 加 入 IOul 的戊二酸 (glutaraldehyde) 让溶液终浓度为 0.2%。
e. 室温下孵育 2 h ，稀 释 到 lml，然 后 P B S 透析过夜。
f.用 0.05mol/L Tris-5% B S A -lmmol/L MgCl2-0.02% N a N 3 稀释到 10 ml。
g . 4 ℃ 保 存 。
(3) 试管和平皿用洗脱液洗 3 次 ，每 次 间 隔 lOmin，清洗过程中要确保每个孔都充满了洗脱液。
⑷ 用 0.5%B S A 完全填满试管和平皿 I h 以封闭试管和平皿。
⑶ 再 用 洗 脱 液 清 洗 4 次 ，静 置 10——15 min。
(6) 每个孔里加人 1004 P B S - T A 稀释的抗血清，室温静置 5 h 或者冰箱中过夜。通常情况下， 1:1 〇〇的稀释比例就足够了，如果是单克隆抗体就不要稀释。
(7) 重复步骤 (4)，然 后 加 人 PBS-T A 稀释的酶标抗体，如 果 是 A P 标记抗体，室温下 孵 育 牝 ，如 果 是 H R P 标记抗体，室 温 下 1.5 h 或 3 7 ℃ 、 lh。稀释比例一般是 1 : 1000。
(8) 重复步骤 (4)，然后每孔加入 lOOul 底 物 。对 于 A P 酶标抗体：底物溶液是溶于缓 冲 液 的 终 浓 度 lmg/m l 的硝基磷酸 (p-nitrophenyl phosphate) , 显 色 IOOmin 后 用 IOpl
Imol/ L N a O H 终止反应， 4 〇 5nm 波长测吸光度。对 于 H R P 酶标抗体，则应向孔中加入等 份 的 T M B ，待达到既定强度后用 IOOuI lm 〇 l/L 磷酸溶液终止反应， 450n m 波长下测吸光度。
E L I S A 反应流程简图如图 6.4 所示。
免 疫 组 化
免疫组织化学是基于利用放射性核素和其他标记物 (萤光素、酶 、重金属离子等)作 为 示 踪 剂 ，通过免疫亲和 (抗原-抗体特异性结合) 和核酸杂交 (碱基配对特异性连接)途 径 ，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技 术 。
①过氧化物酶标记的链霉素卵白素染色 (s p 系列) 试剂盒；② 试 剂 1[封闭用正常血 清 ，工 作 液 3m l 、6 ml、15 ml(蓝色液体)];③试剂 2[生物素化二抗工作液 (IgG/Bi0)3m l 、6m l 、 15 ml(黄色液体)];④ Sp-9000: 通用型生物素标记羊抗兔、大 鼠 、小鼠和豚鼠
IgG; ⑤ Sp-9001: 生 物 素 标 记 羊 抗 兔 IgG; ⑥ Sp-9002: 生 物 素 标 记 羊 抗 小 鼠 IgG;⑦ 试 剂 3[辣根酶标记链霉素卵白素工作液 (S-A /H R P )3 ml、 6 ml、 15 ml(橙色液体)]、荧光显微镜。
采用北京中杉公司免疫组化试剂盒 (Histostain(TM)-Plus Kits) 操作步骤。
(1) 石蜡切片，常规脱蜡至水。
(2) 3 % 过氧化氢孵育 5——10 min, 以除去内源性过氧化物酶的活性。
⑶ 蒸 馏 水 冲 洗 ， P B S 浸 泡 5 min(如果需要采用抗原修复，在此步骤之后进行)。
⑷ 滴 加 试 剂 1(蓝 色 液 体 )，室 温 孵 育 10? 15 min，倒去液体，勿洗
⑶滴加适当比例稀释的一抗， 37℃孵 育 1? 2 h 或 代 过 夜 。
(6) PBS 冲洗， 5 minx3 次 。
(7) 滴加试剂 2(黄色液体)，室 温 或 37T 孵 育 10——15 min。
(8) 重复步骤 (6)。
(9) 滴加试剂 3(橙色液体)，室 温 或 3 7 1 孵 育 10? 15 min。
(10) 重复步骤 (6)。
(11) 显色剂显色 (D A B 或 A E C )。
(12) 自来水冲洗，复染，封片。切片可以于暗处 2 - 8 ℃ 保存。
(13) 显微镜下观察，记录结果。
此 外 ，干细胞研究中还有其他的实验技术，如微阵列、免疫共沉淀、质谱分析技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术、 R N A 干涉等。
增殖分化调控机制的研究
载 体 的 制 备
目的基因的克隆是分子生物学实验中的核心内容，起着承上启下的作用，通过克隆技术可实现目的基因的无限扩繁、长期保存的目的；利用该技术能实现基因-组、基因改造、构建工程菌和转基因动植物。基因克隆技术主要包括载体的获取、酶切、脱憐、连接和转化及筛选、鉴定等内容 (奥斯伯等 2001)。在干细胞增殖、分化调控机制的研究中常用到的克隆载体主要有以下两类：①宿主为大肠杆菌的细菌质粒；②动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。
载体特点：①在宿主细胞中具独立复制能力；②带抗性等选择标记；③有合适的限制性内切核酸酶位点，可插人一定片段长度的外源 DNA 而不影响自身复制。
质 粒 提 取
质 粒 D N A 的提取方法比较常见，基本步骤多为三步：①细菌培养和质粒的扩增；②细菌菌体的裂解；③ 质 粒 DNA 的纯化。现在常用的是质粒提取试剂盒。该方法方快 捷 ，具体步骤可参考其使用手册。
注意：在 质 粒 DNA 提取中，质 粒 D N A 的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响 ，通过一些实验发现，下列培养方式能获得较好的结果。①培养应用菌龄不超过 4 天的平板单菌落作为起始菌。②培养菌应在 37℃、 220r/min 下 生 长 16—— 18 h。③不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备。
D N A 片 段 的 酶 切
限制性内切核酸酶 (restriction endonuclease) 是一类能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽、质粒、 TAE 缓冲液、限制性内切核酸酶
2 ) 操作步骤
用于质粒的酶切鉴定，一 般 是 20ul体积中含有0.2?Iug D N A , 酶切反应体系为：
质 粒 DNA 10ul
缓冲液 (IOx) 2ul(双酶切时要选取两种酶都适合的缓冲液)
限制性内切核酸酶 1ul(双酶切时两种酶各加 1 ul）
双蒸水 7ul
⑴ 在 E p 管中加入 7 ul双蒸水。
⑵ 加 人 IOx 缓 冲 液 2ul 。
(3) 加 限 制 酶 1 ul。
⑷加入质粒 10 ul
(5) 离 心 ，混匀。
(6) 37℃水浴 l——2 h。
(7) 取 反 应 液 ，电泳鉴定。
3 ) 注意事项
⑴ 样 品 加 入 次 序 为 水 、缓冲液、 D N A ，最后为酶，不应颠倒。
(2) 加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切 D N A 混匀。
(3) 反应体系的体积要尽量少 ， 一 般 水 解 0.2? Iug D N A 时 ，应将体积控制在 20——30 ul内。保证限制酶活性不受抑制。
⑷为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板 D N A 的浓度应很高，如 底 物 D N A浓度过低则应进行浓缩。
(5) 本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所 以 ，可在同—反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系进行反应，此时可采取一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶，然后进行第二种酶切。
D N A 片 段 回 收
回收是指从电泳介质中纯化出目的片段。在试验中待回收的片段主要有酶切片段和各 种 P C R 片段；回收的介质主要为琼脂糖；回收的方法主要有微量柱回收、玻璃奶回收。这里以玻璃奶法为例介绍 D N A 片段回收的方法。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、烘箱、恒温水浴、玻璃奶、无水乙醇、溶胶液、漂洗液。
2 ) 操作步骤
(1) 从琼脂糖凝胶上切下目的条带放入 1.5 ml E p 管中，用 一 个 Tip 头捣碎。
⑵ 准 确 估 计 凝 胶 的 体 积 ，加 入 3 倍体积的溶胶液，室温放置 5m i n 或 50℃：保 温 3 min，其间轻摇 E p 管几次使胶完全溶化
⑶ 向 溶 胶 中 加 入 IOpl 玻璃奶，颠倒混勻，冰 浴 lOmin，并且间隔 2? 3m i n 颠倒混匀一 次 ， 12 000r/m i n 离 心 30s，吸弃上清。
(4) 将浓缩漂洗液按 3 : 7 与无水乙醇配成工作液，然后向玻璃奶中加入 2 5 0 ul ，用加样器吸漂洗液轻柔地将玻璃奶冲散混匀， 12 OOOr/m in 离 心 30s ，吸弃上清。
(5) 重复第 (4) 步一次。吸取完漂洗液后再离心 10s，用 Tip 头将最后一点儿漂洗液吸干 净 ，然后放置于 37℃ 温箱中干燥 20 min。
(6) 加 20ul 无菌水，用 Tip 头轻轻混勻， 60T ；水 浴 5 min， 12 OOOr/m i n 离 心 lmin，回收上清即为纯化的 P C R 片段。 -20℃ 储存。
3 ) 注意事项
(1) 玻璃奶使用之前一定要融化并充分混匀。
(2) 干燥后加无菌水后要充分吹打。
基 因 的 重 组 连 接
重组连接是指将目的基因用 D N A 连接酶连接在合适的质粒载体上，这是基因重组、基因改造的重要中间环节。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中，外 源 D N A 与载体的连接是承上启下的一步操作，根据连接片段末端类型不同，连接方式有黏端连接、平端连接、平黏端连接及单碱基配对的 T 载体连接等。
主 要 设 备 与 试 剂
离心机、恒温设备、 T 4 D N A 连接酶、 10xT4 D N A 连接酶缓冲液。
操 作 步 骤
1) 取干净、灭菌 E p 管，加入下列各试剂
T4 DNA 连接酶缓冲液 1ul
载 体 DNA 片段 1ng
插入目的片段 xng
连接酶 IU(平末端，如为黏端连接，则酶量可小于 1u)
加无菌水至 IOul
X = 目的片段与载体片段的分子比例 X 载 体 n g 数 X 目的片段的碱基数/载 体 n g 数
(目的片段/载体片段的分子比例一般为 3 : 1)
2) 连接反应
2 2 ℃ 保 温 3 h 或 4℃过 夜（Promega 连接酶，黏端连接);
或 22? 2 6 ℃保 温 Ih (B R L 连接酶，黏端连接)；
或 22℃保 温 4—— 16 h (Promega 连接酶，平端连接)；
或 14℃ 保 温 16——24 h (B R L 连接酶)。
3 ) 注意事项
(1) 分子生物学实验中主要采用 T 4 D N A 连接酶。
(2) 在分子生物学实验中连接酶主要用于：①基因重组中载体与外源基因的连接；② 接 头 与 D N A 片段的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的 A F L P 及 差 ^表达的研究中等。
(3) 其中黏端连接的效率最高，黏端连接与平黏连接中外源 D N A 片段在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较髙，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过:① T d T 酶在载体和外源 D N A 片段上转移一互补序列 (核苷酸投影法)；②在载体和外源 D N A 片段上加上人工接头，变平连为黏连。
连接产物的转化
通过转化可以实现大量扩增质粒。转化的方法有多种，如电转化法、 CaCl2 法等。一般使用 CaCl2 法 ，从而改变细胞膜的结构，使 外 源 D N A 可以穿过细胞膜进入细胞，然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在抗性培养基上生长形成菌落。
1 ) 主要设备与试剂
摇床、离心机、恒温设备、 L B 培养液、 CaCl2(0.1mol/L )。
2 ) 操作步骤
(1) 从新鲜的平板上挑取一个 D H 5α 单克隆， 37℃摇振培养过夜。
(2) 按 I : 100 的比例将过夜培养的菌液加入新鲜的 L B 培养液中，于 37℃继续培养至 OD600为 0.3——0.4。
(3) 将菌液转移到预冷的 50m l 离心管中， 4 ℃ 、： IOOOg 离 心 15m i n 回收菌体。
(4) 倒出上清，将 管 倒 置 Imin 以使最后残留的痕量液体流尽。
(5) 用 IOml 冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 重悬每份沉淀，同上离心收集菌体。
(6) 重复步骤⑷。
(7) 每 50m l 初始培养物用 2m l 冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 重悬，此即感受态细菌。
(8) 取 200 叫感受态细菌和 D N A (≤10ul, ≤ 5 0 ng 伽入到一个冰冷的聚丙烯管中，轻轻旋转混匀，冰上放置 30 min。
(9) 将管放到 42 ℃水浴中，恰恰放置 90s，其间不要摇动。
(10) 快速将管转移到冰浴中，冷 却 l——2 min。
(11) 每 管 加 800ul L B 培养液， 37 ℃温和摇振培养 60m i n 使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
(12) 取 2 0 0 0 菌液涂在含 A m p 或 K a n 平板上，将平板置于室温直至液体被吸收，然 后 于 3 7 ℃ 倒置培养过夜。
3 ) 注意事项
(1) 热激温度和时间要严格控制好。
(2) 含 A m p 琼脂平板培养时间不应超过 16 h ，否则容易产生卫星菌落。
⑶ 如 果 是 与 T 载体的连接产物，则将菌液涂布在含 X -gal 和 I P T G 的 A m p 或 Kan平板上。
病毒载体的制备 (详见细胞转染部分）
1 ) 逆转录病毒载体的构建
⑴ 改 造 病 毒 基 因 组 ，切 除 野 生 型 的 娜 、 poZ、 e<<v 结构基因，换为目的基因，保留包装信号和 L T R S 序列。
⑵将重组的病毒载体导入包装细胞，包装出有感染能力的逆转录病毒颗粒。
(3) 从包装细胞培养上清中获得包装好的缺陷型病毒，用它转导带有该病毒受体的祀细胞，使目的基因稳定整合至靶细胞染色体。
注意：①插入的目的基因不能超过 7kb , 否则逆转录病毒载体将不能有效包装。②外源基因导入靶细胞的效率很高，通 常 Im l 含病毒的培养基可感染 1 〇 6个觀细胞。
2 ) 腺病毒载体的构建 ( ；这部分已经商品化，不做详细介绍）
(1) 构建含外源目的基因的腺病毒穿梭载体。
(2) 制备重组质粒。
(3) 转 染 HEK293 细胞。
(4) 收获含重组腺病毒的上清进行滴度测定和纯化。
(5) 转染靶细胞。
注意： 一般插入外源 DNA 长度不得超过 2kb， 但是通过缺失部分病毒基因组可扩大外源 D N A 的插入容量。
蛋 白 质 的 制 备
在干细胞增殖、分化调控机制的研究中，常需要进行目的蛋白质的表达。首先我们通过载体制备将目的基因插入表达载体，然后再将该重组载体导入活细胞，以大量表达所需目的蛋白质。
外源基因可以在原核表达，也可以在真核细胞中进行表达。外源基因的原核表达是目的基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效的合成基因产物，常用于原核表达的细胞是大肠杆菌。其特点是：操作简便，而且在较短时间可以实现蛋白质的大量表达，因
此成为科研应用中蛋白质表达的主要宿主。但是大肠杆菌进行蛋白质表达也存在一些缺陷 ：①真核蛋白在大肠杆菌中的表达没有得到正确的修饰；②在大肠杆菌中表达蛋白时常形成沉淀成为包含体。
常用表达用宿主菌株为 DE3 BL2 1 菌 ，先要准备合适的感受态细胞，取 质 粒 Ing 用无菌水稀释 5 0 倍 ，按前述转化步骤进行操作，筛选出阳性克隆后提质粒并经 D N A 序列测 定 ，确定无误后进行如下操作。
1 ) 主要设备与试剂
摇床、 SDS-PAGE 电泳仪、离心机、 LB 培养基、 IPTG、 Tris o HCI(20mmol/L pH8)、2xloading buffer
2 ) 操作步骤
⑴从新鲜的划线平板中挑取单克隆，接至一定体积的含合适抗生素的 L B 中， 37℃摇床振摇培养至OD600为 0.4? 0.6。
(2) 如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子，则 在 30? 32℃ 培养数小时，使培养液的 OD600达 0.4? 0.6, 迅速使温度升至 4 2 ℃ 继 续 培 养 3——5h。如果表达载体的原核启动子为 ta c 等 ，则 37T 培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG至终浓度为lmmol/L，继续 培 养 3——5 h。
(3) 取 出 Im l菌液做分析用， 1 〇〇〇g发离心 lmin，沉 淀 加 l 〇〇ul 2xloadingbuffer, IOO℃加 热 3 min， 上 样 进 行 SDS-PAGE。
⑷ 将 摇 瓶 置 于 冰 上 5 min。4℃ 、 5 000g 离 心 5m in 收集菌体，重悬细胞于〇.2 5 倍体积预冷的2 〇 mol/L Tris HCl(pH 8.0) 中，离心。菌体保存于-7〇℃冻存以备分离基因表达产物所用。
3 ) 注意事项
不同的表达质粒，因启动子不同，诱导表达方法并不完全相同，可根据具体情况而定。
细 菌 的 裂 解
细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤。常用的研究方法有酶溶法和超声破碎法。
酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶解酶有溶菌酶(Iysozyme)
1 ) 主要设备与试剂
离心机，裂解缓冲液 (lmmol/L EDTA， 100 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris o Cl,p H 8 . 0)，蛋白酶抑制剂 (50 mmol/L ) , 溶菌酶(10m g /ml)，脱氧胆酸， D N a SeI(lmg/ml)。
2 ) 操作步骤
(1) 4℃ 、 500 g 离 心 15 min，收集诱导表达的细菌(1000 ml)。
(2) 弃上清液，每克菌加3m l 裂解缓冲液，悬浮沉淀。
(3)每 克 菌 加 3ul 5Ommol/L 的 蛋 白 酶 抑 制 剂 苯 甲 磺 酰 氟 (phenylmethyIsulfonylfluoride, PMSF)， 80ul 溶菌酶(10m g /ml)，搅拌 20 min。
(4) 在搅拌下，每克菌加 4m g 脱氧胆酸。
(5) 溶 液 变 得 黏 稠 时 每 克 菌 加 20ul DNaseI(lmg/ml)。
(6)室温放置至溶液不再黏稠。
3 ) 注意事项
步骤 (2)? (4) 在冷室中进行。
超声破碎法
声 频 高 于 15? 20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失少，同时还可对染色体 D N A 进行剪切，大大地降低了液体的黏度，有利于后续目标产物的分离。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、 SIDS-PAGE 电泳仪、 T E buffer、 2xloading buffer。
2 ) 操作步骤
⑴收集诱导表达的细菌(IOOOml)，4℃ 、 500 g 离 心 15 min。
⑵ 弃 上 清 液 ，每克菌加3 ml T E buffer。
(3) 根据厂家提供的超声波仪的数据进行破菌。
⑷ 10 000g 离 心 15 min, 分别收集上清液和沉淀。
(5) 取 少 量 上 清 液 和 沉 淀 加 入 等 体 积 的 2xloading b u ffe r, 进 行 SDS-PAGE电泳。
3 ) 注意事项
(1) 超声破碎与声频、处理时间、细胞浓度、菌种类型等许多因素有关，实验时要根据具体情况掌握。
(2) 超声波破菌前，细胞经数次冻溶后更容易破碎。
包 含 体 的 分 离 、 溶 解 和 复 性
在以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包含体 (inclusion body)。包含体形成后，表达蛋白不具有物理活性，因此必须溶解包含体对表达蛋白进行复性。由于包含体是致密的，易于沉淀，所以能用脱氧胆酸盐洗涤得到纯度较高的制备物。包含体离心沉淀后，可用尿素等洗涤。为获得可溶性的活性蛋白，必须要将洗涤过的包含体溶解，然后进行重折叠，最后用离子交换或亲和层析的方法对重折叠后的蛋白质进行精制。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、 SDS-PAGE 电泳仪、尿素、 Tris . ClCaimolZL, p H 8.5)、 2xloading buffer。
2 ) 操作步骤
(1)4℃，12 OOOg离心细菌裂解液 15 min。
(2) 弃上清液，每 克 菌 加 Iml 无菌水使悬浮，分 别 取 1 0 0 ul 分 装 4 个 管 ，其余备用。
⑶ 离 心 同 步 骤 (1)。
(4) 弃上清液，用 lOOul O.lmolTLTris o Cl(p H 8.5)，含不同浓度尿素(0.5mol/L 、lmol/L )的溶液悬浮沉淀。
(5)离 心 。
(6) 分别吸出并保留上清液，用 100ul H2O 重新悬浮沉淀。
(7) 分别取10 叫上清液和重新悬浮的沉淀，加 10ul 2xloading buffer进 行 SDS-PAGE电泳。
包含体的溶解
1 ) 主要设备与试剂
SDS-PAGE 电泳仪，裂解缓冲液 (含 0.1 m m 〇 l/L P M S F ，8mol/L 尿 素 ，10 mmol/L D T T ),K H 2P O 4(50 mmoiyL, p H 10.7), E D T A (lmmol/L , p H 8.0), NaCl(50 mmol/L )
2 ) 操作步骤
(1) 用 IOOul裂解缓冲液溶解包含体。
(2) 室 温 放 置 1h
(3) 加 9 倍体积的 P A G E 电泳缓冲液，室温放置30 min, 用 K O H 保 持 p H 为 10.7。
⑷ 用 H C l 调 至 p H 8.0，最少在室温放置30 min。
(5) 室温、 10 000g离心15min。
(6) 吸出上清液并保存，用 100 ul IxSDS-Ioading buffer重新溶解沉淀。
(7) 取 10 ul 上 清 液 ，加 10ul 2xloading buffer,取20u重新溶解的沉淀，进 行SDS-P A G E 电泳。
1 ) 主要设备与试剂
2 mmol/L 还原型谷胱甘肽和0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽。
2 ) 操作步骤
(1)每毫升脲-蛋白溶解液缓慢加入9m l 含 2mmol/L 还原型谷胱甘肽和0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽的工作缓冲液。
⑵ 室 温 孵 育 2? 4 h 。
融 合 蛋 白 的 纯 化 (以 G S T 标 签 融 合 蛋 白 的 纯 化 为 例）
1 ) 主要设备与试剂
摇床、离心机、超声波发生器、 L B 培养基、 IPTG(100 mmol/L )、 TritonX-100(10%)、5 0 % 的谷胱甘肽-琼脂糖珠、还原型谷胱甘肽洗脱液。
2 ) 操作步骤
(1)挑取一个菌落接种于 100 ml L B /A m p 培养基中，在 3 7 ℃ 摇 床 中 培 养 12? 15 h。
⑵ 以 I : 1 0 的比例将此培养物稀释于 I L 新鲜的抗性L B 培养基中，分 入 2 个 2L的瓶中， 37℃下 培 养 lh。
(3)加lOOmmol/LIPTG 至终浓度 0.1 mmol/L ，继续培养 3? 7 h 。
⑷ 室 温 、5OOOg离 心 IOmin收 集 细 胞 ，弃 上清。沉 淀 重 悬 于 10——20m l 冰 浴 的 PBS中。
(5) 将离心管置于冰浴中，用带直径5m m 探头的超声波发生器裂解细胞。
(6) 加 入 1 0 % 的 Triton X -100至浓 度 为 1 % 并混匀。室温、 10 OOOg离 心 5m i n 去除未裂解的细胞。
(7) 上 清 加 入 Iml 5 0 % 的谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液，室温下轻柔混勻2 min。加 50 ml冰 浴 的 P B S 洗涤液、混 勻 ， 5 ( % 离 心 10s。重复 洗 涤 2 次 。用少量 (1? 2 ml)冰 冷 的 PBS重悬琼脂糖珠，并 移 人一个1.5m l 微量离心管中。
(8) 室温、 5O O g 离 心 IOs收集琼脂糖珠，弃上清。加 Iml还原型谷胱甘肽洗脱融合蛋白质。轻 柔 混 勻 2 min， 500 g 离 心 10s，收集上清，重 复 洗 脱 2——3次 ，经 SDS-PAGE分析各部收集样品。洗脱的蛋白质分成小份，加 甘 油 至 终 浓 度 1 0 % ，储存于-70℃。同时测量吸光度确定融合蛋白的产量。
抗 体 的 制 备
一般来说，抗体制备主要分为两种！一种是用纯化的抗原免疫动物，获得多克隆抗体 ，这种方法在试验中比较常用；另一种是用杂交瘤技术制备单克隆抗体。
多 克 隆 抗 体 的 制 备
一般用纯化抗原免疫动物，可以得到特异性抗血清。免疫动物的抗原虽然进行了纯化 ，可每种抗原分子常有多个抗原决定簇，可以刺激动物产生多种质量不同的抗体，因此异种抗血清是由多种抗体组成的混合物，这类抗血清称为多克隆抗体，在实验研究中应用较广。我们以常见的蛋白质抗原免疫家兔制备抗血清为例进行介绍。
1 ) 所用设备与试剂
注射器、眼科剪、止血钳、引流管、无菌的玻璃瓶、家兔、弗氏完全佐剂、麻醉剂、叠氮钠(N a N 30.02%)。
2 ) 操作步骤
(1) 选择动物： 2.5? 3k g 的健康家兔。
(2) 免疫动物：基础免疫所需抗原量为 0.5? lmg/kg，与弗氏完全佐剂以等体积乳化后做双后足掌注射及背部皮内多点注射。加强免疫，在第一次注射后1 〇天，用前次相同的抗原量与弗氏完全或不完全佐剂乳化，做腋窝淋巴结内注射，每 侧 a i ——〇.2m l ，剩余量做背部皮内多点注射， 1?2周后，再重复注射一次可不加佐剂，抗原剂量适当增加，注射途径可多点皮下、肌肉或静脉内加强免疫。以 后 每 隔 1——2周 注 射 2——3次 ，末次注射后7——10 天试血，如果抗体效价不高，可再继续加强，直至达到要求的抗体效价(以双向扩散法检测，抗 体 效 价 在 1 : 3 2 以上)，方可采血。
(3) 采 血 ：颈动脉放血法。麻醉后将兔仰卧，四肢固定，充分暴露颈部，剪 毛 ，消毒 ，沿气管表面做皮肤直切口，暴露气管，在气管旁剥离动脉与神经束。用止血钳夹住动脉的近心端，用丝线结扎远心端，用眼科剪在两端被阻断的血管上剪一 「V 」形小口，向心插入引流管用丝线将插管与血管固定，放开近心端管钳，收集血液于清洁无菌的玻璃瓶中，置室温，待血块收缩完全后分离血清，加 最 终 浓 度 为 0.02% 的叠氮钠(N a N 3),小量分装，置-20℃冻存或冷冻干燥保存。
3 ) 注意事项
(1) 免疫用的动物多为哺乳类和禽类。哺乳类■主要有家兔、豚鼠、猪及猴等。禽类常用鸡。
(2) 免疫动物所用的抗原要求尽量纯化。
( 3 ) 目前用得最多的是弗氏佐剂，而弗氏佐剂又分为完全型和不完全型。
(4) 免疫动物需根据抗原的免疫原性强弱及抗原用量的多少，制定免疫方案。免疫的方案应包括注射的抗原量、途径、间隔时间和免疫次数。
单 克 隆 抗 体 的 制 备
单克隆抗体(monoclonal antibody, M c A b )有高度的均一性，特异性强。它是由抗原致敏的一个B 淋巴细胞增殖而来的细胞系所产生的抗体。这是因为单抗是来源于 — 个 B淋巴细胞的细胞株，而且其只对一种特定的抗原决定簇起反应，所以它具有高度均一性和特异性。不仅如此，杂交瘤细胞还能在体外或小鼠的腹腔内培养，产生大量抗体，易于标准化。
1 ) 所用设备与试剂
注射器、无菌培养皿、组织研磨器、计数器、恒温水浴、离心机、 2 4 孔板、二氧化碳孵箱、 B A L B /C 小鼠、弗氏完全佐剂、无菌生理盐水、 7 5 % 乙醇、 R P M I -1640培养液、5 % 小 牛 血 清 1640液 、台盼蓝、 5 0 % P E G 溶 液 、 2 0 % 小牛血清H A T 选择培养液。
2 ) 操作步驟
(1)动物免疫：常 选 用 B A L B /C 小 鼠 ，进行免疫，抗原用量根据所制备的抗血清的要求不同而异。常 用 12.5?50 ug/100ul, 与等量弗氏完全佐剂混合，制成乳剂，用 200ul做动物背部皮内多点注射，如果注射量大，可做皮下注射 。 一 般间隔1——3周注射一次，共 3? 5 次 ，末次接种后一周，切断小鼠尾巴尖部，放 血 ，检测抗血清的特异性和效价。选择产生高质量抗血清的小鼠作为脾细胞的来源。被选小鼠在试血后的 3?6天，用同一剂量的抗原以无菌生理盐水溶解做静脉加强注射一次，使抗原刺激的B 淋巴细胞定位于脾脏。 3? 4 天 后 ，处死动物，制备脾细胞。
⑵ 脾 细 胞 制 备 ：将免疫的小鼠处死，浸 人 7 5 % 乙醇， 5m i n 换乙醇一次，在无菌条件下取出脾脏，用 R P M I -1640培养液冲洗表面血液，去包膜，将脾脏放入盛有培养液无菌培养皿中，剪 碎 移 入 15m l 的组织研磨器中，加 新 配 的 5 % 小 牛 血 清 1640液 ，挤压脾组织块，制备细胞悬液，收集细胞悬液静置片刻，待组织碎片下沉后，吸 取 上 含 细胞的悬液用5 % 小 牛 血 清 1640液 洗 2 次 ，沉淀再悬浮于Iml 培养液中并用台盼蓝染色，计 数 ，要求活细胞占9 0 % 以上。
(3)骨髓瘤细胞制备：从处于对数生长期的 N S -I 小鼠骨髓瘤细胞株培养液中取细胞2xl07? 4xl07&/sup 个 ，加 5 % 小牛血清1640液离心lOmin，去上清，将沉淀重悬计数。
⑷ 细 胞 融 合 ：取 脾 细 胞 IO8和骨髓瘤细胞 2xl07777&/sup个/m l , 饲养细胞可用小鼠腹腔巨噬细胞或未免疫小鼠脾细胞)混匀 ，分 配 到 2 4 孔 板 ，每孔加〇.5m l ，置 3 7 ℃ 含 5 % ? 7 % 二氧化碳孵箱中培养。经 H A T 选择性培养后，融合的杂交瘤细胞生长良好, 而亲代的脾细胞和骨髓瘤细胞死亡。培 养 7? 10天 后 ，在倒置显微镜下观察，见融合细胞已覆盖1/3? 1/4孔底面积时，开始测抗体活性，应反复测定2? 3 次 ，以确定抗体阳性孔。选出抗体阳性孔的细胞 ， 一 部分做克隆化培养，一部分用液氮冷冻保存。
(5) 克隆化培养：常用有限稀释法 (limiting dilution)将抗体阳性孔的细胞进行准确计数 ，使细胞数达到10 个/m l ，然后根据所做9 6 孔板的数量，计 算 所 需 15% 小 牛 血 清 1640培养液与杂交瘤细胞的量，将细胞悬液分配到9 6 孔 板 ，每 孔 0.1 ml。使平均每孔有1个细 胞 ，再加入饲养细胞，一起 培 养 7? 14天 ，待细胞克隆出现，并 覆 盖 1/3? 1/4孔底时，再次检测培养液中的抗体活性。并将抗体阳性克隆化细胞再克隆培养 。 一 般至少应进行再克隆培养 2 次以上，按这种方法分配，将得到由单个细胞产生的克隆。
(6) 扩大培养：当找到抗体阳性克隆，应立即扩大培养，收 获 M c A b 。扩大培养制备 M c A b 的方法有：①抗体阳性细胞体外培养，收集培养液，但产量甚微，②腹水培养阳性细胞。具体操作是将无菌石蜡油0.5m l ，注入小鼠腹腔，造成无菌性^症 ，于 注 射 后 1? 2 周 ，取 IO67&/sup个抗体阳性细胞用〇.5m l 生理盐水稀释，注入小鼠腹腔，待产生大量腹水后，用注射器抽取腹水，每2?3 天抽一次，可得到大量的 M c A b 。再经双向免疫扩散，免疫电泳及聚丙烯酰胺圆盘电泳，进行抗体鉴定，然后冷冻干燥，-20℃保存。
(7) 冷冻保存与复苏：冷冻应采用逐渐降温法，各实验室使用的方法大同小异。将细胞装入冰存管，加用小牛血清配制的1 〇%——15% 二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, D M S O )，作为细胞保护剂。再将细胞从室温转到4℃ 、 -20℃ 、 -4〇℃ ：，在-4O ℃ 放置6——2h处后直接放入液氮中。复苏时，将盛有细胞的冻存管从液氮中取出，立即投入 3 7 ℃水浴中，见已冻融迅速取出，将 细 胞 转 入 IOml离心管中，加 IOml 完全培养基， 1200r/m i n 离 心 5 min，然后将细胞转人培养瓶中培养。
3 ) 注意事项
(1) 作为免疫的小鼠应与骨髓瘤源自同一品系，这样克隆化的杂交瘤细胞，接种到小鼠才易于增殖，且容易获得高质量的单克隆抗体。
(2)挤压脾组织块，制备细胞悬液时只能挤压不能研磨。
(3) 用 来 制 备 M c A b 的 骨 髓 瘤 细 胞 是 B A L B /C 小 鼠 的浆细胞瘤，瘤细胞内缺乏&H G P R T 酶。 目前已筛选出许多不同的骨髓瘤细胞株。制 备 M cA b 应选择不分泌或不合成 小 鼠 Ig 重链、轻链的骨髓瘤细胞株，常用的有 NS-1、 SP2/0 和 653 等 。
(4) 检 测 抗 体 活 性 ，可用放射免疫法，免疫组织化学法、血凝法和细胞毒试验等手 段 。
细 胞 转 染
在研究中会需要将外源 D N A 导入不同类型的细胞，从而分析其表达并在细胞水平上研究它对细胞生长的影响。外 源 D N A 通常包括基因组 D N A 、克隆的目的基因和寡核苷酸等。实验中常用的方法主要分为两种：物理化学法和病毒载体法。在物化方法中除D E A E -葡聚糖介导法只适合瞬时转染外，其他各种物化方法既可用于瞬时也可用于稳定转 染 ；而不同的病毒载体法，有的适用于稳定转染 (如逆转录载体法)，有的适用于瞬时转染 (如腺病毒载体法)。
实验中比较常用的是磷酸钙沉淀法和 DEAE-葡聚糖介导法、电穿孔法、脂质体介导法。
物 理 化 学 方 法
磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法的机制还不完全清楚，可 能 是 Ca2+ -D N A 结合物形成的颗粒沉积在培养细胞的表面，导致细胞的非特异性内吞作用。
H E P E S 缓冲溶液系统的磷酸钙沉淀法 一 一 用 该 方 法 转 染 的 D N A 既可以是基因组D N A 也可以是质粒 D N A 。
1 ) 所用设备与试剂
C O 2 培养箱、无菌培养皿、离心管、培养基、 CaCl2(2.5mol/L )、 2xHEP E S -NaCl2 溶液 (HBS 组 成 ： 280 mmol/L N a C l ， 10 mmol/L K C l ， 1.5 mmol/L N a 2 H P 〇 4， 12 mmol/L 葡萄
糖 ， 50 mmol/L H E P E S )
2 ) 操作步骤
⑴ 转 染 前 2 处 内 ，按 Ix lO 6 个细胞/培养皿的密度接种 IOOmm 的培养皿， 3 7 ℃、 5 %C O 2 培养过夜。在加入沉淀前 2? 4 h ，换用新鲜的培养基培养细胞。
⑵ 将 需 要 转 染 的 D N A 用乙醇沉淀 (10——50ug/皿) ， 空 气 中晾干。将 D N A 沉淀重悬于 450ul 灭菌水中，加 入 2.5m ol/L C aC l2 50ul。
(3) 取 2x H B S 500ul 于一无菌的锥形管中，一边 吹 打 2x H B S ，一边逐滴加入 D N A /CaCl2 溶液，随即祸旋 5s，将其在室温下静置 20 min 以形成沉淀。
(4) 将沉淀均勻加入长满细胞的 IOOm m 培养皿中，轻轻晃动。
(5) 在 37℃ 、 5 % C 〇 2 培养箱中培养细胞 4? 16 h 。除去培养基， P B S 洗 细 胞 2 次 加IOml 完全培养基培养细胞。
(6) 对于瞬时转染，可在转染后 48——7211 收集细胞，并进行表达分析。对于稳定转染，让细胞生长 2 个倍増时间 (当被转染细胞是贴壁细胞时，倍增时间一般为 1 8 ?2 4 h ) 后分乂培养皿中进行培养。
3 ) 注意事项
⑴ 转 染 用 D N A 需进行纯化，不纯将影响转染效率。
(2) D N A -磷酸钙的比例不当会影响转染效率。
(3) 转染质粒 D N A 时可加入特定的基因组 D N A (载体 D N A ) 提高转染效率。
DEAE-葡聚糖介导法
二乙胺乙基葡萄糖简称 D E A E -葡聚糖，是在生理 p H 条件下带正电荷的多聚阳离子试 剂 ，它能促进靶细胞摄入外源 D N A ，其机制推测是 D N A 与 D E A E -葡聚糖结合易于被靶细胞内吞，并减少细胞内核酸酶对 D N A 的降解作用。该法只适用于瞬时转染，所需D N A 比磷酸钙沉淀法少，且不使用载体D N A 。
1 ) 主要设备与试剂
C O 2 培养箱; 无菌培养皿; 离心管;Tris 缓冲盐溶液 (T B S )(溶 液 A :NaCl 8 g ，KCl 0.38 g ，Na2 H P O 4 0.2 g ， Tris 3 g ，用 H C l 调 节 p H 至 7.5, 定 容 至 100m l ，过滤除菌。溶 液 B :CaCl2 o 2 H 20 1.5 g , MgCl2 o 6 H 20 lg，定容至 100m l ，过滤除菌。取上述 IOmI A 液加入三 蒸 水 89m l ，再 加 Iml B 液体，即配制好 T B S ，使用前过滤除菌)。
2 ) 操作步骤
(1) 取 5xl05 个细胞接种于I O O m m 培养皿， 37℃、 5 % C 0 2 培 养 3 天 ，达 到 30%——50%融合。
(2) 乙醇沉淀 4 ug 质 粒 D N A ，空气干燥，溶 于 40 ul T B S 中。
(3) 吸去细胞培养上清液，用 I x PBS 洗涤细胞，加入完全培养基。
⑷ 边 摇 动 边 将 D N A 缓慢加入 80 ul预热至 37℃的 10 mg/ml D E A E -葡聚糖溶液中，再 将 120ulD N A /D E A E -葡聚糖混合液逐滴加人每个培养皿中，轻轻转动培养皿使其分布均 匀 ，置 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2 培 养 4 h 。
(5) 吸 去 含 D N A /D E A E -葡聚糖的细胞培养基，加 人 5m l 含 1 0 % D M S O 的 lxPBS，室 温 静 置 Imin ， 吸 去 含 D M S O 的 P B S , 用 5 ml P B S 漂洗细胞一次，加 IOml完全培养 基 继 续 培 养 48——72 h 。根据实 验 目 的 ，在适当的时间收获细胞，用于分析基因的瞬时 表 达 。
3 ) 注意事项
(1) D E A E -葡聚糖有较强的毒性，所以常采用低浓度 (1 〇〇 ——400 ug) 长时间 (4?8h)的方案。
(2) 为了提高转染效率可以加入氯奎，它 可 以 保 护 D N A /D E A E -葡聚糖不被溶酶体降解。
该法是将细胞置于高压电场，在电脉冲的作用下，使细胞膜瞬间出现微小的孔洞，使 外 源 D N A 进入细胞。影响电穿孔法基因转移效率的因素有多个，其中电脉冲影响最大 。电穿孔转染的效率取决于受体细胞的类型、转染用的DNA构 象 等 。
1 ) 主要设备与试剂
低温离心机、电穿孔用的电击仪和电击池、含或不含有选择药物的完全培养基电穿孔缓冲液 [可根据实验所用的细胞类型，选用不同的电穿孔缓冲液，一般无血清和抗生素的细胞培养基，其电击条件为：电 容 960 uF ，电 压 250? 450V (625——1125V /cm。
2 ) 操作步骤
(1) 培养靶细胞至对数生长中期， 4℃、 680 g 离 心 5m i n 收集细胞。
(2) 将细胞沉淀用预冷的电穿孔缓冲液重悬洗涤丨?2 次 ， 4 ℃ 、 6 8 % 离 心 5 min收集细胞。
⑶ 对 于 稳 定 转 染 ，将 细 胞 以 IxlO7 个/m l 的密度重悬于预冷的电穿孔缓冲液中。对于瞬时表达，可用更高密度的细胞。
⑷冰上放置所需数量的电击池，分 0.5m l 细胞悬液/池 。
(5) 将线状或超螺旋的 D N A (D N A 应经过纯化) 加入冰上放置的含细胞悬液的电击池中。握住电击池的两侧，晃动以混匀 D N A /细胞悬液，在冰上放置 5 min。
(6) 将电击池放人电击仪的池架上 (室温)，用所设定的电压及电容值电击一次或多次 。电击的次数及电压和电容的设定随细胞类型而异，需进行摸索。
(7) 将电击池置于冰上 lOmin。
(8) 用非选择性完全培养基 2 0 倍稀释被转染细胞，并用该培养基洗电击池数次，以移出所有的被转染细胞。然 后 ，于 3 7 ℃ 、 5 % C O 2 培养细胞。
(9) 瞬时转染可于培养 48——72 h 后收获细胞，以分析基因的表达，稳定转染实验可采用含有特殊药物的选择性培养基进行抗性细胞克隆的筛选。
3 ) 注意事项
(I) D N A 浓度应控制在 1——40 ug/107 个细胞范围内，且 线 状 D N A 转染成功率较高。
⑵目前对于动物细胞进行电穿孔 ，一 般采用长脉冲/低电场方法。
脂 质 体 介 导 法
将需要转移的 D N A 等生物大分子包裹于脂质体，由于脂质体具有磷脂双层结构 (与细胞膜类似)，因此可与细胞膜融合，将 D N A 等生物大分子转入耙细胞。单阳离子脂质 (如D O T M A 、 D O T A P 等) 及中性磷脂 (常见的为 D O P E ) 可 与 D N A 形成类脂复合物，从而使D N A 更有效地进人细胞。目前阳离子脂质转染试剂已商品化，转染率比其他转染方法更高 ，重复性更好。
1 ) 使用设备与试剂
培养皿、 C O 2 培养箱、培养基、商品化阳离子脂质转染试剂。
2 ) 操作步骤
(1) 以 1x 105 ——3x 105 个/孔 在 6 孔 板 或 35m m 培养皿中接种生长状况良好的靶细胞，于 37℃ 、 5 % C O 2 培养箱中培养 18? 24 h ，至 细 胞 50%——80% 汇 片 。
(2) 在 E p 管中配制 D N A /脂质体复合物，体系如下：稀释 1——2 ug 质 粒 D N A 至 1(%1无 血 清 D M E M 培养基中。同 时 稀 释 2 —— 2 5ul阳 离 子 脂 质 于100ul 无 血 清 d m E M 培养基中，然后将二者混合，轻轻混匀。在室温下孵育 15? 45 min，使 D N A 与阳离子脂质结合。
(3) 吸去细胞的原培养基，用 2m l 无血 清 D M E M 培养基洗细胞一次，在每一个孔或35m m 培养皿中加入 0.8m l 无 血 清 D M E M 培养基，然后逐滴加入上述 D N A /脂质体复合物 ，并使之均匀分布。于 3 7 ℃、 5 % C O 2 培养箱中培养 3? 8 h ，一 般 为 5 h 。
(4) 每孔或直径 35m m 培养皿中加入 Iml 含 2 0 % 胎牛血清的 D M E M 完全培养基，置3 7℃ 、5 % C O 2 培养箱中再培养 18——24 h 。此过程中若有细胞毒性，必须更换新鲜的含 10%胎牛血清的 D M E M 完全培养基。
(5) 吸 去 DNA/脂质体复合物的 DMEM 完全培养基，每孔加人 2m l 新 鲜 的 含 10% 胎牛血清的 DMEM 完全培养基，再 培 养 24? 48 h。
(6) 瞬时转染实验可在转染开始后 48——72 h 收获细胞，以分析基因的表达；稳定转染实验可于转染后 72 h ，将 细 胞 按 I : 1 0 分入含有特殊药物的选择性完全培养基进行抗性细胞克隆的筛选。
3 ) 注意事项
(1) 一般先加入无血清培养基，再加入未稀释的阳离子脂质体试剂。
(2) 如果待转染的细胞不耐受无血清培养基，可以先在无血清培养基中制备 D N A /脂质体复合物，然后将其加入含血清的完全培养基中进行转染。
病 毒 载 体 法
逆转录病毒载体法
基因组结构简单，易于操作，感染宿主范围广且效率高，但是只能感染分裂复制的细胞，滴度较低。此外，在包装细胞中，逆转录病毒载体有可能通过同源重组未野生型辅助病毒，有潜在的致癌危险性。
1 ) 使用设备与试剂
C O 2 培养箱、培养皿、培养板、克隆环、培养基、 H E P E S 缓冲盐溶液 (H B S ) 其组成如下 [137 mmol/L N a C l ， 5 mmol/L K C l ， 0.7 mmol/L N a 2 H P 〇 4， 6 mmol/L 葡萄糖， 21 mmol/L
H E P E S ， 2mol/LCaCl2, 800 昭/m l (100x) 聚凝胺 (过滤除菌)，含 15% 甘油的 H B S ]。
2 ) 操作步骤
⑴ 转 染 前 1 天 ，在 I O O m m 培 养 皿 中 1 : 5 或 I : 10 接种包装细胞培养至 10%? 20%汇片。
⑵ 将 10 略含有药物抗性基因的逆病毒载体质粒 D N A 加 入 预 先 有 0.5 ml H B S 的试 管 中 ，再加入32 ul 2mol/LCaCl2，轻摇。室温下孵育 45min，直到形成细小的淡蓝色沉淀。
(3) 移去包装细胞的培养基，吸 取 H B S -D N A 沉淀轻加在培养皿中央。在超净工作台内让细胞接触 D N A 2Omin, 期间轻轻转动培养皿以均匀分散 D N A 溶液。加 IOmI 培养基 ，将细胞置于 3 7℃ 、 5 % C 0 2 培 养 4 h 。
(4) 吸尽培养基，轻 轻 加 入 2.5m l 室 温 的 H B S /甘油。将培养皿放回培养箱中孵育1.5? 3.5 min。快速 弃 除 H B S /甘 油 ，用 IOmI 培养基轻轻洗 2 次 ，力卩 5m l 含有血清的培养基 ，培 养 18——24 h 移出培养基，用 0.45 um 的 滤 器 过 滤 ，获得含有短暂产生的病毒；将其保存于- 7 0 ℃或- 8 0 ℃。
(5) 在转染的细胞中加IOml培养基，培养 2?3 天。
(6) 在 感 染 前 1 天 ，将包装细胞系 [与第⑴步所用的细胞系的 env 类 型 不 同 ] 按 I : 10至 1 : 2 0 传代。
(7) 移去所要感染的包装细胞系的培养基。加病毒 [从第 (5) 步来] 如下，对于一只I O O m m 的培养皿，稀 释 0.1——1.0m l 病毒液至终体积 3——5m l ，并 加 800ug/m l 的聚凝胺至对 于 60mm的 培养皿 ，稀 释 0.1? Iml 病毒液至终体积 2m l ，并 加 800ug/m l 的聚
凝胺至终浓度叫 8ug/ml。 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2 培 养 I h 以上。
(8) 在 感 染 后 2——3 天 ，按 I : 10 或 1 : 2 0 将感染的细胞传代，加选择性培养基培养 3天 ，换用新鲜的选择培养基，再培养 4——7 天直至可见到细胞克隆。
(9) 用克隆环挑取分离良好的细胞克隆，每个克隆转移至 2 个 2 4 孔培养板或 6 孔培养板的培养孔中，生 长 至 5 0 % ? 9 0 % 汇片。
(10) 更 换 1/2 体积的培养基，视包装细胞系不同而培养 1——3天，移出培养基，或对其进行滴度测定，或保存于-70℃ 或-80℃ 。
(11) 继续传代各产病毒细胞克隆，直至其可冻存或直至鉴别出最好的产病毒细胞。当鉴定出一个好的产病毒细胞克隆时，加 10%——15% DMSO 在液氮中冻存。
3 ) 注意事项
⑴ 如 果 感 染 持 续 时 间 超 过 6 h 甚至过夜，应使用更多体积的感染混合液，以防细胞脱水。
(2) 待感染靶细胞的接种数和感染混合液用量随培养皿的底面积而改变。
(3) 用几 种 量 的 病 毒 液 (如 0.1m l 、 0.4m l 、 1.0 ml) 感染几只培养皿，对于小鼠逆转录病毒和禽类逆转录病毒的 E 亚群需添加聚凝胺，对于禽类的其他亚群则不需要聚凝胺 。如果细胞对于聚凝胺不敏感 (大多数包装细胞都如此) 则延长培养时间，不会损害细 胞 。
⑷如果细胞对于聚凝胺不敏感，贝_ 培养基以增加体积。对 于 IOOmm 培养皿加培养基至终体积 10m l ，对于直径 60m m 培养皿加4 ml， 培 养 2? 3 天。
腺病毒载体法
腺病毒可以感染分裂细胞和未分裂细胞，插 入 的 外 源 D N A 容量大。容易获得较高的滴度，病毒颗粒较稳定，但是其不足也比较明显，外源基因表达是暂时的，而且其体内应用容易引起免疫反应等。
1 ) 使用设备与试剂
C O 2 培养箱、培养板或培养皿、人胚肾 (HEK293) 细胞系、阳离子脂质体转染试剂。
2 ) 操作步骤
⑴ 在 6 孔培养板或直径 35m m 培养皿中接种约 5xl05 个 H E K 2 9 3 细胞， 5 % C O 2培养箱中培养24 h 。
(2) 提取重组病毒质粒 DNA 10|ag， 用 Pac I 酶切使之线性化。
⑶ 按 照 厂 家 说 明 用 lipofectamine(GIBCO 公司) 进行转染 293 细胞。
(4) 7? 10天后用荧光显微镜进行观察，可以看到多数 293 细胞中有 G F P 的表达。
(5) 收取细胞，在- 7 0 ℃ / 3 7℃ 条件下反复冻融 4 次裂解细胞，离心取含病毒的上清再次 感 染 293 细胞以扩增重组病毒。
(6) 3 天后收集细胞，反复冻融 3 次。
(7) 取 400W 稀释液加至 293 细胞培养瓶中，于 3 7℃ 孵 育 3 h ，换新鲜培养基继续培养 18——24 h ，于荧光显微镜下计数 G F P 阳性细胞数，按以下公式计算病毒滴度 ：
病毒滴度= G F P 细胞阳性数 X 病毒上清稀释倍数/〇.4 ml (pfu/ml)
3 ) 注意事项
收集毒液后可以进行纯化，用 CsCl 密度梯度超离心法进行病毒的纯化，将浓缩后的病毒储存液作不同比例的稀释。
定 位 研 究
定位研究的方法主要有荧光显微术、原位杂交、电子显微术。这里主要介绍通过荧光显微镜进行观察研究的方法，其试验策略是利用免疫学和非免疫学的荧光探针所具有的敏感性和特异性来揭示结构与功能的关系。
内源性 酶 检 测
β-半乳糖苷酶活性检测
炔半乳糖苷酶是经典的组织化学报道基因，其活性可以用多种底物来检测。最常用的 是 X -gal。当 々-gal 水 解 X -gal 分子的糖苷键时，会产生一种可溶性的、无色的吲哚单体 。随后，两个游离的吲哚基团无需酶促催化，即可自发氧化形成二聚体。最终形成的卤化靛青是一种极稳定且不溶于水的蓝色复合物。
1 ) 整块组织 (如胚胎) 的 X-gal 染色
⑴ 使 用 设 备 与 试 剂 ：含 有 2m m 〇] y L MgCl2 的 P B S 、 2 % ? 4 % 多聚甲醛、 X-gal 反应缓冲液 (35 mmol/L 亚铁氰化钾、 35 mmol/L 铁氰化钾、 2 mmol/L MgCl2、 0.02% N P -40、 0.01%
脱氧胆酸钠)、 X -gal 储存液 (40 mg/ml X -gal 溶 于 D M F )
(2) 操作步骤：
a. 将组织在冰上预冷的含有 2 mmol/L MgCl2 的 P B S 中剪碎。
b. 在 2%——4% 多 聚 甲 醛 中 冰 上 固 定 30m i n 到几个小时。
c. 用 P B S 漂洗几遍。
d. 用 X -gal 反应缓冲液稀释 X -gal 储存液，与组织在 3 7 1 孵 育 2——4 h 。
e.在 P B S 漂洗多次，直到漂洗液不再发黄为止。最好过夜漂洗。
f. 在明视野的显微镜下观察。
(3) 注意事项：
a. 固定时间不宜太久。
b. 在 X -gal 反 应 中 加 入 N B T 以替代铁离子，会形成紫色沉淀，这一反应比单用X -gal 反应更快更敏感。
2 ) 组织切片的 X-gal 染色
⑴ 使 用 设 备 与 试 剂 ：明胶蔗糖包埋液 (7.5% 明胶、 15% 蔗糖、 0.05% 叠氮钠)、包被
载玻片的明胶溶液 (2 g 明胶， O.lg 硫酸铬钾溶于 200m l 水)、 4 % 多聚甲醛、 Gelvatol(①取
蛋白质的结构/结构域。早期 的 M 13 方法和常规的P C R 方 法 ，由于操作繁琐，意外突变多等缺陷，使定点突变的实验受到很大限制，现在实验中常用的是 Stratagene 公司的 QuikChange Site-directed Mutagenesis Kit0
1 ) 操作步骤
⑴ 准 备 突 变 的 质 粒 从 常 规 中 经 纯 化 试 剂 盒 抽 提 质 粒 。
⑵ 设 计 一 对 互 补 的 、带有目标突变的引物，和模板质粒退火后用 PfuTurbo 聚合酶「循环延伸」。 PfuTurbo 聚合酶在非链置换反应条件下使引物线性延伸，产生环状带缺刻的突变产物。
(3) D/m I 酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是 经 d a m 甲基化修饰的，对 I 敏感而被切碎。
⑷带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开形成具缺刻的双链 D N A ，将其转化 至 X L -2 Blue 超级感受态细胞中，即可得到突变质粒的克隆。
2 ) 注意事项
(1) 循环延伸是指聚合酶按照模板延伸引物 ， 一 圈 后 回 到 引 物 5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。用的是低次数的循环延伸而非 P C R ，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化。
(2) D/m I 识别序列为甲基化的 G A T C ， G A T C 在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。
蛋白质的磷酸化在细胞生长和分化的调控中扮演着重要的角色。靶蛋白的磷酸化程度由它们的蛋白质激酶和磷酸酶的相对活性决定。而且这两类酶的平衡受到许多因素影响 ，如生长因子、激素、细胞周期等。因此研究蛋白质磷酸化水平对于深入了解其所参与的信号转导过程是非常重要的。蛋白质磷酸化的定量测定常用 32P 来完成 (斯佩科特等2001)。
1 ) 所用设备与试剂
细胞培养瓶、液闪计数器、刮 刷 、低磷酸培养基 (无放射性磷酸盐)、裂解缓冲液[20 mmol/L Tris(p H 7.5)]、 2 mmol/L E D T A 和 0.5% S D S 、 N P -40、 DNase I。
2 ) 操作步骤
(1) 用 60m m 或 I O O m m 培养瓶，在完全培养基中培养细胞至所希望的密度。
⑵用预热的低磷酸培养基 (无放射性磷酸盐) 冲洗 2 次 ，然后加人含 0.5?ImCi32 P/ml(ICi = 3.7xl010 Bq) 的低磷酸培养基 (50——100umol/L 无机憐酸)。
(3) 培养结束后，回 收 32 P 标记培养基，用 IOml Aquasol(New England Nuclear) 稀 释 ，取一等份用液闪计数器测定 32P 活性。测定培养基中磷酸浓度，从这两个数据计算标记培养基中 32P 比活性。
⑷ 用 无 二 价 离 子 的 P B S 清 洗 32P 标记的细胞2 次。每 个 I O O m m 培 养 皿 加 Iml 预热的裂解缓冲液在沸水浴中裂解细胞。用一次性细胞刮刷将细胞裂解物刮到一边，然后吸到 1.5m l 离心管，热 水 浴 l 〇 min。
(5) 冷却至室温。
(6) 离心留上清，加 仰 - 4 0 至 2 % ，加 MgCl2至5mmol/L。加无蛋白酶的DNaseⅠ 与RNase 各 0.I m g ，室温放置 20 min
3 ) 注意事项
(1) 标准组织培养基有 l——2 mmol/L 磷酸盐。为 提 高 32P 标记效率，通常将培养基中磷酸盐浓度降至 5 〇 umol/L 或者更低。标记时间决定于胞内 A T P 库与培养 基 中 32 P 比活性达到平衡的快慢。
(2) 对于长时间培养，为避免类似成纤维细胞这样的快速分裂细胞生长减慢，培养基中无机磷酸浓度应保持在 50? 100 mmol/L 。
(3) 测定培养基中磷酸浓度时也可用高效液相层析从其他 32P 标记的分子中分离A T P ，直接测胞内 [Y-32P] A T P 的比活性。
⑷ 2——4 h 的短脉冲标记可以用来研究瞬时的蛋白质磷酸化。然 而 ，在脉冲标记实验中 ，蛋 白 质 32 P 标记的暂时提高，可能是磷酸化的提高，也可能因为磷酸转换增强，而蛋白质稱联的磷酸的量并没有改变。分别用含有}
(初入文坛)
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1000cells/mL能用计数板检测出来吗？
& && &&&最近在做细胞毒性实验，要对细胞进行计数，想请教3个问题。
& && &&&1、细胞计数有哪些方法，哪种精度高？
& && &&&2、血球细胞计数板法对样品细胞浓度要求是什么范围？
& && &&&3、如果我的样品种细胞被我的药品毒害死了大部分，我要检测剩余少许活细胞，除了浓缩，还有什么好办法。
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用CCK8或者 CellTiter-Glo®应该可以测出来
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细胞计数一个就是血球计数板 还有自动的计数仪器，1000cells/mL&&你这细胞密度也太低了吧 ，台盼蓝染色可以区分死活细胞
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细 胞 周 期 的 检 测 (Pagano et al.2000)
细 胞 计 数
0.25% 胰蛋白酶溶液、无血清培养液。
显微镜、计数板。
3 ) 操作规程
(1) 准备计数板：用乙醇清洁计数板和专用盖玻片，用绸布轻轻擦干。
⑵制备细胞悬液：制备单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于 IO4 个/ml。如果细胞数很少，应将悬液离心，重悬浮于少量培养液中。
(3) 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。
⑷ 计 数 ：在显微镜下，用 IOx 物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
计算：细胞数/毫升原液=(4 大格细胞数之和/4)xl 〇4 x 稀释倍数。
4 ) 注意事项
⑴消化单层贴壁细胞，要分散良好。
(2) 取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤其要注意这一点。镜下计数时，遇见 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占 K )%以上，说明消化不充分，或细胞数少于 200 个/I O m m 2 或多于 500 个/I O m m 2 时，说明稀
释不当，需要重新制备细胞悬液。
5 ) 结果判读
一般根据计数结果能够绘制出细胞的生长曲线，从而算出倍增时间。值得注意的是，倍增时间只能反映细胞周期，但是并不等同于细胞周期。
细 胞 生 长 曲 线
只有生长稳定的细胞才能绘制细胞生长曲线 (司徒镇强等 1996)。此处介绍用 MTT 法来进行生长曲线测定的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 M T T 还原为难溶性的蓝紫色结晶物(formazan) 并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。 DMSO 能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在 490n m 波长测定其 OD值 ，可以间接反映活细胞数量。在一定范围内， MTT 结晶物形成的量和细胞数成正比。此方法灵敏度高、重复性好、操作简单且没有放射性污染。
(1) M T T 溶液: 称取 250mg M T T ，加人 50 ml P B S (0.01mol/L ，p H 7. 4)，磁力搅拌 3 〇 min，
用 0.22 um的滤器除菌，分装，代 保 存 。 2 周内有效。
(2) 含 10% 胎牛血清的 R P M I 1640 培养液、 0.25% 胰蛋白酶、 D M S O 。
显微镜、振荡仪、酶联免疫检测仪、 96 孔培养板、移濟器、吸管、离心管。
4 ) 操作规程
(1) 接种细胞、培养细胞。
(2) 呈 色 ：培 养 3? 5 天后，每孔加入 M T T 溶液 (5m g /ml)20ul， 3 7 ℃ 继续孵育 4 h ，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮培养的细胞，需要离心、弃去孔内培养液。每孔加入 150ul D M S O , 振 荡 lOmin，使结晶物充分溶解。
(3) 比色、记录结果。以时间为横轴、光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
5 ) 注意事项
(1) 选择适当的细胞接种浓度。在进行 MTT 试验前，对细胞要测定其贴壁率、倍增时间和不同接种细胞数时的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样才能保证 M T T 结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。
(2) 避免血清干扰。 一 般选择小于 10% 胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余的培养液。
(3) 设定空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，其他试验步骤保持一致。最后呈色时，以空白孔为零。
6 ) 结果判读
细胞周期与细胞群体倍增时间是不同的概念。倍增时间是指在对数生长期细胞数量 增 加 1 倍所用的时间，这一时间内一般有些细胞参与分裂，有些细胞可能不分裂，有些可能分裂两次或数次，但是细胞总数增加 1 倍。一般来说，细胞周期短于细胞倍增时间。
流 式 细 胞 术
流式细胞仪能够分析细胞或颗粒物的各种参数，如 DNA、 RNA、 蛋白质含量及这些物质在细胞周期中的变化。用 D N A 直方图可以得网细胞周期中各时相细胞的百分比及 D N A 含量。 G 0 /G1 期细胞 的 D N A 含量是 2n ， G 2/M 期细胞的 D N A 含量是 4n ， S 期细胞的 D N A 含量介于 2n 和4n 之间。
在细胞周期中用 PI 单独染色无法将 G0、 G1期细胞分开，可 以 用 DNA/RNA 双染色将两者分开，这是因为 G0期细胞不合成 RNA。
流式细胞仪还能够定量细胞总蛋白、定量细胞特定功能蛋白、定量细胞内钙离子等，结合细胞周期的检测，可以观察这些物质在细胞周期中的变化
1 ) 制备单个细胞悬液
⑴悬浮生长细胞。用 P B S 洗漆、配制成 IxlO6? 2xl 〇 6个/m l 的细胞悬液备用。
(2) 单层培养的细胞。通常采用酶消化法分散细胞，制成单个细胞悬液，备用。
(3) 实体组织可采用机械法、化学法、酶消化法分散组织细胞。通常是联合应用。细胞悬液用 P B S 洗涤，备用。
2 ) 样品固定
除了分选活细胞或分析活细胞外，都应该固定细胞。
⑴ 甲 醛 法 ：在细胞悬液中，加人等体积的 8 % 甲醛-盐水 G ，代 固 定 12? 18 h。 常用于 Fuelgen 染色。
⑵ 乙 醇 法 ：细胞悬液离心，弃上清，用 5m l 4℃ 预 冷 的 盐 水 G 重悬，缓慢加入-20℃ 的 9 5 % 乙 醇 15m l ，使其终浓度为 7 0 % ，冰 浴 30 min。常 用 于 Hoechst、 溴化乙键、碘化丙锭 (PI)、异硫氰酸荧光素等染色。
(3) 丙酮法：用生理盐水悬浮细胞，加入冷丙酮，使其终浓度为 8 5 % 。常用于免疫荧光染色。
盐水 G 的配制：葡萄糖 1.lg、 NaCl 8 g 、 KCl 0.4 g 、 Na2 H P O 4 o 12 H 20 0.39 g 、 K H 2P 〇 4 0.15 g ，加 蒸 馏 水 至 1L 。待完全溶解后，称 取 M g S O 4 J H 2O L 54 g 、 C a Cl2. H 2O 0. 16 g ，依次溶解于上述 I L 盐溶液中。
3 ) 细胞染色
这里仅介绍几种常见的染色。
(1) PI 染 色 。 P I 能嵌人双螺旋之间，不能通过完整的细胞膜。在染活细胞时要将细胞固定或打孔，另外，染 D N A 时需要用 R N A 酶处理细胞。激发波长为 488n m 。
a. P I 15 mg，枸橼酸钠 O.lg ， NP-40 0.3mI，加 蒸 馏水至 100 ml, 4 ℃ 避光保存。
b. 将等体积的单细胞悬液和 PI 染液混合， 4 ℃ 放 置 15——20 min。
c. 测量前将样品用 3 0 0 目尼龙膜过滤。
(2) 光辉霉素 (M I ) 染色。 M I 只 与 D N A 以非共价键结合。激发波长为 488n m 。
a.M I 染液的配制：商品 M I 每支含 M I 2.5m g ，用 15 mmol/L M g C l 2 及 150 mmol/L N a C l 溶 液 将 M I 配 制 成 100pg/m l 溶液， 4 ℃ 避光保存。
b. 制备单细胞悬液：活细胞悬浮于含有 5%——10% 胎牛血清的培养液中；经 7 0 % 乙醇固定的死细胞悬浮于生理盐水。细胞密度为 IO5 ? IO7 个/ml。
c. 将细胞悬液与等体积的 M I 染液混合，室 温 染 15——20 min。
d测量前将样品用 3 0 0 目尼龙膜过滤。
&3) D N A 和 R N A 双重染色。
a. 制备活细胞悬液，悬浮于培养液或 P B S 中；用 蒸 馏 水 溶 解 Hoechst33258, 用P B S 稀 释 成 lmmolTL 的储存液，代 避 光 保 存 。
b.将 5 UMol/L 的 Hoechst33258 染液与等体积细胞悬液混合，37℃ ，避 光 60? 90 min。
c. 继 续 加 人 5umol/L 的 P Y 染 液 ， 37℃静 置 45 min。
d. IOOOg 离 心 lmin，除去染液，用 RPMI1640 培养液悬浮细胞。
e. 用紫外光 (351? 363n m ) 激 发 Hoechst33258 测 定 D N A ，用 476n m 波长激发 P Y 测定 R N A 。
4 ) 注意事项
⑴ 在 制 备 样 品 时 ，离心次数不要过多，防止细胞丢失或凝集成块。
(2) 消化细胞时应该注意各种不利因素，注意酶的浓度和活性。
(3) 细胞固定时间不能过长。不要使用冰醋酸-乙醇、苦味酸及含汞固定剂。
(4) 调 试 F C M 时 ，应使用理想的标准品，以便获得较高的分辨率。
分 离 、检 测 处 于 不 同 时 相 的 细 胞
离心淘洗法
有些细胞』处于不同时相时的体积和重量会有明显差别，可以通过密度梯度离心来分离。该方法操作简单、省 时 ，得到的细胞群体均一性较好，成本低，并且不扰乱细胞生长。但 是 ，对于多数种类的细胞并不适用。
2 ) 操作规程
(1) 细胞培养⑵淘洗前将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，并 重 悬 于 20m l(5 ml 分离室)或 100 ml(5 〇 m I 分离室) 冷的组织培养液中。
(3) 分 离 所 需 的 最 佳 细 胞 数 ， 5 ml 分 离 室 为 4xl 〇 7? 6xl07 个 细 胞 ， 50m l 分离室为
4XlO8? 6xl 〇 8 个细胞。
(4) 这里给出分离 CHO 细胞的步骤：
a用冰浴冷却的含血清的完全培养基淘洗 (血清含量根据细胞类型的不同来决定)。
b. 调转速和流速，使细胞停留在分离室。
c. 借助泵的作用加入样本，不要使标本进入气泡清除室。
d. 加样后即开始收集每一个转速下洗脱出的液体，转速的增加要使各组分洗出细胞的体积稳步增加。
e. 分离过程中，每一流分细胞数、细胞体积均需检测。
f.对每一流分，从体积分布以校准常数求出中位数体积。校准常数由统一大小和密度的乳胶颗粒推导出。
g.以体积中位数为基准，选择处于不同时相的细胞以备进—步研究。每一流分的均一性都用流式细胞仪来评估。
3 ) 注意事项
淘洗系统应在实验前 12? 24 h 内消毒，以免细菌或酵母污染。
M 期细胞振荡脱落法
单层生长细胞在 M 期变圆，对瓶壁的锚着减弱，易于游离到悬浮液中。该方法不干扰细胞生长，但是分离的细胞数少且只能用于贴壁生长的细胞。
2 ) 操作规程
轻轻摇动或在边台上叩击培养瓶。使培养液冲刷瓶壁，然后吸出培养液以收集頁期M胞 。从 各 培 麵 中 收 集 培 养 液 、集中、离 心 ，使 皿 期 细 臓 积 林 。细 胞 重 悬 用 流式细胞仪来评估均一性，供进一步的分析。
药物诱导同步化——同步化在 G 0/G1 期
血清撤离可以使细胞停滞在 G0 期 ，添加后重新进人细胞周期。
2 ) 操作规程
⑴ 以 汇 合 密 度 的 3 〇% 重悬细胞、培养，血清浓度依细胞种类的不同选定，一般是0—— 0 . 5 %
(2) 血清饥饿 24? 48 h 后 ，细胞进人 G0 期样的状态
⑶ 重 悬 细 胞 ，用含血清培养基培养，细胞将重新进入细胞周期不同时间取样流式细朦 评 估 均 —性
3 ) 注意事项
⑴ 首 先 蔚 請 楚 雛 生 长 細 麵 倍 獅 间 雜 可 麵 的 汇 合 優 大 细 胞
(2) 血清撤出需要掌握最佳的撤除量及撤除时间
(3) 有些细胞不适合用血清饥饿法。 °
药物诱导同步化一 同步化在 G 1 期早期
Lovastatin 抑 制 HMG-CoA 还原酶，可使细胞停滞在极早的 G1 期。
用 9 5 % 乙醇稀释 Lovastatin 到 50m g /m l ，溶 液 中 加 入 lm ol/L 的 NaOH 调 高 pH，再用 lm ol/L 的 H C l 中和。活化后用无菌去离子水稀释至 10 mm 〇 l/L ， -20℃储存备用。
3 ) 操作规程
(1) 以最大细胞密度的 3 0 % 培养细胞，培养液中加入 Lovastatin。浓度依照细胞种类的不同而调整，一般 是 10? 60umol/L 。
(2) 用 PB S 洗 2 次以解除 Lovastatin 的作用，然后用含有甲经戊酸的培养基培养，密 度 是 汇 合 密 度 的 30%——40%。甲轻戊酸的浓度应在所用 Lovastatin 浓度的 1 〇〇倍以上。
4 ) 注意事项
很多细胞经 Lovastatin 处理后，在恢复中 G1 期被延长了。
药物诱导同步化一 同步化在 G 1 期晚期
Mimosine 是从植物中获得的，能将细胞阻滞在 G1 期晚期。
Mimosine 用P B S 溶 解 ，终 浓 度 是 100 mmol/L ， 4 ℃储存备用。
3 ) 操作规程
(1) 指数生长期细胞在含 1 〇〇 ?400^imol/LMimosine 的培养液终，培 养 16——24 h。
(2) 用 PBS 洗 2 次 ，解 除 Mimosine 的阻滞作用，以汇合密度的 3 0 % ? 4 0 % 重悬于培养液中，继续培养。
药物诱导同步化—同步化在 G 1/ S 期交界点
T d R 是 D N A 合成抑制剂，加 人 T d R 后一段时间，所有细胞将处于 S 期 ，但是可能处 于 S 期的任何时期。
2 ) 操作规程
(1) 用 P B S 将 T d R 稀 释 ，过滤除菌， -2O ℃ 储存备用。
⑵ 将 指 数 生 长 期 细 胞 用 含 有 2 mmol/L T dR 的新鲜培养液培养 (TG 2+TM +TGl)， 此时细胞位于 G 1A 期交界点和 S 期的任何时期。
(3) 用 P B S 洗 2 次 ，解 除 T d R 的抑制作用。用新鲜培养液培养一段时间 (要 小 于 t G1)，使得原来处于 S 期末的细胞没有进入 S 期 ，原来处于 G 1A 期交界点的细胞离开 s 期 。
⑷ 再 次 进 行 TdR 抑 制 ， l 2——l4 h。 这时所有细胞都处于 G1A 期交界点。取 样 ，用流式细胞仪评估细胞周期时相。
(5) 除去二次 T d R 的抑制作用，释放后不同时间取样，可以获得需要的、位于不同时相的细胞，用流式细胞仪评估后，可供进一步检测。
3 ) 注意事项
这是应用最广泛、也是最被认可的细胞周期同步化技术。第一次的释放时间长短是至关重要的。
M 期细胞同步化
用秋水仙素、秋水仙胺或 nocodazole 等 ，能抑制细胞分裂，将细胞阻断在 M 期 。该法常常与 M 期细胞振荡脱落法联合应用。
2 ) 注意事项
(1) 由于该方法常常造成细胞的不可逆变化，所以此方法有一定争议。
(2) 药物浓度、作用时间都需要摸索
干细胞的研究也需要从分子生物学水平上进行，一些基本的分子生物学实验，如凝胶电泳、载体的构建、转染细胞等，在干细胞实验中也频繁用到。由于生命科学研究的发 展 ，分子生物学研究技术也越来越多，越来越完善，分子生物学实验指南就概括了所有基本的实验操作，各种反应试剂盒的出现使实验操作更加简便，也提高了实验的效率。本节就干细胞实验中用到的常规操作进行简单的描述。
细 胞 组 分 的 提 取
细胞组分的提取主要包括核酸的提取、蛋白质和细胞器的提取 (奥斯伯等 2001)。核酸的提取又包括 D N A 的提取和 R N A 的提取。D N A 的提取中常用的是细菌质粒 D N A 的提取和细胞基因组 D N A 的提取。
D N A 的提取
质 粒 D N A 的提取
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒 D N A 分子。其基本原理为：当菌体在 N a O H 和 S D S 溶液中裂解时，蛋 白 质 与 D N A发生变性，当加入中和液后，质 粒 D N A 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体 D N A 不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。质 粒 D N A 的提取可分为小量制备质粒 D N A 和大量制备 D N A 。小量制备 D N A 采用Promega 公 司 的 Plus S V Minipreps D N A 纯化提取试剂盒，大量制备 D N A 采用碱裂解法以及氯化铯/溴化乙锭平衡离心法，碱裂解法可能是最常用的质粒制备方法，该法不仅相当快捷可靠，而且可获得相当纯净的粗制 D N A ，而氯化铯/漠化乙锭平衡离心法则可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒 D N A 。但它需要使用溴化乙锭，并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。
1 ) 小量制备
质 粒 D N A 的小量制备主要采取 Promega 公 司 的 D N A 小量提取试剂盒 (WizardR PlusS V Minipreps D N A Purification System)
(I) 材料：含 抗 生 素 的 L B 琼脂糖平板、含 抗 生 素 的 L B 的培养液、 9 5 % 乙醇、离心 机 、 1.5 ml E p 管 。
⑵ 方 法 (图 6.1):
a. 从 L B 琼脂糖平板上挑选单克隆菌落，转 入 1? IOml L B 培养液中培养。对于高拷贝质粒，建议培养液不要超过 5m l ，因为培养液再多，由于试剂盒的微型柱的限制，质 粒 D N A 的得率不会再有提高；对于低拷贝质粒，可多加培养液，但 不 要 超 过 IOml, 因为培养液过多很容易导致细胞裂解液难以有效分离和质粒D N A 的污染
b.将培养管在摇床中 3 7 ℃ 过夜培养，培养时间可以根据培养液容量进行最优化以提 高 质 粒 D N A 的得率，但如果培养时间过长，则会由于细菌营养不良、老化而死亡、裂解导致质粒 D N A 的得率下降。
c. 收 集 l——5 ml(高拷贝质粒) 或 IOml(低拷贝质粒滴液于1.5 ml E p 管中， 1 〇〇〇 g 离心 5 min，弃上清，将 E p 管倒置于吸水纸上以除去残存的液体。
d.加入 2 5 0 ul 细胞重悬液，剧烈振荡将沉淀重悬，这一步非常重要，一定要完全重悬细胞。
e.再 加 入 2 5 0 ul细胞裂解液，轻轻颠倒混勻 4 次 ，静 置 l——5 min 至细胞悬液变清。
f.加 入 1 0 0 碱性蛋白酶液，颠倒混勻 4 次 ，室温静置 5 min。
g.加入 350 ul中和液，然后立即颠倒混勻 4 次 。
h.室 温 、14 00g离 心 1 〇 min。
i.将圆形柱放入 2m l 的收集管中，每个样品一套。
j.将 步 骤 h 离心后的上清液移入步骤 i 的圆形柱中，注意不要移入白色沉淀。
k.室温、 14 OOOg 离 心 lmin，拿开圆形柱，将收集管中的液体倒掉，再将圆形柱放入收集管中。
l.向圆形柱中加入 750 ul 用 95% 乙醇稀释的清洗液。
m.重复步骤 k 。
n.用 2 5 0 ul 柱洗液重复清洗步骤。
o.室 温 、 14 OOOg 离心 2 min。
P.将圆形柱转移到一个新的 1.5 ml 的 E p 管 中 ，注意圆形柱不要带有柱洗液，如果有的话就室温下 14 OOOg 再 离 心 lmin。
q.向 圆 形 柱 中 加 人 1 〇〇u;双蒸水，室 温 下 14 OOOg 离 心 lmin，以 便 质 粒 DNA 从圆形柱中洗脱。离心后弃去圆形柱。
r . 测定质粒 DNA 的浓度， - 2 0 ℃或更低温度保存。
2) 大量制备
(1) 材 料 ：带 有 质 粒 的 大肠杆菌菌株、含 有 适 当 抗 生 素 的 L B 培 养 基 、葡萄糖/Tris/EDTA 溶液、卵清溶菌酶、 NaOH/SDS 溶液、 pH 约 5 .5 的 3mol/L 乙酸钾溶液、异丙醇、 TE 缓冲液、 CsCl、 10 mg/ml 溴化乙锭溶液、 DowexAG50W-X8 阳离子交换树脂、
CsCl/ TE溶 液 ： 100gCsCl 溶 于 100mlTE 缓 冲 液 中 、TE 缓冲液/0.2mol/L NaCl,100% 乙醇 和 70% 乙醇。
⑵ 方 法 ：
a.往 2L 烧瓶中加入 500 ml 含有适当抗生素的 L B 培养基，然后加入 5 ml 过夜培养的带有所需质粒的大肠杆菌培养物，再 于 3 7 ℃培养至饱和状态。
b. 4℃ 、 6000 g 离 心 IOmin， 用 4 ml G T E 溶液重悬沉淀，并转移到一个容积不小于 20m l 的高速离心管中。
c. 加 入 Iml 新配的含 25m g /m l 溶菌酶的 G T E 溶 液 ，重悬沉淀，于室温放置 l 〇 min。
d . 加 入 IOml 新 配 的 NaOH/SDS 溶液，并且轻轻混勻直至液体变得均一、清亮而黏稠，于冰上放置 l 〇 min。
e . 加 入 7.5 ml 乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰 上 放 置 IOmin。
f. 4 ℃ 、 2000 g 离 心 IOmin, 将上清轻轻倒入另一个干净的离心管中，如果有可见的漂浮物可用数层纱布过滤。
g. 加 入 0.6 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 5? 10 min。
h.室 温 、 1500 g 离心 10 min。
i.加入 2 ml 70% 乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥。
j.将沉淀溶于 4 mlTE 缓冲液中，加 人 4.4 gCsCl， 溶解后，再 加 入 0.4 mllOmg/ml 溴化乙锭
注意:、溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染，操作时应戴手套，并且妥善处理。
k.将溶液转入一个 5m l 的 qUick-seal 快速封口的超离心管中，酌情往管中加入CsCl/T E 溶液，封好离心管， 2 0℃ 、 500000g 离 心 3.5h或 2 〇℃ 、 350000g 离心4 h 以上。
l.首先从管的顶端插入一支 20 G 针头，然后用带另一 20 G 针 头 的 3m l 注射器将质粒带吸出
注意：为了防止紫外线对眼睛的严重损伤，应戴紫外防护眼镜或面罩。操作溴化乙锭时要戴手套。
m.进行第二次超速离心 (步骤 k 和 1)，除去混杂的 R N a 和染色体 D N A 以获得更高纯度的质粒。
n. 将 质 粒 D N A /E B 溶液的 1.5?2 倍体积装 Dowex A G 5 〇 W -X 8 柱 子 ，用数倍体积的 T E /0.2mol/L NaCl 溶液清洗和平衡柱子。
o. 用注射器将混有溴化乙锭的质粒 D N A 溶液直接加到树脂的顶部，注意不要摇动树脂。
P立即收集流出液，然 后 用 2 倍于上样体积的 TE/0.2mol/L N a C l 溶液洗脱柱子 2次 。
q.加 入 2 倍 体 积 100% 乙醇于室温或一 20℃沉淀质粒 D N A 。4℃ 10 0 00g 离心IOmin
r. 沉 淀 用 7 0 % 乙醇洗涤 1 遍 ，真空干燥，溶 解 于 T E 缓冲液，并 于4℃ 保 存 。
基 因 组 D N A 的提取
基因 组 D N A 的提取主要采用的是 Promega 公司的基因组 D N A 提取试剂盒 (WizardR D N A Purification Kit)
I) 造血干细胞及血细胞基因组的提取
(1) 材 料 ： 5 〇 m l 离心管，异丙醇， 7 0 % 乙醇， 37℃ 和 65℃ 水 浴 。
(2) 方法：
a. 向 50m l 离心管中加入 30m l 细胞裂解液。
b.轻轻摇晃装有血液的管子让血液混匀，然后将样品 (IOml) 加入含有裂解液的离心管中，颠 倒 5? 6 次混匀。
c.室温下静置 IOmin 以充分裂解细胞，然后室温、 2000 g 离 心 l 〇 min 。
d. 在不触及肉眼可见的白色沉淀的基础上尽可能吸弃上清，尽管这样，还会有大约 1.4m l 的液体残留。
e. 剧烈振荡离心管直至沉淀全部重悬。
f. 向离心管中加入 IOml 核裂解液，吹打溶液 5——6 次以便细胞充分地裂解。溶液这时应该非常黏稠，如果仍有细胞团存在，那么将离心管放入 37℃温箱中直至细胞团溶解。如 果 放 入 温 箱 I h 后仍有细胞团，那就再加入 3m l 核裂解液，然后再放入温箱中至细胞裂解。
g. 加 入 RNase A 至终浓度为 20ug/m l , 将离心管颠倒 2? 5 次 ，然后将离心管放入37℃ 温 箱 15 min，然后取出冷却至室温。
下 ， 13 000——16 OOOg 离心 lmin。
j.小心地吸弃乙醇。由 于 D N A 沉淀非常松散，在吸弃乙醇时要避免将沉淀吸入移液管中。
k.将 E p 管倒置在吸水纸上，室温干燥沉淀 10—— 15 min。
1.向离心管中加入 800 ul DNA 再水化液，在 65 丈水浴锅中孵育 I h 或 过 夜 ，让 DNA 再度水化，期间间歇性地轻轻敲打离心管使沉淀溶液充分混合。
m.2——8℃ 保存基因组 DNA。
3 ) 酵母基因组 D N A 的提取
( 1 ) 材 料 ：YPD 肉汤培养基、，5 〇 mmol /L EDTA(pH 8.0)、 2 20mg/mL 裂 解 酶 、异 丙 醇 、7 〇% 乙醇、 1.5mIEp 管 、 37 3/4
和 6 5 ℃水浴。
⑵ 方 法 :
a.从在 Y P D 肉汤培养基中培养 2 0 h 的培养液中取 Im I 放 入 1.5 ml E p 管中
b.室温、 13 000? 16 OOOg 离心，吸弃上清。
c.加入 293 叫 50 mmol/L E D T A ，使沉淀彻底重悬。
d. 加 入 7.5ul 20m g /m l 的裂解酶液，轻轻摇晃 E p 管 4 次使溶液混合。
e. 将样品放入 37 ℃温箱中孵育 30? 60 min，让细胞壁彻底消化，然后冷却至室温。
f。13 000? 16 OOOg 离心 2 min，弃上清
g. 向 E p 管中加入 300ul 的核裂解液，轻轻颠倒 E p 管混合。
h. 再 加 入 IOOul 蛋白质沉淀液，高速剧烈振荡 20s。
i . 冰上静置 5 min。
j. 13 000——16 OOOg 离心 3 min。
k. 将上清移入一个新的 E p 管中，并 加 人 3 0 0 ul 异丙醇。
1.轻轻地混合溶液直至白色的丝状 D N A 形成可见的团块。
m. 13 000? 16 OOOg 离心 2 min
n. 小心弃去上清，用吸水纸吸干残余液体，然 后 向 E p 管中加入
% 乙醇，轻轻颠倒 E p 管 ，让乙醇清洗 D N A 沉淀。
o. 13 000? 16 OOOg 离 心 2 min。 小心弃去乙醇。
P.用吸水纸吸去多余液体，空气中干燥沉淀 10——15 min。
q . 向 E p 管中加入 50ul D N A 再水化液。
r. 加 入 1.5 ul 的 R N a s e 液以纯化 D N A 样品。剧烈振荡样品 ls，高速离心 5s，收集 液 体 3 7 1 孵 育 15 min。
s. 65上升到水浴锅中孵育 I h 或 4
过夜，让 D N A 再度水化，期间间歇性地轻轻敲打离心管使沉淀溶液充分混合。
t. 2? 8上升到保存基因组 DNA。
R N A 的 提 取
分离纯净、完 整 的 R N A 分子对于干细胞的分子生物学方面的实验是很重要的，是进行基因表达分析的基础。 R N A 可以拷贝成双链 D N A ，并克隆，最终获得相应于干细胞 的 c D N A 文库。对 R N A 结构和生物合成的分析有助于干细胞基因表达的研究。本节只简单介绍 Trizol 法提取干细胞总 R N A ，参考了 Invitrogen 公 司 的 Trizol 操作手册。
口罩，手 套 ， D E P C 水 ， E p 管 ，枪头， D E P C 水高压后配制的 7 0 % 乙醇。
(1) 去离子水配制 D E P C 水 。
(2) E p 管 ，枪头完全浸泡于 D E P C 水中，过夜后取出高压，烤干后使用。
(3) 浸泡后的 D E P C 水高压后还原成无 R N A 酶的水， 4 ℃ 保存。
(4) 25c m 2 培 养 瓶 内 细 胞 ，如果是 贴 壁 细 胞 ，吸 弃 培 养 液 ，加 人 Iml Trizol 液吹打 细 胞 至 细 胞 脱 落 ；如果是悬浮细胞，将 溶 液 离 心 后 去 上 清 ，加 入 Iml Trizol 吹悬沉 淀 。
(5) 加 入 0.2ml 氯仿/ml Trizol，剧 烈 振 荡 15s，室 温 静 置 1 〇 min 。
(6) 4℃ 、 12 OOOg 离 心 15 min，离心后溶液分为 3 层 ，下层为酔/氯仿层，中间为蛋白质层，无色水相的上层是 R N A 层 ，占溶液总体积的 6 0 % 。
(7) 吸取最上层入一新 E p 管 ，注意勿将中间层的蛋白质吸出。
(8) 加 入 0.5m l 异丙醇/ml Trizol 液 ，颠倒混勻，静 置 lOmin。
(9) 4℃ ；、 12 OOOg 离心 lOmin。
(10) 弃上清，加 入 Iml 7 5 % 乙醇/ml Trizol 液 ，轻轻混匀勿振荡，用于洗涤 R N A 沉淀。
(11) 4℃ 7500 g 离心 5 min。
(12) 弃上清，小心吸去 E p 管壁的乙醇，室温干燥。
(13) 加入步骤 (3) 中的 D E P C 水 30——4 〇 ul 溶解沉淀。
(14) 步骤 (13) 得到的溶液用核酸分析仪检测浓度以及纯度。
(15) - 2 0 ℃ 或更低温度保存提取的 R N A 溶液。
蛋 白 质 和 细 胞 器 的 提 取
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理有两方面：①用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；②将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱 、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下三个阶段：细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓缩、干燥和保存。
① 超 声 波 ；② 0.02? 0.05mol/L 磷酸盐和碳酸盐；③凝胶过滤层析柱及相应的介质和缓冲液；④装柱配套用具或凝胶 C 槽 ；⑤缓冲液槽；⑥ 蠕 动 泵 ；⑦ U V 紫外检测器；⑧ 分部收集器；⑨ Diaflo 超滤膜。
⑴细胞的破碎及细胞器的分离：将细胞在-20 丈以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎，差速离心弃去部分杂质。
(2) 蛋白质的粗提：向溶液中加入磷酸盐和碳酸盐 (磷酸铵和碳酸铵)，随着盐浓度的升高，蛋白质从溶液中析出，收集沉淀。
(3) 在盐析蛋白质的同时准备凝胶过滤层析柱，如果凝胶过滤的介质是干粉，则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。切勿用磁力搅拌器搅拌，让凝胶颗粒自然沉降，吸去或倾去不沉降的细小颗粒，或者根据厂商的使用指南进行处理。对预溶胀的凝胶，在布氏漏斗或玻璃烧结漏斗中用大量缓冲液洗去防腐剂。重悬于等体积的凝胶过滤缓冲液，倾人细颈过滤瓶中，使用前进行脱气。
在远离过往通道及直接光照的恒温环境，将层析柱垂直安装在稳固的实验室支架上。用一注射器将凝胶过滤缓冲液从柱子的输出管注入柱子，至缓冲液达到柱子支持体平面之上，注射器留在输出端以堵住柱子。
沿着一根顺柱子内壁而放的玻璃棒将凝胶混悬物倒人柱子至所设高度，再小心往凝胶顶部加入 I c m 高的一层缓冲液，并连接缓冲液储存容器，取去堵着柱子输出管的注射器 ，用 2? 3 倍柱床体积的缓冲液洗柱子。
(4) 流尽柱子凝胶顶部上面的缓冲液，关 闭 其 输 出 管 。加 人 相 当 于 柱 床 体 积 1%——5%的蛋白质样品。开放输出管，让样品流进柱床，凝胶上面的柱子内壁以缓冲液冲洗，然 后 在 凝 胶 顶 上 用 吸 管 加 入 I c m 高的缓冲液层，重新与缓冲液储存容器连接，开始洗 脱 。
(5) 分 部 收 集 流 出 液 。每分部相当于 1 % 总柱床体积，分别测每分部的 A 280, 并各取小份样品测生物活性。选出有活性的分部用 SDS-PAGE 检测所含蛋白质的数量和质量。合并所需蛋白质的部分。
(6) 用 2? 3 个柱床体积的凝胶过滤缓冲液洗柱，柱子保存在含 0.02% 叠氮化钠的缓冲液中，柱子可无限次使用。
(7) 步骤 (5) 所得蛋白质相对较稀，将溶液放入 Diaflo 超滤膜中进行浓缩。
(8) 紫外分光光度计测蛋白质的浓度，溶 液 4℃ 保存。
核 酸 杂 交
核酸分子杂交分子单链之间的互补碱基通过非共价键 (主要是氢键) 的形成即出现稳定的双链区。分子杂交可在 D N A 与 D N A 、 R N A 与 R N A 或 R N A 与 D N A 的两条单链之间进行 (奥斯伯等 2001)。核酸分子杂交按作用环境分为固相杂交和液相杂交。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交时，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上的杂交物有容易检测和能防止靶 D N A 自我复性等优点，故该法最为常用。常用的固相杂交的类型有菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹、 Northern 印迹、组织原位杂交和夹心杂交等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。
11) 倒掉杂交管中 A P H 溶 液 ，换上预热 (68 3/4 ) 的 A P H 溶 液 ，加人变性探针， 6 8℃滚动下杂交过夜。
(12) 倒 掉 A P H 液 ，加人等体积的 2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，室温下滚动孵育 lOmin，5 min 后更换洗膜液。
(13) 倒掉 2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，换上等体积的 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S ，重复步骤(12)
(14) 必要时，在 42T ：用 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S 进 行 15m i n 的中等严谨度的洗膜 2 次。
(15) 必要时，在 6 8 1 用 O.lxSSC/0.1%(m /V)S D S 进 行 15m i n 的高度严谨度的洗膜 2 次。
(16) 倒掉洗膜液，室温下 2x S S C 漂洗膜，吸干多余液体，用塑料膜包裹后放射自显影
(13) 将润湿了的膜放在凝胶表面，排去气泡，以 20x S S C 流洗膜表面。切 5 张与膜大小相当的 Whatman 3M M 滤纸，放于膜的表面，然后将切得与膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高 约 4c m 。
(14) 在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物，放置过夜。
(15) 拆卸转移用的滤纸、海绵等，回收膜和压扁了的凝胶。在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。
(16) 用 2x S S C 洗 膜 ，然后放在一张 W h a t m a n S M M 滤纸上，让膜完全干燥。
(17) 将 膜 夹 在 2 张 Whatman 3M M 滤纸中间， 8 0 ℃真 空 烤 膜 2 h 。
(18) 如果需要的话，凝胶可按步骤 (5)，用溴化乙锭染色以检查转印效率。
(19) 制备放射比活在 108dpm/ug 以上的寡核苷酸探针，并除去未标记的寡核苷酸。
(20) 用 6x S S C 液润湿携带 R N A 的膜。
(21) 将 膜 带 R N A 的面朝上，放入杂交管中，每 IOcm2 膜 面 积 加 入 I m l 甲酰胺预杂交液/杂交液，旋 转 保 温 3 h ，温度设定在 42℃ (D N A 探针) 或 60℃：(R N A 探针)。
(22) 如果是双链探针的话，需在水浴或加热器中加热至 100SC，保 温 lOmin，置于冰上。
(23) 吸所需要体积的探针加人杂交管中， 42℃ (D N A 探 针 烕 60℃ (R N A 探针) 过夜。
(24) 倒出杂交液，按以下程序依次洗膜：
2xSSC/0.1%S D S 室温旋转洗涤 5 minx2 次 ；
0.2xSSC/0.1%S D S 室温旋转洗涤 5 minx2 次 (低严谨度洗涤)；
在 42℃ 用 0.2xSSC/0.1%(m /V)S D S 洗 涤 15 minx2 次 (中严谨度洗涤，可选)；
在 68℃用 0.1xSSC/a i %(m /V)S D S 洗 涤 15 minx2 次 (高严谨度洗涤，可选)。
(25 ) 在 室 温 以 2X S S C 洗 膜 ，吸干多余液体，盖上可透过紫外线的塑料保鲜膜，进行放射自显影。
逆转录技术就是利用逆转录酶的活性，以 R N A 为 模 板合成 c D N A 的技术 ， 一 般情况下提取的 R N A 经过逆转录后紧接着就进行 P C R 反 应 ，所以逆转录、 P C R 技术的组合就 是 R T -P C R 技术。
模板 R N A 、 5x A M V buffer、 2.5 mmol/L d N T P 、 RNase 抑制剂 (40U /ul)、 200ug/ml oligo d T 、 A M V R T N a s e (5U /ul)、 D E P C 处理水、 P C R 管和 P C R 仪 。
(1) 取 PCR尺管加入 0.5 ul 模 板 RNA、 1 ul oligo d T,5ul处理水。
⑵ 将 P C R 管 7 0 ℃ 水 浴 lOmin。
(3) 取出冰浴 2 min。
⑷ 再 向 P C R 管中加入4ul 5x A M V 缓冲液、8 ul d N T P 、0.5ul R N a s e 抑制剂、1 ul A M VRTNase, 离心混匀。
酶联免疫吸附反应 (ELISA) 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本 (测定其中的抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
常 用 ELISA 方法有：双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体、 ABS-ELISA 法 。
① PBS(pH 7.3);② 包被液 [0.1mol/LNa2CO3 (pH9.6) 以及 0.02% 叠氮化钠];③洗脱液[0.9% NaCl-0.05% Tween 20(N a C l/T )];④ PBS-T A [PBS-Tween 20(0.05%)-叠氮化钠 (0. 02%)p H 7.3];⑤ A P (碱性磷酸酶) 缓冲液 [0.05mol/L Na2C 0 3-0.001mol/L MgCl2 (p H 9.3)];⑥ H R P (辣根过氧化物酶) 底物 [混合等量的四甲基联苯胺 (T M B ) 底物以及 T M B 过氧化物酶溶液]。
注意：①叠氮化钠不能用来反映 H R P 的变化；②洗脱循环步骤对于清除背景干扰非常重要。
⑴ 将 含 有 抗 原 (5? 20ug/ml) 的包被液加入到塑料管或微型皿中 (目前常用的是 Linbro微孔板或 C 〇 starSer 〇 d u Ster「U 」聚乙烯微孔板)。 37℃ ：孵 育 4 h ，4℃保 存 (可 保 存 2 周)。
如果是聚乙烯微孔板，用 洗 脱 液 洗 3 次 ，然后吸水纸吸干多余的液体，封闭好- 7 0
保存 ，一般情况下聚乙烯微孔板可保存 6 个月。
⑵ 酶 标 抗 体 的 准 备 ：
a. 8000 g 离心 0.3 ml 碱性磷酸酶 (A P ， SigmatypeVII， 1140U /ml)2 min。
b. 沉 淀 中 加 人 0.1m l 亲和纯化的特异性抗体 (动物特异性，细菌特异性)，这样酶和抗体的比例是 3 : 1。
c. P B S 透析过夜。
d. 加 入 IOul 的戊二酸 (glutaraldehyde) 让溶液终浓度为 0.2%。
e. 室温下孵育 2 h ，稀 释 到 lml，然 后 P B S 透析过夜。
f.用 0.05mol/L Tris-5% B S A -lmmol/L MgCl2-0.02% N a N 3 稀释到 10 ml。
g . 4 ℃ 保 存 。
(3) 试管和平皿用洗脱液洗 3 次 ，每 次 间 隔 lOmin，清洗过程中要确保每个孔都充满了洗脱液。
⑷ 用 0.5%B S A 完全填满试管和平皿 I h 以封闭试管和平皿。
⑶ 再 用 洗 脱 液 清 洗 4 次 ，静 置 10——15 min。
(6) 每个孔里加人 1004 P B S - T A 稀释的抗血清，室温静置 5 h 或者冰箱中过夜。通常情况下， 1:1 〇〇的稀释比例就足够了，如果是单克隆抗体就不要稀释。
(7) 重复步骤 (4)，然 后 加 人 PBS-T A 稀释的酶标抗体，如 果 是 A P 标记抗体，室温下 孵 育 牝 ，如 果 是 H R P 标记抗体，室 温 下 1.5 h 或 3 7 ℃ 、 lh。稀释比例一般是 1 : 1000。
(8) 重复步骤 (4)，然后每孔加入 lOOul 底 物 。对 于 A P 酶标抗体：底物溶液是溶于缓 冲 液 的 终 浓 度 lmg/m l 的硝基磷酸 (p-nitrophenyl phosphate) , 显 色 IOOmin 后 用 IOpl
Imol/ L N a O H 终止反应， 4 〇 5nm 波长测吸光度。对 于 H R P 酶标抗体，则应向孔中加入等 份 的 T M B ，待达到既定强度后用 IOOuI lm 〇 l/L 磷酸溶液终止反应， 450n m 波长下测吸光度。
E L I S A 反应流程简图如图 6.4 所示。
免 疫 组 化
免疫组织化学是基于利用放射性核素和其他标记物 (萤光素、酶 、重金属离子等)作 为 示 踪 剂 ，通过免疫亲和 (抗原-抗体特异性结合) 和核酸杂交 (碱基配对特异性连接)途 径 ，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技 术 。
①过氧化物酶标记的链霉素卵白素染色 (s p 系列) 试剂盒；② 试 剂 1[封闭用正常血 清 ，工 作 液 3m l 、6 ml、15 ml(蓝色液体)];③试剂 2[生物素化二抗工作液 (IgG/Bi0)3m l 、6m l 、 15 ml(黄色液体)];④ Sp-9000: 通用型生物素标记羊抗兔、大 鼠 、小鼠和豚鼠
IgG; ⑤ Sp-9001: 生 物 素 标 记 羊 抗 兔 IgG; ⑥ Sp-9002: 生 物 素 标 记 羊 抗 小 鼠 IgG;⑦ 试 剂 3[辣根酶标记链霉素卵白素工作液 (S-A /H R P )3 ml、 6 ml、 15 ml(橙色液体)]、荧光显微镜。
采用北京中杉公司免疫组化试剂盒 (Histostain(TM)-Plus Kits) 操作步骤。
(1) 石蜡切片，常规脱蜡至水。
(2) 3 % 过氧化氢孵育 5——10 min, 以除去内源性过氧化物酶的活性。
⑶ 蒸 馏 水 冲 洗 ， P B S 浸 泡 5 min(如果需要采用抗原修复，在此步骤之后进行)。
⑷ 滴 加 试 剂 1(蓝 色 液 体 )，室 温 孵 育 10? 15 min，倒去液体，勿洗
⑶滴加适当比例稀释的一抗， 37℃孵 育 1? 2 h 或 代 过 夜 。
(6) PBS 冲洗， 5 minx3 次 。
(7) 滴加试剂 2(黄色液体)，室 温 或 37T 孵 育 10——15 min。
(8) 重复步骤 (6)。
(9) 滴加试剂 3(橙色液体)，室 温 或 3 7 1 孵 育 10? 15 min。
(10) 重复步骤 (6)。
(11) 显色剂显色 (D A B 或 A E C )。
(12) 自来水冲洗，复染，封片。切片可以于暗处 2 - 8 ℃ 保存。
(13) 显微镜下观察，记录结果。
此 外 ，干细胞研究中还有其他的实验技术，如微阵列、免疫共沉淀、质谱分析技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术、 R N A 干涉等。
增殖分化调控机制的研究
载 体 的 制 备
目的基因的克隆是分子生物学实验中的核心内容，起着承上启下的作用，通过克隆技术可实现目的基因的无限扩繁、长期保存的目的；利用该技术能实现基因-组、基因改造、构建工程菌和转基因动植物。基因克隆技术主要包括载体的获取、酶切、脱憐、连接和转化及筛选、鉴定等内容 (奥斯伯等 2001)。在干细胞增殖、分化调控机制的研究中常用到的克隆载体主要有以下两类：①宿主为大肠杆菌的细菌质粒；②动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。
载体特点：①在宿主细胞中具独立复制能力；②带抗性等选择标记；③有合适的限制性内切核酸酶位点，可插人一定片段长度的外源 DNA 而不影响自身复制。
质 粒 提 取
质 粒 D N A 的提取方法比较常见，基本步骤多为三步：①细菌培养和质粒的扩增；②细菌菌体的裂解；③ 质 粒 DNA 的纯化。现在常用的是质粒提取试剂盒。该方法方快 捷 ，具体步骤可参考其使用手册。
注意：在 质 粒 DNA 提取中，质 粒 D N A 的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响 ，通过一些实验发现，下列培养方式能获得较好的结果。①培养应用菌龄不超过 4 天的平板单菌落作为起始菌。②培养菌应在 37℃、 220r/min 下 生 长 16—— 18 h。③不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备。
D N A 片 段 的 酶 切
限制性内切核酸酶 (restriction endonuclease) 是一类能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽、质粒、 TAE 缓冲液、限制性内切核酸酶
2 ) 操作步骤
用于质粒的酶切鉴定，一 般 是 20ul体积中含有0.2?Iug D N A , 酶切反应体系为：
质 粒 DNA 10ul
缓冲液 (IOx) 2ul(双酶切时要选取两种酶都适合的缓冲液)
限制性内切核酸酶 1ul(双酶切时两种酶各加 1 ul）
双蒸水 7ul
⑴ 在 E p 管中加入 7 ul双蒸水。
⑵ 加 人 IOx 缓 冲 液 2ul 。
(3) 加 限 制 酶 1 ul。
⑷加入质粒 10 ul
(5) 离 心 ，混匀。
(6) 37℃水浴 l——2 h。
(7) 取 反 应 液 ，电泳鉴定。
3 ) 注意事项
⑴ 样 品 加 入 次 序 为 水 、缓冲液、 D N A ，最后为酶，不应颠倒。
(2) 加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切 D N A 混匀。
(3) 反应体系的体积要尽量少 ， 一 般 水 解 0.2? Iug D N A 时 ，应将体积控制在 20——30 ul内。保证限制酶活性不受抑制。
⑷为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板 D N A 的浓度应很高，如 底 物 D N A浓度过低则应进行浓缩。
(5) 本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所 以 ，可在同—反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系进行反应，此时可采取一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶，然后进行第二种酶切。
D N A 片 段 回 收
回收是指从电泳介质中纯化出目的片段。在试验中待回收的片段主要有酶切片段和各 种 P C R 片段；回收的介质主要为琼脂糖；回收的方法主要有微量柱回收、玻璃奶回收。这里以玻璃奶法为例介绍 D N A 片段回收的方法。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、烘箱、恒温水浴、玻璃奶、无水乙醇、溶胶液、漂洗液。
2 ) 操作步骤
(1) 从琼脂糖凝胶上切下目的条带放入 1.5 ml E p 管中，用 一 个 Tip 头捣碎。
⑵ 准 确 估 计 凝 胶 的 体 积 ，加 入 3 倍体积的溶胶液，室温放置 5m i n 或 50℃：保 温 3 min，其间轻摇 E p 管几次使胶完全溶化
⑶ 向 溶 胶 中 加 入 IOpl 玻璃奶，颠倒混勻，冰 浴 lOmin，并且间隔 2? 3m i n 颠倒混匀一 次 ， 12 000r/m i n 离 心 30s，吸弃上清。
(4) 将浓缩漂洗液按 3 : 7 与无水乙醇配成工作液，然后向玻璃奶中加入 2 5 0 ul ，用加样器吸漂洗液轻柔地将玻璃奶冲散混匀， 12 OOOr/m in 离 心 30s ，吸弃上清。
(5) 重复第 (4) 步一次。吸取完漂洗液后再离心 10s，用 Tip 头将最后一点儿漂洗液吸干 净 ，然后放置于 37℃ 温箱中干燥 20 min。
(6) 加 20ul 无菌水，用 Tip 头轻轻混勻， 60T ；水 浴 5 min， 12 OOOr/m i n 离 心 lmin，回收上清即为纯化的 P C R 片段。 -20℃ 储存。
3 ) 注意事项
(1) 玻璃奶使用之前一定要融化并充分混匀。
(2) 干燥后加无菌水后要充分吹打。
基 因 的 重 组 连 接
重组连接是指将目的基因用 D N A 连接酶连接在合适的质粒载体上，这是基因重组、基因改造的重要中间环节。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中，外 源 D N A 与载体的连接是承上启下的一步操作，根据连接片段末端类型不同，连接方式有黏端连接、平端连接、平黏端连接及单碱基配对的 T 载体连接等。
主 要 设 备 与 试 剂
离心机、恒温设备、 T 4 D N A 连接酶、 10xT4 D N A 连接酶缓冲液。
操 作 步 骤
1) 取干净、灭菌 E p 管，加入下列各试剂
T4 DNA 连接酶缓冲液 1ul
载 体 DNA 片段 1ng
插入目的片段 xng
连接酶 IU(平末端，如为黏端连接，则酶量可小于 1u)
加无菌水至 IOul
X = 目的片段与载体片段的分子比例 X 载 体 n g 数 X 目的片段的碱基数/载 体 n g 数
(目的片段/载体片段的分子比例一般为 3 : 1)
2) 连接反应
2 2 ℃ 保 温 3 h 或 4℃过 夜（Promega 连接酶，黏端连接);
或 22? 2 6 ℃保 温 Ih (B R L 连接酶，黏端连接)；
或 22℃保 温 4—— 16 h (Promega 连接酶，平端连接)；
或 14℃ 保 温 16——24 h (B R L 连接酶)。
3 ) 注意事项
(1) 分子生物学实验中主要采用 T 4 D N A 连接酶。
(2) 在分子生物学实验中连接酶主要用于：①基因重组中载体与外源基因的连接；② 接 头 与 D N A 片段的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的 A F L P 及 差 ^表达的研究中等。
(3) 其中黏端连接的效率最高，黏端连接与平黏连接中外源 D N A 片段在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较髙，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过:① T d T 酶在载体和外源 D N A 片段上转移一互补序列 (核苷酸投影法)；②在载体和外源 D N A 片段上加上人工接头，变平连为黏连。
连接产物的转化
通过转化可以实现大量扩增质粒。转化的方法有多种，如电转化法、 CaCl2 法等。一般使用 CaCl2 法 ，从而改变细胞膜的结构，使 外 源 D N A 可以穿过细胞膜进入细胞，然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在抗性培养基上生长形成菌落。
1 ) 主要设备与试剂
摇床、离心机、恒温设备、 L B 培养液、 CaCl2(0.1mol/L )。
2 ) 操作步骤
(1) 从新鲜的平板上挑取一个 D H 5α 单克隆， 37℃摇振培养过夜。
(2) 按 I : 100 的比例将过夜培养的菌液加入新鲜的 L B 培养液中，于 37℃继续培养至 OD600为 0.3——0.4。
(3) 将菌液转移到预冷的 50m l 离心管中， 4 ℃ 、： IOOOg 离 心 15m i n 回收菌体。
(4) 倒出上清，将 管 倒 置 Imin 以使最后残留的痕量液体流尽。
(5) 用 IOml 冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 重悬每份沉淀，同上离心收集菌体。
(6) 重复步骤⑷。
(7) 每 50m l 初始培养物用 2m l 冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 重悬，此即感受态细菌。
(8) 取 200 叫感受态细菌和 D N A (≤10ul, ≤ 5 0 ng 伽入到一个冰冷的聚丙烯管中，轻轻旋转混匀，冰上放置 30 min。
(9) 将管放到 42 ℃水浴中，恰恰放置 90s，其间不要摇动。
(10) 快速将管转移到冰浴中，冷 却 l——2 min。
(11) 每 管 加 800ul L B 培养液， 37 ℃温和摇振培养 60m i n 使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
(12) 取 2 0 0 0 菌液涂在含 A m p 或 K a n 平板上，将平板置于室温直至液体被吸收，然 后 于 3 7 ℃ 倒置培养过夜。
3 ) 注意事项
(1) 热激温度和时间要严格控制好。
(2) 含 A m p 琼脂平板培养时间不应超过 16 h ，否则容易产生卫星菌落。
⑶ 如 果 是 与 T 载体的连接产物，则将菌液涂布在含 X -gal 和 I P T G 的 A m p 或 Kan平板上。
病毒载体的制备 (详见细胞转染部分）
1 ) 逆转录病毒载体的构建
⑴ 改 造 病 毒 基 因 组 ，切 除 野 生 型 的 娜 、 poZ、 e<<v 结构基因，换为目的基因，保留包装信号和 L T R S 序列。
⑵将重组的病毒载体导入包装细胞，包装出有感染能力的逆转录病毒颗粒。
(3) 从包装细胞培养上清中获得包装好的缺陷型病毒，用它转导带有该病毒受体的祀细胞，使目的基因稳定整合至靶细胞染色体。
注意：①插入的目的基因不能超过 7kb , 否则逆转录病毒载体将不能有效包装。②外源基因导入靶细胞的效率很高，通 常 Im l 含病毒的培养基可感染 1 〇 6个觀细胞。
2 ) 腺病毒载体的构建 ( ；这部分已经商品化，不做详细介绍）
(1) 构建含外源目的基因的腺病毒穿梭载体。
(2) 制备重组质粒。
(3) 转 染 HEK293 细胞。
(4) 收获含重组腺病毒的上清进行滴度测定和纯化。
(5) 转染靶细胞。
注意： 一般插入外源 DNA 长度不得超过 2kb， 但是通过缺失部分病毒基因组可扩大外源 D N A 的插入容量。
蛋 白 质 的 制 备
在干细胞增殖、分化调控机制的研究中，常需要进行目的蛋白质的表达。首先我们通过载体制备将目的基因插入表达载体，然后再将该重组载体导入活细胞，以大量表达所需目的蛋白质。
外源基因可以在原核表达，也可以在真核细胞中进行表达。外源基因的原核表达是目的基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效的合成基因产物，常用于原核表达的细胞是大肠杆菌。其特点是：操作简便，而且在较短时间可以实现蛋白质的大量表达，因
此成为科研应用中蛋白质表达的主要宿主。但是大肠杆菌进行蛋白质表达也存在一些缺陷 ：①真核蛋白在大肠杆菌中的表达没有得到正确的修饰；②在大肠杆菌中表达蛋白时常形成沉淀成为包含体。
常用表达用宿主菌株为 DE3 BL2 1 菌 ，先要准备合适的感受态细胞，取 质 粒 Ing 用无菌水稀释 5 0 倍 ，按前述转化步骤进行操作，筛选出阳性克隆后提质粒并经 D N A 序列测 定 ，确定无误后进行如下操作。
1 ) 主要设备与试剂
摇床、 SDS-PAGE 电泳仪、离心机、 LB 培养基、 IPTG、 Tris o HCI(20mmol/L pH8)、2xloading buffer
2 ) 操作步骤
⑴从新鲜的划线平板中挑取单克隆，接至一定体积的含合适抗生素的 L B 中， 37℃摇床振摇培养至OD600为 0.4? 0.6。
(2) 如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子，则 在 30? 32℃ 培养数小时，使培养液的 OD600达 0.4? 0.6, 迅速使温度升至 4 2 ℃ 继 续 培 养 3——5h。如果表达载体的原核启动子为 ta c 等 ，则 37T 培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG至终浓度为lmmol/L，继续 培 养 3——5 h。
(3) 取 出 Im l菌液做分析用， 1 〇〇〇g发离心 lmin，沉 淀 加 l 〇〇ul 2xloadingbuffer, IOO℃加 热 3 min， 上 样 进 行 SDS-PAGE。
⑷ 将 摇 瓶 置 于 冰 上 5 min。4℃ 、 5 000g 离 心 5m in 收集菌体，重悬细胞于〇.2 5 倍体积预冷的2 〇 mol/L Tris HCl(pH 8.0) 中，离心。菌体保存于-7〇℃冻存以备分离基因表达产物所用。
3 ) 注意事项
不同的表达质粒，因启动子不同，诱导表达方法并不完全相同，可根据具体情况而定。
细 菌 的 裂 解
细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤。常用的研究方法有酶溶法和超声破碎法。
酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶解酶有溶菌酶(Iysozyme)
1 ) 主要设备与试剂
离心机，裂解缓冲液 (lmmol/L EDTA， 100 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris o Cl,p H 8 . 0)，蛋白酶抑制剂 (50 mmol/L ) , 溶菌酶(10m g /ml)，脱氧胆酸， D N a SeI(lmg/ml)。
2 ) 操作步骤
(1) 4℃ 、 500 g 离 心 15 min，收集诱导表达的细菌(1000 ml)。
(2) 弃上清液，每克菌加3m l 裂解缓冲液，悬浮沉淀。
(3)每 克 菌 加 3ul 5Ommol/L 的 蛋 白 酶 抑 制 剂 苯 甲 磺 酰 氟 (phenylmethyIsulfonylfluoride, PMSF)， 80ul 溶菌酶(10m g /ml)，搅拌 20 min。
(4) 在搅拌下，每克菌加 4m g 脱氧胆酸。
(5) 溶 液 变 得 黏 稠 时 每 克 菌 加 20ul DNaseI(lmg/ml)。
(6)室温放置至溶液不再黏稠。
3 ) 注意事项
步骤 (2)? (4) 在冷室中进行。
超声破碎法
声 频 高 于 15? 20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失少，同时还可对染色体 D N A 进行剪切，大大地降低了液体的黏度，有利于后续目标产物的分离。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、 SIDS-PAGE 电泳仪、 T E buffer、 2xloading buffer。
2 ) 操作步骤
⑴收集诱导表达的细菌(IOOOml)，4℃ 、 500 g 离 心 15 min。
⑵ 弃 上 清 液 ，每克菌加3 ml T E buffer。
(3) 根据厂家提供的超声波仪的数据进行破菌。
⑷ 10 000g 离 心 15 min, 分别收集上清液和沉淀。
(5) 取 少 量 上 清 液 和 沉 淀 加 入 等 体 积 的 2xloading b u ffe r, 进 行 SDS-PAGE电泳。
3 ) 注意事项
(1) 超声破碎与声频、处理时间、细胞浓度、菌种类型等许多因素有关，实验时要根据具体情况掌握。
(2) 超声波破菌前，细胞经数次冻溶后更容易破碎。
包 含 体 的 分 离 、 溶 解 和 复 性
在以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包含体 (inclusion body)。包含体形成后，表达蛋白不具有物理活性，因此必须溶解包含体对表达蛋白进行复性。由于包含体是致密的，易于沉淀，所以能用脱氧胆酸盐洗涤得到纯度较高的制备物。包含体离心沉淀后，可用尿素等洗涤。为获得可溶性的活性蛋白，必须要将洗涤过的包含体溶解，然后进行重折叠，最后用离子交换或亲和层析的方法对重折叠后的蛋白质进行精制。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、 SDS-PAGE 电泳仪、尿素、 Tris . ClCaimolZL, p H 8.5)、 2xloading buffer。
2 ) 操作步骤
(1)4℃，12 OOOg离心细菌裂解液 15 min。
(2) 弃上清液，每 克 菌 加 Iml 无菌水使悬浮，分 别 取 1 0 0 ul 分 装 4 个 管 ，其余备用。
⑶ 离 心 同 步 骤 (1)。
(4) 弃上清液，用 lOOul O.lmolTLTris o Cl(p H 8.5)，含不同浓度尿素(0.5mol/L 、lmol/L )的溶液悬浮沉淀。
(5)离 心 。
(6) 分别吸出并保留上清液，用 100ul H2O 重新悬浮沉淀。
(7) 分别取10 叫上清液和重新悬浮的沉淀，加 10ul 2xloading buffer进 行 SDS-PAGE电泳。
包含体的溶解
1 ) 主要设备与试剂
SDS-PAGE 电泳仪，裂解缓冲液 (含 0.1 m m 〇 l/L P M S F ，8mol/L 尿 素 ，10 mmol/L D T T ),K H 2P O 4(50 mmoiyL, p H 10.7), E D T A (lmmol/L , p H 8.0), NaCl(50 mmol/L )
2 ) 操作步骤
(1) 用 IOOul裂解缓冲液溶解包含体。
(2) 室 温 放 置 1h
(3) 加 9 倍体积的 P A G E 电泳缓冲液，室温放置30 min, 用 K O H 保 持 p H 为 10.7。
⑷ 用 H C l 调 至 p H 8.0，最少在室温放置30 min。
(5) 室温、 10 000g离心15min。
(6) 吸出上清液并保存，用 100 ul IxSDS-Ioading buffer重新溶解沉淀。
(7) 取 10 ul 上 清 液 ，加 10ul 2xloading buffer,取20u重新溶解的沉淀，进 行SDS-P A G E 电泳。
1 ) 主要设备与试剂
2 mmol/L 还原型谷胱甘肽和0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽。
2 ) 操作步骤
(1)每毫升脲-蛋白溶解液缓慢加入9m l 含 2mmol/L 还原型谷胱甘肽和0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽的工作缓冲液。
⑵ 室 温 孵 育 2? 4 h 。
融 合 蛋 白 的 纯 化 (以 G S T 标 签 融 合 蛋 白 的 纯 化 为 例）
1 ) 主要设备与试剂
摇床、离心机、超声波发生器、 L B 培养基、 IPTG(100 mmol/L )、 TritonX-100(10%)、5 0 % 的谷胱甘肽-琼脂糖珠、还原型谷胱甘肽洗脱液。
2 ) 操作步骤
(1)挑取一个菌落接种于 100 ml L B /A m p 培养基中，在 3 7 ℃ 摇 床 中 培 养 12? 15 h。
⑵ 以 I : 1 0 的比例将此培养物稀释于 I L 新鲜的抗性L B 培养基中，分 入 2 个 2L的瓶中， 37℃下 培 养 lh。
(3)加lOOmmol/LIPTG 至终浓度 0.1 mmol/L ，继续培养 3? 7 h 。
⑷ 室 温 、5OOOg离 心 IOmin收 集 细 胞 ，弃 上清。沉 淀 重 悬 于 10——20m l 冰 浴 的 PBS中。
(5) 将离心管置于冰浴中，用带直径5m m 探头的超声波发生器裂解细胞。
(6) 加 入 1 0 % 的 Triton X -100至浓 度 为 1 % 并混匀。室温、 10 OOOg离 心 5m i n 去除未裂解的细胞。
(7) 上 清 加 入 Iml 5 0 % 的谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液，室温下轻柔混勻2 min。加 50 ml冰 浴 的 P B S 洗涤液、混 勻 ， 5 ( % 离 心 10s。重复 洗 涤 2 次 。用少量 (1? 2 ml)冰 冷 的 PBS重悬琼脂糖珠，并 移 人一个1.5m l 微量离心管中。
(8) 室温、 5O O g 离 心 IOs收集琼脂糖珠，弃上清。加 Iml还原型谷胱甘肽洗脱融合蛋白质。轻 柔 混 勻 2 min， 500 g 离 心 10s，收集上清，重 复 洗 脱 2——3次 ，经 SDS-PAGE分析各部收集样品。洗脱的蛋白质分成小份，加 甘 油 至 终 浓 度 1 0 % ，储存于-70℃。同时测量吸光度确定融合蛋白的产量。
抗 体 的 制 备
一般来说，抗体制备主要分为两种！一种是用纯化的抗原免疫动物，获得多克隆抗体 ，这种方法在试验中比较常用；另一种是用杂交瘤技术制备单克隆抗体。
多 克 隆 抗 体 的 制 备
一般用纯化抗原免疫动物，可以得到特异性抗血清。免疫动物的抗原虽然进行了纯化 ，可每种抗原分子常有多个抗原决定簇，可以刺激动物产生多种质量不同的抗体，因此异种抗血清是由多种抗体组成的混合物，这类抗血清称为多克隆抗体，在实验研究中应用较广。我们以常见的蛋白质抗原免疫家兔制备抗血清为例进行介绍。
1 ) 所用设备与试剂
注射器、眼科剪、止血钳、引流管、无菌的玻璃瓶、家兔、弗氏完全佐剂、麻醉剂、叠氮钠(N a N 30.02%)。
2 ) 操作步骤
(1) 选择动物： 2.5? 3k g 的健康家兔。
(2) 免疫动物：基础免疫所需抗原量为 0.5? lmg/kg，与弗氏完全佐剂以等体积乳化后做双后足掌注射及背部皮内多点注射。加强免疫，在第一次注射后1 〇天，用前次相同的抗原量与弗氏完全或不完全佐剂乳化，做腋窝淋巴结内注射，每 侧 a i ——〇.2m l ，剩余量做背部皮内多点注射， 1?2周后，再重复注射一次可不加佐剂，抗原剂量适当增加，注射途径可多点皮下、肌肉或静脉内加强免疫。以 后 每 隔 1——2周 注 射 2——3次 ，末次注射后7——10 天试血，如果抗体效价不高，可再继续加强，直至达到要求的抗体效价(以双向扩散法检测，抗 体 效 价 在 1 : 3 2 以上)，方可采血。
(3) 采 血 ：颈动脉放血法。麻醉后将兔仰卧，四肢固定，充分暴露颈部，剪 毛 ，消毒 ，沿气管表面做皮肤直切口，暴露气管，在气管旁剥离动脉与神经束。用止血钳夹住动脉的近心端，用丝线结扎远心端，用眼科剪在两端被阻断的血管上剪一 「V 」形小口，向心插入引流管用丝线将插管与血管固定，放开近心端管钳，收集血液于清洁无菌的玻璃瓶中，置室温，待血块收缩完全后分离血清，加 最 终 浓 度 为 0.02% 的叠氮钠(N a N 3),小量分装，置-20℃冻存或冷冻干燥保存。
3 ) 注意事项
(1) 免疫用的动物多为哺乳类和禽类。哺乳类■主要有家兔、豚鼠、猪及猴等。禽类常用鸡。
(2) 免疫动物所用的抗原要求尽量纯化。
( 3 ) 目前用得最多的是弗氏佐剂，而弗氏佐剂又分为完全型和不完全型。
(4) 免疫动物需根据抗原的免疫原性强弱及抗原用量的多少，制定免疫方案。免疫的方案应包括注射的抗原量、途径、间隔时间和免疫次数。
单 克 隆 抗 体 的 制 备
单克隆抗体(monoclonal antibody, M c A b )有高度的均一性，特异性强。它是由抗原致敏的一个B 淋巴细胞增殖而来的细胞系所产生的抗体。这是因为单抗是来源于 — 个 B淋巴细胞的细胞株，而且其只对一种特定的抗原决定簇起反应，所以它具有高度均一性和特异性。不仅如此，杂交瘤细胞还能在体外或小鼠的腹腔内培养，产生大量抗体，易于标准化。
1 ) 所用设备与试剂
注射器、无菌培养皿、组织研磨器、计数器、恒温水浴、离心机、 2 4 孔板、二氧化碳孵箱、 B A L B /C 小鼠、弗氏完全佐剂、无菌生理盐水、 7 5 % 乙醇、 R P M I -1640培养液、5 % 小 牛 血 清 1640液 、台盼蓝、 5 0 % P E G 溶 液 、 2 0 % 小牛血清H A T 选择培养液。
2 ) 操作步驟
(1)动物免疫：常 选 用 B A L B /C 小 鼠 ，进行免疫，抗原用量根据所制备的抗血清的要求不同而异。常 用 12.5?50 ug/100ul, 与等量弗氏完全佐剂混合，制成乳剂，用 200ul做动物背部皮内多点注射，如果注射量大，可做皮下注射 。 一 般间隔1——3周注射一次，共 3? 5 次 ，末次接种后一周，切断小鼠尾巴尖部，放 血 ，检测抗血清的特异性和效价。选择产生高质量抗血清的小鼠作为脾细胞的来源。被选小鼠在试血后的 3?6天，用同一剂量的抗原以无菌生理盐水溶解做静脉加强注射一次，使抗原刺激的B 淋巴细胞定位于脾脏。 3? 4 天 后 ，处死动物，制备脾细胞。
⑵ 脾 细 胞 制 备 ：将免疫的小鼠处死，浸 人 7 5 % 乙醇， 5m i n 换乙醇一次，在无菌条件下取出脾脏，用 R P M I -1640培养液冲洗表面血液，去包膜，将脾脏放入盛有培养液无菌培养皿中，剪 碎 移 入 15m l 的组织研磨器中，加 新 配 的 5 % 小 牛 血 清 1640液 ，挤压脾组织块，制备细胞悬液，收集细胞悬液静置片刻，待组织碎片下沉后，吸 取 上 含 细胞的悬液用5 % 小 牛 血 清 1640液 洗 2 次 ，沉淀再悬浮于Iml 培养液中并用台盼蓝染色，计 数 ，要求活细胞占9 0 % 以上。
(3)骨髓瘤细胞制备：从处于对数生长期的 N S -I 小鼠骨髓瘤细胞株培养液中取细胞2xl07? 4xl07&/sup 个 ，加 5 % 小牛血清1640液离心lOmin，去上清，将沉淀重悬计数。
⑷ 细 胞 融 合 ：取 脾 细 胞 IO8和骨髓瘤细胞 2xl07777&/sup个/m l , 饲养细胞可用小鼠腹腔巨噬细胞或未免疫小鼠脾细胞)混匀 ，分 配 到 2 4 孔 板 ，每孔加〇.5m l ，置 3 7 ℃ 含 5 % ? 7 % 二氧化碳孵箱中培养。经 H A T 选择性培养后，融合的杂交瘤细胞生长良好, 而亲代的脾细胞和骨髓瘤细胞死亡。培 养 7? 10天 后 ，在倒置显微镜下观察，见融合细胞已覆盖1/3? 1/4孔底面积时，开始测抗体活性，应反复测定2? 3 次 ，以确定抗体阳性孔。选出抗体阳性孔的细胞 ， 一 部分做克隆化培养，一部分用液氮冷冻保存。
(5) 克隆化培养：常用有限稀释法 (limiting dilution)将抗体阳性孔的细胞进行准确计数 ，使细胞数达到10 个/m l ，然后根据所做9 6 孔板的数量，计 算 所 需 15% 小 牛 血 清 1640培养液与杂交瘤细胞的量，将细胞悬液分配到9 6 孔 板 ，每 孔 0.1 ml。使平均每孔有1个细 胞 ，再加入饲养细胞，一起 培 养 7? 14天 ，待细胞克隆出现，并 覆 盖 1/3? 1/4孔底时，再次检测培养液中的抗体活性。并将抗体阳性克隆化细胞再克隆培养 。 一 般至少应进行再克隆培养 2 次以上，按这种方法分配，将得到由单个细胞产生的克隆。
(6) 扩大培养：当找到抗体阳性克隆，应立即扩大培养，收 获 M c A b 。扩大培养制备 M c A b 的方法有：①抗体阳性细胞体外培养，收集培养液，但产量甚微，②腹水培养阳性细胞。具体操作是将无菌石蜡油0.5m l ，注入小鼠腹腔，造成无菌性^症 ，于 注 射 后 1? 2 周 ，取 IO67&/sup个抗体阳性细胞用〇.5m l 生理盐水稀释，注入小鼠腹腔，待产生大量腹水后，用注射器抽取腹水，每2?3 天抽一次，可得到大量的 M c A b 。再经双向免疫扩散，免疫电泳及聚丙烯酰胺圆盘电泳，进行抗体鉴定，然后冷冻干燥，-20℃保存。
(7) 冷冻保存与复苏：冷冻应采用逐渐降温法，各实验室使用的方法大同小异。将细胞装入冰存管，加用小牛血清配制的1 〇%——15% 二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, D M S O )，作为细胞保护剂。再将细胞从室温转到4℃ 、 -20℃ 、 -4〇℃ ：，在-4O ℃ 放置6——2h处后直接放入液氮中。复苏时，将盛有细胞的冻存管从液氮中取出，立即投入 3 7 ℃水浴中，见已冻融迅速取出，将 细 胞 转 入 IOml离心管中，加 IOml 完全培养基， 1200r/m i n 离 心 5 min，然后将细胞转人培养瓶中培养。
3 ) 注意事项
(1) 作为免疫的小鼠应与骨髓瘤源自同一品系，这样克隆化的杂交瘤细胞，接种到小鼠才易于增殖，且容易获得高质量的单克隆抗体。
(2)挤压脾组织块，制备细胞悬液时只能挤压不能研磨。
(3) 用 来 制 备 M c A b 的 骨 髓 瘤 细 胞 是 B A L B /C 小 鼠 的浆细胞瘤，瘤细胞内缺乏&H G P R T 酶。 目前已筛选出许多不同的骨髓瘤细胞株。制 备 M cA b 应选择不分泌或不合成 小 鼠 Ig 重链、轻链的骨髓瘤细胞株，常用的有 NS-1、 SP2/0 和 653 等 。
(4) 检 测 抗 体 活 性 ，可用放射免疫法，免疫组织化学法、血凝法和细胞毒试验等手 段 。
细 胞 转 染
在研究中会需要将外源 D N A 导入不同类型的细胞，从而分析其表达并在细胞水平上研究它对细胞生长的影响。外 源 D N A 通常包括基因组 D N A 、克隆的目的基因和寡核苷酸等。实验中常用的方法主要分为两种：物理化学法和病毒载体法。在物化方法中除D E A E -葡聚糖介导法只适合瞬时转染外，其他各种物化方法既可用于瞬时也可用于稳定转 染 ；而不同的病毒载体法，有的适用于稳定转染 (如逆转录载体法)，有的适用于瞬时转染 (如腺病毒载体法)。
实验中比较常用的是磷酸钙沉淀法和 DEAE-葡聚糖介导法、电穿孔法、脂质体介导法。
物 理 化 学 方 法
磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法的机制还不完全清楚，可 能 是 Ca2+ -D N A 结合物形成的颗粒沉积在培养细胞的表面，导致细胞的非特异性内吞作用。
H E P E S 缓冲溶液系统的磷酸钙沉淀法 一 一 用 该 方 法 转 染 的 D N A 既可以是基因组D N A 也可以是质粒 D N A 。
1 ) 所用设备与试剂
C O 2 培养箱、无菌培养皿、离心管、培养基、 CaCl2(2.5mol/L )、 2xHEP E S -NaCl2 溶液 (HBS 组 成 ： 280 mmol/L N a C l ， 10 mmol/L K C l ， 1.5 mmol/L N a 2 H P 〇 4， 12 mmol/L 葡萄
糖 ， 50 mmol/L H E P E S )
2 ) 操作步骤
⑴ 转 染 前 2 处 内 ，按 Ix lO 6 个细胞/培养皿的密度接种 IOOmm 的培养皿， 3 7 ℃、 5 %C O 2 培养过夜。在加入沉淀前 2? 4 h ，换用新鲜的培养基培养细胞。
⑵ 将 需 要 转 染 的 D N A 用乙醇沉淀 (10——50ug/皿) ， 空 气 中晾干。将 D N A 沉淀重悬于 450ul 灭菌水中，加 入 2.5m ol/L C aC l2 50ul。
(3) 取 2x H B S 500ul 于一无菌的锥形管中，一边 吹 打 2x H B S ，一边逐滴加入 D N A /CaCl2 溶液，随即祸旋 5s，将其在室温下静置 20 min 以形成沉淀。
(4) 将沉淀均勻加入长满细胞的 IOOm m 培养皿中，轻轻晃动。
(5) 在 37℃ 、 5 % C 〇 2 培养箱中培养细胞 4? 16 h 。除去培养基， P B S 洗 细 胞 2 次 加IOml 完全培养基培养细胞。
(6) 对于瞬时转染，可在转染后 48——7211 收集细胞，并进行表达分析。对于稳定转染，让细胞生长 2 个倍増时间 (当被转染细胞是贴壁细胞时，倍增时间一般为 1 8 ?2 4 h ) 后分乂培养皿中进行培养。
3 ) 注意事项
⑴ 转 染 用 D N A 需进行纯化，不纯将影响转染效率。
(2) D N A -磷酸钙的比例不当会影响转染效率。
(3) 转染质粒 D N A 时可加入特定的基因组 D N A (载体 D N A ) 提高转染效率。
DEAE-葡聚糖介导法
二乙胺乙基葡萄糖简称 D E A E -葡聚糖，是在生理 p H 条件下带正电荷的多聚阳离子试 剂 ，它能促进靶细胞摄入外源 D N A ，其机制推测是 D N A 与 D E A E -葡聚糖结合易于被靶细胞内吞，并减少细胞内核酸酶对 D N A 的降解作用。该法只适用于瞬时转染，所需D N A 比磷酸钙沉淀法少，且不使用载体D N A 。
1 ) 主要设备与试剂
C O 2 培养箱; 无菌培养皿; 离心管;Tris 缓冲盐溶液 (T B S )(溶 液 A :NaCl 8 g ，KCl 0.38 g ，Na2 H P O 4 0.2 g ， Tris 3 g ，用 H C l 调 节 p H 至 7.5, 定 容 至 100m l ，过滤除菌。溶 液 B :CaCl2 o 2 H 20 1.5 g , MgCl2 o 6 H 20 lg，定容至 100m l ，过滤除菌。取上述 IOmI A 液加入三 蒸 水 89m l ，再 加 Iml B 液体，即配制好 T B S ，使用前过滤除菌)。
2 ) 操作步骤
(1) 取 5xl05 个细胞接种于I O O m m 培养皿， 37℃、 5 % C 0 2 培 养 3 天 ，达 到 30%——50%融合。
(2) 乙醇沉淀 4 ug 质 粒 D N A ，空气干燥，溶 于 40 ul T B S 中。
(3) 吸去细胞培养上清液，用 I x PBS 洗涤细胞，加入完全培养基。
⑷ 边 摇 动 边 将 D N A 缓慢加入 80 ul预热至 37℃的 10 mg/ml D E A E -葡聚糖溶液中，再 将 120ulD N A /D E A E -葡聚糖混合液逐滴加人每个培养皿中，轻轻转动培养皿使其分布均 匀 ，置 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2 培 养 4 h 。
(5) 吸 去 含 D N A /D E A E -葡聚糖的细胞培养基，加 人 5m l 含 1 0 % D M S O 的 lxPBS，室 温 静 置 Imin ， 吸 去 含 D M S O 的 P B S , 用 5 ml P B S 漂洗细胞一次，加 IOml完全培养 基 继 续 培 养 48——72 h 。根据实 验 目 的 ，在适当的时间收获细胞，用于分析基因的瞬时 表 达 。
3 ) 注意事项
(1) D E A E -葡聚糖有较强的毒性，所以常采用低浓度 (1 〇〇 ——400 ug) 长时间 (4?8h)的方案。
(2) 为了提高转染效率可以加入氯奎，它 可 以 保 护 D N A /D E A E -葡聚糖不被溶酶体降解。
该法是将细胞置于高压电场，在电脉冲的作用下，使细胞膜瞬间出现微小的孔洞，使 外 源 D N A 进入细胞。影响电穿孔法基因转移效率的因素有多个，其中电脉冲影响最大 。电穿孔转染的效率取决于受体细胞的类型、转染用的DNA构 象 等 。
1 ) 主要设备与试剂
低温离心机、电穿孔用的电击仪和电击池、含或不含有选择药物的完全培养基电穿孔缓冲液 [可根据实验所用的细胞类型，选用不同的电穿孔缓冲液，一般无血清和抗生素的细胞培养基，其电击条件为：电 容 960 uF ，电 压 250? 450V (625——1125V /cm。
2 ) 操作步骤
(1) 培养靶细胞至对数生长中期， 4℃、 680 g 离 心 5m i n 收集细胞。
(2) 将细胞沉淀用预冷的电穿孔缓冲液重悬洗涤丨?2 次 ， 4 ℃ 、 6 8 % 离 心 5 min收集细胞。
⑶ 对 于 稳 定 转 染 ，将 细 胞 以 IxlO7 个/m l 的密度重悬于预冷的电穿孔缓冲液中。对于瞬时表达，可用更高密度的细胞。
⑷冰上放置所需数量的电击池，分 0.5m l 细胞悬液/池 。
(5) 将线状或超螺旋的 D N A (D N A 应经过纯化) 加入冰上放置的含细胞悬液的电击池中。握住电击池的两侧，晃动以混匀 D N A /细胞悬液，在冰上放置 5 min。
(6) 将电击池放人电击仪的池架上 (室温)，用所设定的电压及电容值电击一次或多次 。电击的次数及电压和电容的设定随细胞类型而异，需进行摸索。
(7) 将电击池置于冰上 lOmin。
(8) 用非选择性完全培养基 2 0 倍稀释被转染细胞，并用该培养基洗电击池数次，以移出所有的被转染细胞。然 后 ，于 3 7 ℃ 、 5 % C O 2 培养细胞。
(9) 瞬时转染可于培养 48——72 h 后收获细胞，以分析基因的表达，稳定转染实验可采用含有特殊药物的选择性培养基进行抗性细胞克隆的筛选。
3 ) 注意事项
(I) D N A 浓度应控制在 1——40 ug/107 个细胞范围内，且 线 状 D N A 转染成功率较高。
⑵目前对于动物细胞进行电穿孔 ，一 般采用长脉冲/低电场方法。
脂 质 体 介 导 法
将需要转移的 D N A 等生物大分子包裹于脂质体，由于脂质体具有磷脂双层结构 (与细胞膜类似)，因此可与细胞膜融合，将 D N A 等生物大分子转入耙细胞。单阳离子脂质 (如D O T M A 、 D O T A P 等) 及中性磷脂 (常见的为 D O P E ) 可 与 D N A 形成类脂复合物，从而使D N A 更有效地进人细胞。目前阳离子脂质转染试剂已商品化，转染率比其他转染方法更高 ，重复性更好。
1 ) 使用设备与试剂
培养皿、 C O 2 培养箱、培养基、商品化阳离子脂质转染试剂。
2 ) 操作步骤
(1) 以 1x 105 ——3x 105 个/孔 在 6 孔 板 或 35m m 培养皿中接种生长状况良好的靶细胞，于 37℃ 、 5 % C O 2 培养箱中培养 18? 24 h ，至 细 胞 50%——80% 汇 片 。
(2) 在 E p 管中配制 D N A /脂质体复合物，体系如下：稀释 1——2 ug 质 粒 D N A 至 1(%1无 血 清 D M E M 培养基中。同 时 稀 释 2 —— 2 5ul阳 离 子 脂 质 于100ul 无 血 清 d m E M 培养基中，然后将二者混合，轻轻混匀。在室温下孵育 15? 45 min，使 D N A 与阳离子脂质结合。
(3) 吸去细胞的原培养基，用 2m l 无血 清 D M E M 培养基洗细胞一次，在每一个孔或35m m 培养皿中加入 0.8m l 无 血 清 D M E M 培养基，然后逐滴加入上述 D N A /脂质体复合物 ，并使之均匀分布。于 3 7 ℃、 5 % C O 2 培养箱中培养 3? 8 h ，一 般 为 5 h 。
(4) 每孔或直径 35m m 培养皿中加入 Iml 含 2 0 % 胎牛血清的 D M E M 完全培养基，置3 7℃ 、5 % C O 2 培养箱中再培养 18——24 h 。此过程中若有细胞毒性，必须更换新鲜的含 10%胎牛血清的 D M E M 完全培养基。
(5) 吸 去 DNA/脂质体复合物的 DMEM 完全培养基，每孔加人 2m l 新 鲜 的 含 10% 胎牛血清的 DMEM 完全培养基，再 培 养 24? 48 h。
(6) 瞬时转染实验可在转染开始后 48——72 h 收获细胞，以分析基因的表达；稳定转染实验可于转染后 72 h ，将 细 胞 按 I : 1 0 分入含有特殊药物的选择性完全培养基进行抗性细胞克隆的筛选。
3 ) 注意事项
(1) 一般先加入无血清培养基，再加入未稀释的阳离子脂质体试剂。
(2) 如果待转染的细胞不耐受无血清培养基，可以先在无血清培养基中制备 D N A /脂质体复合物，然后将其加入含血清的完全培养基中进行转染。
病 毒 载 体 法
逆转录病毒载体法
基因组结构简单，易于操作，感染宿主范围广且效率高，但是只能感染分裂复制的细胞，滴度较低。此外，在包装细胞中，逆转录病毒载体有可能通过同源重组未野生型辅助病毒，有潜在的致癌危险性。
1 ) 使用设备与试剂
C O 2 培养箱、培养皿、培养板、克隆环、培养基、 H E P E S 缓冲盐溶液 (H B S ) 其组成如下 [137 mmol/L N a C l ， 5 mmol/L K C l ， 0.7 mmol/L N a 2 H P 〇 4， 6 mmol/L 葡萄糖， 21 mmol/L
H E P E S ， 2mol/LCaCl2, 800 昭/m l (100x) 聚凝胺 (过滤除菌)，含 15% 甘油的 H B S ]。
2 ) 操作步骤
⑴ 转 染 前 1 天 ，在 I O O m m 培 养 皿 中 1 : 5 或 I : 10 接种包装细胞培养至 10%? 20%汇片。
⑵ 将 10 略含有药物抗性基因的逆病毒载体质粒 D N A 加 入 预 先 有 0.5 ml H B S 的试 管 中 ，再加入32 ul 2mol/LCaCl2，轻摇。室温下孵育 45min，直到形成细小的淡蓝色沉淀。
(3) 移去包装细胞的培养基，吸 取 H B S -D N A 沉淀轻加在培养皿中央。在超净工作台内让细胞接触 D N A 2Omin, 期间轻轻转动培养皿以均匀分散 D N A 溶液。加 IOmI 培养基 ，将细胞置于 3 7℃ 、 5 % C 0 2 培 养 4 h 。
(4) 吸尽培养基，轻 轻 加 入 2.5m l 室 温 的 H B S /甘油。将培养皿放回培养箱中孵育1.5? 3.5 min。快速 弃 除 H B S /甘 油 ，用 IOmI 培养基轻轻洗 2 次 ，力卩 5m l 含有血清的培养基 ，培 养 18——24 h 移出培养基，用 0.45 um 的 滤 器 过 滤 ，获得含有短暂产生的病毒；将其保存于- 7 0 ℃或- 8 0 ℃。
(5) 在转染的细胞中加IOml培养基，培养 2?3 天。
(6) 在 感 染 前 1 天 ，将包装细胞系 [与第⑴步所用的细胞系的 env 类 型 不 同 ] 按 I : 10至 1 : 2 0 传代。
(7) 移去所要感染的包装细胞系的培养基。加病毒 [从第 (5) 步来] 如下，对于一只I O O m m 的培养皿，稀 释 0.1——1.0m l 病毒液至终体积 3——5m l ，并 加 800ug/m l 的聚凝胺至对 于 60mm的 培养皿 ，稀 释 0.1? Iml 病毒液至终体积 2m l ，并 加 800ug/m l 的聚
凝胺至终浓度叫 8ug/ml。 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2 培 养 I h 以上。
(8) 在 感 染 后 2——3 天 ，按 I : 10 或 1 : 2 0 将感染的细胞传代，加选择性培养基培养 3天 ，换用新鲜的选择培养基，再培养 4——7 天直至可见到细胞克隆。
(9) 用克隆环挑取分离良好的细胞克隆，每个克隆转移至 2 个 2 4 孔培养板或 6 孔培养板的培养孔中，生 长 至 5 0 % ? 9 0 % 汇片。
(10) 更 换 1/2 体积的培养基，视包装细胞系不同而培养 1——3天，移出培养基，或对其进行滴度测定，或保存于-70℃ 或-80℃ 。
(11) 继续传代各产病毒细胞克隆，直至其可冻存或直至鉴别出最好的产病毒细胞。当鉴定出一个好的产病毒细胞克隆时，加 10%——15% DMSO 在液氮中冻存。
3 ) 注意事项
⑴ 如 果 感 染 持 续 时 间 超 过 6 h 甚至过夜，应使用更多体积的感染混合液，以防细胞脱水。
(2) 待感染靶细胞的接种数和感染混合液用量随培养皿的底面积而改变。
(3) 用几 种 量 的 病 毒 液 (如 0.1m l 、 0.4m l 、 1.0 ml) 感染几只培养皿，对于小鼠逆转录病毒和禽类逆转录病毒的 E 亚群需添加聚凝胺，对于禽类的其他亚群则不需要聚凝胺 。如果细胞对于聚凝胺不敏感 (大多数包装细胞都如此) 则延长培养时间，不会损害细 胞 。
⑷如果细胞对于聚凝胺不敏感，贝_ 培养基以增加体积。对 于 IOOmm 培养皿加培养基至终体积 10m l ，对于直径 60m m 培养皿加4 ml， 培 养 2? 3 天。
腺病毒载体法
腺病毒可以感染分裂细胞和未分裂细胞，插 入 的 外 源 D N A 容量大。容易获得较高的滴度，病毒颗粒较稳定，但是其不足也比较明显，外源基因表达是暂时的，而且其体内应用容易引起免疫反应等。
1 ) 使用设备与试剂
C O 2 培养箱、培养板或培养皿、人胚肾 (HEK293) 细胞系、阳离子脂质体转染试剂。
2 ) 操作步骤
⑴ 在 6 孔培养板或直径 35m m 培养皿中接种约 5xl05 个 H E K 2 9 3 细胞， 5 % C O 2培养箱中培养24 h 。
(2) 提取重组病毒质粒 DNA 10|ag， 用 Pac I 酶切使之线性化。
⑶ 按 照 厂 家 说 明 用 lipofectamine(GIBCO 公司) 进行转染 293 细胞。
(4) 7? 10天后用荧光显微镜进行观察，可以看到多数 293 细胞中有 G F P 的表达。
(5) 收取细胞，在- 7 0 ℃ / 3 7℃ 条件下反复冻融 4 次裂解细胞，离心取含病毒的上清再次 感 染 293 细胞以扩增重组病毒。
(6) 3 天后收集细胞，反复冻融 3 次。
(7) 取 400W 稀释液加至 293 细胞培养瓶中，于 3 7℃ 孵 育 3 h ，换新鲜培养基继续培养 18——24 h ，于荧光显微镜下计数 G F P 阳性细胞数，按以下公式计算病毒滴度 ：
病毒滴度= G F P 细胞阳性数 X 病毒上清稀释倍数/〇.4 ml (pfu/ml)
3 ) 注意事项
收集毒液后可以进行纯化，用 CsCl 密度梯度超离心法进行病毒的纯化，将浓缩后的病毒储存液作不同比例的稀释。
定 位 研 究
定位研究的方法主要有荧光显微术、原位杂交、电子显微术。这里主要介绍通过荧光显微镜进行观察研究的方法，其试验策略是利用免疫学和非免疫学的荧光探针所具有的敏感性和特异性来揭示结构与功能的关系。
内源性 酶 检 测
β-半乳糖苷酶活性检测
炔半乳糖苷酶是经典的组织化学报道基因，其活性可以用多种底物来检测。最常用的 是 X -gal。当 々-gal 水 解 X -gal 分子的糖苷键时，会产生一种可溶性的、无色的吲哚单体 。随后，两个游离的吲哚基团无需酶促催化，即可自发氧化形成二聚体。最终形成的卤化靛青是一种极稳定且不溶于水的蓝色复合物。
1 ) 整块组织 (如胚胎) 的 X-gal 染色
⑴ 使 用 设 备 与 试 剂 ：含 有 2m m 〇] y L MgCl2 的 P B S 、 2 % ? 4 % 多聚甲醛、 X-gal 反应缓冲液 (35 mmol/L 亚铁氰化钾、 35 mmol/L 铁氰化钾、 2 mmol/L MgCl2、 0.02% N P -40、 0.01%
脱氧胆酸钠)、 X -gal 储存液 (40 mg/ml X -gal 溶 于 D M F )
(2) 操作步骤：
a. 将组织在冰上预冷的含有 2 mmol/L MgCl2 的 P B S 中剪碎。
b. 在 2%——4% 多 聚 甲 醛 中 冰 上 固 定 30m i n 到几个小时。
c. 用 P B S 漂洗几遍。
d. 用 X -gal 反应缓冲液稀释 X -gal 储存液，与组织在 3 7 1 孵 育 2——4 h 。
e.在 P B S 漂洗多次，直到漂洗液不再发黄为止。最好过夜漂洗。
f. 在明视野的显微镜下观察。
(3) 注意事项：
a. 固定时间不宜太久。
b. 在 X -gal 反 应 中 加 入 N B T 以替代铁离子，会形成紫色沉淀，这一反应比单用X -gal 反应更快更敏感。
2 ) 组织切片的 X-gal 染色
⑴ 使 用 设 备 与 试 剂 ：明胶蔗糖包埋液 (7.5% 明胶、 15% 蔗糖、 0.05% 叠氮钠)、包被
载玻片的明胶溶液 (2 g 明胶， O.lg 硫酸铬钾溶于 200m l 水)、 4 % 多聚甲醛、 Gelvatol(①取
蛋白质的结构/结构域。早期 的 M 13 方法和常规的P C R 方 法 ，由于操作繁琐，意外突变多等缺陷，使定点突变的实验受到很大限制，现在实验中常用的是 Stratagene 公司的 QuikChange Site-directed Mutagenesis Kit0
1 ) 操作步骤
⑴ 准 备 突 变 的 质 粒 从 常 规 中 经 纯 化 试 剂 盒 抽 提 质 粒 。
⑵ 设 计 一 对 互 补 的 、带有目标突变的引物，和模板质粒退火后用 PfuTurbo 聚合酶「循环延伸」。 PfuTurbo 聚合酶在非链置换反应条件下使引物线性延伸，产生环状带缺刻的突变产物。
(3) D/m I 酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是 经 d a m 甲基化修饰的，对 I 敏感而被切碎。
⑷带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开形成具缺刻的双链 D N A ，将其转化 至 X L -2 Blue 超级感受态细胞中，即可得到突变质粒的克隆。
2 ) 注意事项
(1) 循环延伸是指聚合酶按照模板延伸引物 ， 一 圈 后 回 到 引 物 5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。用的是低次数的循环延伸而非 P C R ，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化。
(2) D/m I 识别序列为甲基化的 G A T C ， G A T C 在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。
蛋白质的磷酸化在细胞生长和分化的调控中扮演着重要的角色。靶蛋白的磷酸化程度由它们的蛋白质激酶和磷酸酶的相对活性决定。而且这两类酶的平衡受到许多因素影响 ，如生长因子、激素、细胞周期等。因此研究蛋白质磷酸化水平对于深入了解其所参与的信号转导过程是非常重要的。蛋白质磷酸化的定量测定常用 32P 来完成 (斯佩科特等2001)。
1 ) 所用设备与试剂
细胞培养瓶、液闪计数器、刮 刷 、低磷酸培养基 (无放射性磷酸盐)、裂解缓冲液[20 mmol/L Tris(p H 7.5)]、 2 mmol/L E D T A 和 0.5% S D S 、 N P -40、 DNase I。
2 ) 操作步骤
(1) 用 60m m 或 I O O m m 培养瓶，在完全培养基中培养细胞至所希望的密度。
⑵用预热的低磷酸培养基 (无放射性磷酸盐) 冲洗 2 次 ，然后加人含 0.5?ImCi32 P/ml(ICi = 3.7xl010 Bq) 的低磷酸培养基 (50——100umol/L 无机憐酸)。
(3) 培养结束后，回 收 32 P 标记培养基，用 IOml Aquasol(New England Nuclear) 稀 释 ，取一等份用液闪计数器测定 32P 活性。测定培养基中磷酸浓度，从这两个数据计算标记培养基中 32P 比活性。
⑷ 用 无 二 价 离 子 的 P B S 清 洗 32P 标记的细胞2 次。每 个 I O O m m 培 养 皿 加 Iml 预热的裂解缓冲液在沸水浴中裂解细胞。用一次性细胞刮刷将细胞裂解物刮到一边，然后吸到 1.5m l 离心管，热 水 浴 l 〇 min。
(5) 冷却至室温。
(6) 离心留上清，加 仰 - 4 0 至 2 % ，加 MgCl2至5mmol/L。加无蛋白酶的DNaseⅠ 与RNase 各 0.I m g ，室温放置 20 min
3 ) 注意事项
(1) 标准组织培养基有 l——2 mmol/L 磷酸盐。为 提 高 32P 标记效率，通常将培养基中磷酸盐浓度降至 5 〇 umol/L 或者更低。标记时间决定于胞内 A T P 库与培养 基 中 32 P 比活性达到平衡的快慢。
(2) 对于长时间培养，为避免类似成纤维细胞这样的快速分裂细胞生长减慢，培养基中无机磷酸浓度应保持在 50? 100 mmol/L 。
(3) 测定培养基中磷酸浓度时也可用高效液相层析从其他 32P 标记的分子中分离A T P ，直接测胞内 [Y-32P] A T P 的比活性。
⑷ 2——4 h 的短脉冲标记可以用来研究瞬时的蛋白质磷酸化。然 而 ，在脉冲标记实验中 ，蛋 白 质 32 P 标记的暂时提高，可能是磷酸化的提高，也可能因为磷酸转换增强，而蛋白质稱联的磷酸的量并没有改变。分别用含有}
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