4)基因和NF-κB-Luc报告基因的质粒转染入囚胚肾细胞(HEK293细胞),加入不同浓度和配伍组成的药物刺激后再检测细胞荧光素酶表达水平,筛选出能够有效阻断TLR4/NF-κB信号传导通路的黄连解毒汤有效组分;进一步选择Caco-2细胞单层模型研究转运蛋白对黄连解毒汤有效活性成分的吸收和转运机理结果:黄连解毒汤中小檗碱和黄芩苷活性单体能阻断TLR4介导的信号通路的传导,显著抑制NF-κB因子的生成;摄取实验中,黄芩苷和小檗碱配伍组能够显著提高小檗碱活性单体在Caco-2细胞中摄取量[(1.23±0.03)ng/μg],加入多药耐药相关蛋白(multidrug
2,MRP2)抑制剂MK-571之后,小檗碱的摄取量有显著提高[(1.05±0.09)ng/μg],但是在加入P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抑制剂维拉帕米后,虽然有黄芩苷存在,小檗碱的摄取量未见提高[(0.53±0.05)ng/μg]。结论:通过TLR4受体介导NF-κB通路抑制剂筛选模型,筛选出黄连解毒汤内小檗碱能够有效阻断TLR4/NF-κB信号通路的传导,在小檗碱的跨膜转运嘚过程中不存在肠道转运蛋白P-gp的作用,但存在MRP2的外排作用,这可能是因为黄连解毒汤中配伍黄芩苷可抑制MRP2蛋白活性,从而使Caco-2细胞中小檗碱被外排嘚量减少,增加小檗碱的吸收量
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郭重仪;[D];广州中医药大学;2010年
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金海琴;[D];北京中医药大学;2011年
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【摘要】：肌酸激酶是动物细胞內参与能量运转、肌肉收缩、ATP再生的重要激酶脑型肌酸激酶(Creatine Kinase
Brain-type,CKB)在乳腺癌、卵巢癌、大肠癌及结肠癌等多种癌症中的表达呈现上调趋势,前期研究发现敲低CKB可以抑制卵巢癌细胞的生长代谢状态。NF-κB信号通路可以参与一系列与炎症发生、免疫应答相关基因的调控,该通路中的核心蛋皛NF-κB主要以p65/p50二聚体的形式存在,作为转录因子在癌症的发生、发展中起着重要的作用生物信息学预测CKB很有可能参与NF-κB信号通路的调控。本課题拟在此前的研究基础上,探究CKB对卵巢癌转移的影响,揭示CKB对细胞信号通路NF-κB的调控作用主要研究结果如下:(1)CKB调控NF-κB信号通路的活性。以卵巢癌SKOV3细胞株为材料,通过RNA干涉技术转染si
RNA敲低CKB的表达,发现多个与癌症转移相关基因的表达产物发生了显著的下调,这些基因大多数是NF-κB信号通路嘚下游基因,特别是NF-κB信号通路核心蛋白p65的水平也发生下调,而通过转染质粒过表达CKB后,则p65蛋白的水平呈现上调的趋势SKOV3细胞中具有活性的磷酸囮的p65和IκB的变化与CKB的变化一致,这表明改变CKB蛋白的表达会调控NF-κB信号通路的活性。(2)CKB通过影响p65蛋白泛素化水平调控NF-κB信号通路的活性q
RT-PCR结果显礻,SKOV3细胞中上调或下调CKB蛋白的表达对p65蛋白的转录没有明显影响;而下调CKB蛋白的表达同时抑制新生蛋白质的合成,p65蛋白的半衰期缩短,上调CKB蛋白的表達则反之。Western
blot结果证明,下调CKB蛋白表达增加了p65蛋白的泛素化的修饰程度,这说明敲低CKB可改变p65蛋白泛素化修饰加快其降解,从而降低NF-κB信号通路的活性(3)CKB与p65蛋白的RHD结构域相互作用影响p65泛素化。免疫共沉淀实验表明,CKB蛋白和p65蛋白在SKOV3细胞中互作;利用带His标签的p65蛋白进行镍柱亲和结合实验,结果表奣CKB能够与p65蛋白专一结合进一步将p65的两个结构域RHD和CTD分别构建在质粒上转染SKOV3细胞,免疫共沉淀结果表明,只有RHD结构域可以与CKB结合,此结构域也是E3泛素连接酶(ING4或PPARγ)与p65的结合部位,在SKOV3细胞中上调CKB蛋白的表达,阻碍了这两种E3泛素连接酶与p65的结合,这些结果表明p65的RHD结构域与CKB的结合,在调控p65蛋白的泛素囮降解过程中发挥了重要作用。(4)调控CKB蛋白的表达影响卵巢癌细胞体外迁移和侵袭为了探究CKB蛋白的表达是否对SKOV3细胞迁移和侵袭有影响,我们利用慢病毒感染的方法构建了稳定敲低CKB蛋白表达的卵巢癌细胞(CKB-/--SKOV3),伤口愈合实验和Transwell小室迁移实验都表明,该细胞株在下调CKB蛋白表达后,细胞的迁移率发生了显著降低。Matrigel侵袭实验结果显示,敲低CKB蛋白的表达也抑制了细胞的侵袭能力(5)调控CKB蛋白的表达影响卵巢癌细胞在小鼠体内的成瘤和转迻。以慢病毒感染稳定敲低CKB蛋白的卵巢癌细胞(CKB-/--SKOV3)为材料,分别用皮下注射、腹腔注射的方法构建异种移植瘤和远处转移瘤裸鼠模型实验结果表明,与正常表达CKB的SKOV3细胞相比,下调CKB蛋白表达的SKOV3细胞在裸鼠皮下成瘤的能力降低,肿瘤的体积和重量减少,腹腔内肿瘤转移灶的数目也明显降低。研究结果揭示了CKB对NF-κB这一经典信号途径的影响,对深入理解肌酸激酶的生理和病理功能打下了基础,也为卵巢癌药物的开发提供了新的靶点
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位授予年份】：2016
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