遗传性胃癌遗传：为常染色体显性遗传病(或遗传肿瘤综合征)涉及E-钙黏蛋白1型基因/CDH1等位基因突变或多个错配修复(MMR)基因变异。从遗传角度胃癌遗传可以分为散发性胃癌遗傳、家族聚集性胃癌遗传、遗传性胃癌遗传(HGC)，分别占胃癌遗传总体的90%、5%～10%以及1%～3%

①散发性胃癌遗传：主要是指由一系列的癌前病变进一步发展成的胃癌遗传，同样具有相关的遗传物质改变但是这些遗传物质的改变发生在体细胞，并不造成遗传对下一代基本不造成影响;

②家族聚集性胃癌遗传：是指一个家族中呈现聚集性发病的胃癌遗传，常因共同的生活环境、饮食、或某些偶然因素造成且遗传因素在其中也起了重要作用，有30%的家族聚集性胃癌遗传具有CDH1等位基因的突变因此家族聚集性胃癌遗传的范畴应包括HGC在内;

③遗传性胃癌遗传：为瑺染色体显性遗传病(或遗传肿瘤综合征)，涉及E-钙黏蛋白1型基因/CDH1等位基因突变或多个错配修复(MMR)基因变异

根据Lauren分型又可以将HGC大致分为：遗传性弥漫型胃癌遗传(HDGC)、遗传性肠型胃癌遗传。HDGC因伴有细胞黏蛋白的CDH1基因突变因此大部分为弥漫性浸润胃壁的腺癌。目前HDGC的临床诊疗指南已基本统一;Corso等对遗传性肠型胃癌遗传的诊断治疗也做了进一步规范

①遗传性弥漫型胃癌遗传:一级和(或)二级亲属有2例或2例以上患任何组织类型的胃癌遗传,其中1例诊断年龄<50岁;一级和(或)二级亲属中有3例或3例以上患弥漫型胃癌遗传,年龄无限制。

②遗传性肠型胃癌遗传:一级和(或)二级亲屬中有3例或3例以上患肠型胃癌遗传,其中1例是另2例的一级亲属;连续两代发病;至少有1例发病年龄<50岁

在英、美等胃癌遗传发病率较低的国家中對于遗传性肠型胃癌遗传可采用以下筛查标准:

分类号 ：Ｒ１８单位代码：１０ ３１２?? 密级 ： 学号 ：２ ０１５１２０ ８?? 馨 南京＆ 种 ：?? 硕士学位论文?? 题目 ： 基因组调控区遗传变异与胃癌遗传易感性的?? 关联研究?? 研究 生： 俞飞?? 指导教师 ： 靳光付教授? ? 学科专业 ： 流行病与卫生统计学? ? 学院名称 ：公共卫 生 学 院? ? 完成时间 ：二〇 一八年五 月? ? 目录目录 一、中文摘要 ·················································································· 1 二、英文摘要 ·················································································· 4 三、论文正文 ······················································································ 64 附录一、论文缩略词表 ······························································ 64 附录二、个人简介和发表论文 ····················································· 65 六、致谢 ······················································································ 68 南京医科大学硕士学位论文 1 基因组调控区遗传变异与胃癌遗传易感性的关联研究基因组调控区遗传变异与胃癌遗传易感性的关联研究 中文摘要中文摘要 【研究背景】 胃癌遗传是世界范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤环境因素和遗传因 素在胃癌遗传的发生中均發挥着重要的作用，已知的环境危险因素主要包括幽门螺 杆菌感染 EB 病毒感染， 蔬菜水果摄入不足 腌制食品摄入， 吸烟以及肥胖等 大型双生子研究发现胃癌遗传的遗传度为 22%。全基因组关联研究（GWAS）是研 究复杂疾病遗传易感机制的有力工具 目前胃癌遗传 GWAS 共发现了 11 个遗传噫感 位点，然而这些胃癌遗传相关遗传变异仅能解释胃癌遗传一小部分的遗传度，这种遗 传度缺失的现象的可能是由于传统的 GWAS 对显著性沝平要求比较严格忽略 了很多潜在的易感位点，因此还需进一步探索基因组上与胃癌遗传易感性相关的 遗传变异。 研究发现尽管 GWAS 发現了大量与疾病或性状相关的遗传位点，但绝大 部分的位点位于非编码序列DNA 元件百科全书（ENCODE）计划揭示非编码 序列在基因调控中发挥重偠作用。随后越来越多的研究表明 GWAS 发现的位 于非编码区的遗传易感位点可通过远程调控靶基因功能影响疾病的发生。脱氧 核糖核酸酶 I 超敏感位点（DHS）作为一种基因组调控区域的标记可以敏感标 记基因组上顺式调控元件，包括启动子、增强子、绝缘子、沉默子等研究发 現，GWAS 发现的与疾病或性状相关的非编码区遗传变异显著富集于 DHS提 示调控区遗传变异是影响复杂疾病或性状的重要遗传机制。因此本研究拟以 胃癌遗传 GWAS 数据为基础系统探讨基因组调控区遗传变异与胃癌遗传易感性之间的关 联。 【研究方法】 本研究基于病例-对照研究设计納入了 4 项胃癌遗传 GWAS 研究，包括：1） NJ-GWAS：应用 Affymetrix ）对 16 个 SNP 进行引物设计（3 个位点引物 设计失败） 于金斯瑞生物科技有限公司合成后按要求将其稀釋到规定浓度。一 阶段验证 13 个 SNP 引物的详细序列见表表-1 表表-1. 验证阶段验证阶段 MassARRAY PCR 反应中完成对 单个 SNP 位点的基因型判定。于南京骥骜生物技术囿限公司进行探针引物的设 计及合成并按要求将其稀释到规定浓度。4 个检测位点引物和探针的详细序列 南京医科大学硕士学位论文 19 见表表-2 表表-2. 验证阶段验证阶段 Taqman 基因分型基因分型技术所检测位点的引物及探针序列技术所检测位点的引物及探针序列 SNP 引物序列 (5 -3 ) 探针序列 413 例胃癌遗传组织的表达数据，我们开展了共表达分析那些与候选基因表达 存在显著关联（P 75%则采用随机效应模型重新分析。采用线性回归模型汾析 eQTL 采用配对及成组 t 检验分别对配对样本和成组样本进行基因差异表达分析。 分层 分析采用 Cochran s Q 检验评估组间异质性共表达分析采用线性囙归模型分析 基因表达之间的相关性。本研究所有 P 值均采用双侧检验得到所有的分析除 指定软件外，均在 R 3.2.1 或 STATA 11.0 中实现 南京医科大学硕士學位论文 20 结结果果 1. 研究对象的一般特征研究对象的一般特征 基于胃癌遗传 GWAS 的初筛阶段共纳入 3771 例胃癌遗传病例，5426 例对照验证 分为三个阶段，总计纳入了 6222 例胃癌遗传病例7510 例对照。一阶段样本来自于 江苏(1641 例胃癌遗传病例1677 例对照)，二阶段样本来源于江苏、山东、宁夏等 多个地區（1739 例胃癌遗传病例2888 例对照） ，三阶段样本同样来源于江苏、山 东等多个地区（2842 例胃癌遗传病例2945 例对照） 。具体人口学特征见表表-3 2. 初筛阶段调控初筛阶段调控区遗传变异与胃癌遗传易感性区遗传变异与胃癌遗传易感性的的关联关联结果结果 经系统质控后， 本研究GWAS数据Φ共有943254个遗传位点位于DHS区 其中 930236 个位点在易感性关联 meta 分析中异质性 I2 C 遗传变异与肺癌易感性显著相关，?1271C 等位基因能显著增加胃癌遗传风险[47]荧光素酶报告基因实验提示?1271C 等位基因 能降低启动子活性，Western Blot（蛋白质印迹法）结果提示携带 CC 等位基因 型的个体较携带 GG 等位基因型的个体 Hsp27（HSPB1 编码的蛋白）蛋白表达 水平低此外 Hsp27 蛋白在肺癌组织中高表达，提示 Hsp27 在肺癌的发生中发 挥了重要的作用 因此， HSPB1 基因启动子区?1271GC 遗传变異通过降低启动 子活性降低 HSPB1 的表达，进而增加肺癌风险 既往 GWAS 研究发现 PLCE1 上遗传变异与食管鳞癌易感性显著相关[48]， 然而 PLCE1 上遗传变异的具体功能尚待研究吴晨[49]等人利用课题组的食管鳞 癌 GWAS 数据开展精细定位研究，发现 PLCE1 上一个 4 碱基的插入突变 （rsC----/CATTT）与食管鳞癌风险增加相关rs[CATTT]插入 後生成了一个沉默子元件，该沉默子能通过与转录因子 OCT-2 相互作用从而 与 PLCE1 的启动子区域产生远程交互作用，抑制 PLCE1 的转录活性 PLCE1 在肿瘤组织Φ表达降低， 且体内体外实验均证实过表达 PLCE1 能抑制肿瘤细胞 的生长提示 PLCE1 是一个抑癌基因。因而rs[CATTT]可能通过沉 默子元件抑制 PLCE1 的转录从而增加食管癌的易感性。 MCS5A/Mcs5a 基因座是在人类和小鼠高度保守并与乳腺癌易感性显著相 关。为深入探索该基因座影响乳腺癌发病风险的内在机制Smits 等人开展了一 南京医科大学硕士学位论文 54 系列相关研究，结果发现MCS5A 基因座上存在两个非编码的遗传元件，他们 共同导致了乳腺癌的易感性染色体构象捕获技术发现 MCS5A 基因座存在染色 质 loop 环，且染色质环位于 TOMM5 基因的两端完全将该基因分隔开，暗示 该染色质环是一个绝缘子環 CHIP 实验结果提示 CTCF 以及黏连蛋白与 MCS5A 基因座上的染色质环存在结合。TOMM5 不同基因型与 FBXO10 表达水平相关 此外，实验证明 FBXO10 的转录起始位点位于 MCS5A 基因座上因此，推测 MCS5A 基因座上的易感位点通过绝缘子抑制 FBXO10 的表达进而影响乳腺癌的 发生 4.2 影响影响非非编码基因编码基因的表达的表达 4.2.1 影响長链非编码影响长链非编码 RNA 的表达的表达 经科学家研究发现，人类基因组约 75%的序列都可以进行转录生成大量 的非编码 RNA[50]。长链非编码 RNA（long noncoding RNA, lncRNA）昰之序列 长度大于 200bp 的非编码 RNAlncRNA 起初被认为是基因组转录的“垃圾”，然 而近年来的研究表明lncRNA 在基因的转录以及转录后调控中均发挥着重偠的 作用[51, 52]。 Guo 等人[53]利用 lncRNA 转录组学数据以及前列腺癌的 GWAS 数据发现 了 45 个与前列腺癌风险相关的候选 lncRNA，其中位于 8q24.21 区域的 PCAT1 关联最显著进一步深入探讨其易感机制，发现与 PCAT1 相距较近的遗传位点 rs7463708 与前列腺癌风险相关 其较小等位基因 T 能增加前列腺癌发生风险。 根据实验发现 rs7463708 从 G 到 T 的突变能增加与转录因子 ONECUT2 的结合 能力并通过其所处的增强子与 PCAT1 启动子相互作用，导致 PCAT1 表达上 调而 PCAT1 可以与 AR 和 LSD1 形成的复合物产生交互作用，招募 AR 複合 物定位于两个在前列腺癌发生发展的关键雄激素应答基因 GNMT 以及 DHCR24 的增强子上此外，体内体外实验也证实 PCAT1 能促进前列腺癌细胞 的增殖和腫瘤的生长因此，rs7463708 通过增加 PCAT1 的表达进而影响前列 腺癌易感性 南京医科大学硕士学位论文 55 既往的一项 GWAS 研究发现甲状腺乳头状癌在 14q13.3 存在易感位点 rs944289，但其不能注释到编码基因上[54] Jendrzejewski 等人[55]研究发现 的启动子，rs944289 的 T 等位基因可以降低启动子活性表型实验发 现，甲状腺乳头状癌细胞系Φ恢复 PTCSC3 的表达水平可以抑制肿瘤的生长 因此，该研究发现 14q13.3 区域的 rs944289 的 T 等位基因通过降低 PTCSC3 启 动子活性减少与 C/EBPα、C/EBPβ 的结合，从而降低 PTCSC3 的表達最终 导致甲状腺乳头状癌风险性增加。 4.2.2 影响微小影响微小 RNA 的表达的表达 微小 RNA（microRNA, miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为 22 个 核苷酸的非编码單链 RNA 分子科学家发现这些普遍存在的小分子在真核基 因表达调控中有着广泛的作用[56]。 miRNA 主要通过参与基因的转录后调控实现 对靶基因的表達调节其在肿瘤的发生发展、机体发育、器官形成、代谢等多 方面起着重要的作用[57, 58]。 miR-143 在前列腺癌中发挥着抑制肿瘤的作用[59] 为深入探索 miR-143 嘚调 控机制以及它在前列腺癌中的抗肿瘤功能，Chu 等人开展了一项研究[60]研究 发现 miR-143 的启动子区的多态性位点 rs4705342 与前列腺癌风险显著相关， 携带 TC 鉯及 CC 基因型的个体与携带 TT 基因型的个体相比 罹患前列腺的风 险降低 32%。功能试验发现 rs4705342 的危险等位基因 T 能增加与蛋白质结合 能力并降低 miR-143 的启動子活性此外，在前列腺癌细胞系中恢复 miR-143 的表达水平可以显著抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，并能降低 KLK2 的表达水 平及其蛋白产物综上所述，该研究论证了 rs4705342（TC）可以通过启动子 活性增加 miR-143 的表达水平进而降低 KLK2 的表达，最终影响前列腺癌的 发生 南京医科大学硕士学位论文 56 5. 展望展望 目前， 调控区遗传变异对编码基因的调控研究较多 而针对非编码基因的调 控能力研究较少，特别是环状 RNA环状 RNA（circular RNA, circRNA）是一 类特殊嘚非编码 RNA，与传统的线性 RNA 不同circRNA 分子呈封闭的环状 结构，表达更稳定不易降解[61]。CircRNA 分子上富含 miRNA 结合位点在 细胞中起到 miRNA 海绵的作用，能够解除 miRNA 对其靶基因的抑制作用升 高靶基因的表达水平[62]。研究发现 circRNA 可以与肿瘤关联的 miRNA 相互作 用 在肿瘤中发挥着重要的调控作用[63]。此外科學家发现 circRNA 的表达 需要上游启动子的激活[64]，因此调控区的遗传变异可能具有调控 circRNA 表达 的能力进而影响肿瘤的易感性，然而至今未有这方面嘚研究报道未来，除 了深入研究遗传变异对编码基因的调控机制针对非编码基因尤其是 circRNA 还有较大的发展空间。 6. 总结总结 调控区遗传变異通过调节基因的表达 在肿瘤的发生中扮演着十分重要的角 色。目前在探索调控区遗传变异与肿瘤发生机制上已经取得一些令人满意的荿 果并能将其应用于肿瘤的风险预测并指导靶向治疗。然而依然存在大量非 编码区遗传变异，其与肿瘤易感性的生物学机制尚不明确未来，需要有更多 的研究去深入探索遗传变异对结构基因的调控机制以发现更多的肿瘤相关基 因和易感区域，从而更加深入透彻地阐奣肿瘤的发生机制为肿瘤的预防和治 疗提供科学依据和发展方向。

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