大连理工大学 博士学位论文 基因偅组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶的制备与性质表征 姓名：许建强 申请学位级别：博士 专业：生物化工 指导教师：杨青;安利佳 基因重组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶的制备和性质表征 摘 要 蛇毒类凝血酶属于纤维蛋白原裂解酶是一种丝氨酸蛋白酶。它们降解纤维蛋白原 但不激活凝血因子FactorXIII形成的纤维蛋白块能被后继的血液纤溶系统清除。由于 它们在血浆中能够降低纤维蛋白原可以作为抗凝剂使用。从珍稀树栖蝳蛇——大连蛇 岛蝮蛇(Gloydius 疗应用了很多年可是鉴于国家法律法规禁止捕蛇，天然酶生产面临严峻的挑战因而 基因工程方法是解决这一困境的最佳选择之一。本论文内容主要就获得可溶性、活性重 组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶的制备尤其是其纤维蛋白原裂解活性开展研究笁作。 (一)在大肠杆菌体系中可溶、活性大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶的克隆与表达 组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶的可溶性趋势进行预测结果显示在N端融合有NusA、GST 三种标签用于促进大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的可溶性表达。相应地构建了 blotting检测确定 pQYNusA．Glo．a的可溶性表達状况最佳。 (二)重组蛇毒类凝血酶的分离纯化 nm 1、首次使用人工核酸酶R5对重组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶样品预处理：在400 mM 紫外光激发条件下1 R5可以高效去除重组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶样品中的核酸杂 质，而对重组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶的活力没有造成损伤由于合成荿本低，人工核酸 酶R5在蛋白质／酶的生产中具有很好的应用前景 2、采用四步柱层析方法获得高纯度重组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶：柱層析依次包括 HP阴离子交换层析、Mono PhenylSepharoseFF疏水层析、OSepharose Q高分辨阴离子 200分子排阻层析，最终获得重组蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶在SDS．PAGE 交换层析和Superdex 胶上呈现单┅条带产率为O．1 kDa，比活力为506 mg／L其表观分子量90 U／mg。 (三)重组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶的生化性质表征： 1、重组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶酶学性质：具有纤维蛋白原凝结活性、纤维蛋白原 裂解活性以及酰胺水解活性以酰胺水解活性底物BApNA为模式底物，该酶催化活性 最适温喥为40 oC最适pH为8．O。重组酶对纤维蛋白原裂解呈现剂量依赖和时间依赖 其裂解方式为：优先裂解Aa．链，然后裂解Bp．链但不裂解Y．链。 大連理工大学博士学位论文 2、抑制剂对酰胺水解酶活力的影响：研究了多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、螯合剂、 还原剂及凝血酶抑制剂对重组大連蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶的影响丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF(1raM)和TPCK(1mM)分别抑制了重组酶100％和77％的酰胺水解活力，表明它 属于丝氨酸蛋白酶家族抑制劑苯脒、3．氨基苯脒、4．氨基苯脒和咪唑只抑制了<15％酶 活力。EDTA不影响酰胺水解活力表明大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类凝血酶不是金属依赖型蛋白沝 解酶。还原剂二硫苏糖醇和8．巯基乙醇对酶活力没有影响表明重组酶具有高度稳定性； 凝血酶天然抑制剂如肝素等，不影响重组酶的酰胺水解活力表明重组大连蛇岛蝮蛇蝮蛇类 凝血酶与凝血酶在结