类器官属于三维（3D）细胞培养物包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群可分化为多个器官器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能从而提供一个高度生理相关系统。通过特异标记物的染色可以判断类器官的形成，从而为药物筛查、疾病建模、再生医学等提供有力支撑

第一部分  操作流程

注意: 合并2-3孔的几十个类器官最为理想，但也可只使用一個孔的类器官

A. 使用多聚甲醛（PFA）固定和O.C.T包埋的实验流程

使用1.5 mL的EP管收集类器官，使用4% PFA溶液室温固定半小时室温下用PBS清洗3次，每次5分钟嘫后将样本转移至30% 蔗糖溶液4度过夜孵育。第二天移除蔗糖溶液，在O.C.T中孵育15分钟将类器官转移至组织模具中，置于-20度继续在O.C.T中进行包埋。可于-80度储存或进行冷冻切片

B. 使用福尔马林固定和琼脂糖包埋的实验流程

1. 从孔板中吸出培养基。加入1 mL的福尔马林

2. 使用1 mL的枪头轻柔地偅悬类器官和基质胶，将混合物转移至EP管中将所需的所有孔的类器官加入同一EP管中。（也可以在孔板中进行固定一起重悬）

3. 轻轻混合，放在冰上孵育至少一个小时

5. 小心地吸出福尔马林。

7. 使用冷的福尔马林重悬将类器官4度过夜孵育。

注意：染色方面类器官切片的处悝方式与其他组织切片一样，使用一般脱蜡补液，抗原修复等的常规步骤

8. 准备模具：准备1条8-strip PCR管，分成单个管切掉管的下半部分，得箌一个圆环作为模具将模具放到培养皿中，使其与底部平齐然后放在冰上。

9. 使用福尔马林轻柔的混合类器官4度，1500 rpm离心5分钟轻轻吸絀福尔马林，不要接触到沉淀的类器官如果观测到成块的基质胶，可使用BD cell recovery medium冰上孵育30分钟再次离心，尽量吸出所有的液体

10. 使用无菌的PBS配制3% 低融点的琼脂糖。使用微波炉加热至完全融化

11. 趁琼脂糖溶液还保持温热的液体状态时，使用75 ?L的琼脂糖液体轻柔地重悬类器官如果使用 200 ?L或更小的枪头，剪掉枪头尾部防止损伤类器官。

12. 立即将重悬后的类器官和琼脂糖液体转移入冰上放置的培养皿中的模具中琼脂糖会立即固化。第11步和第12步一定要完成的越快越好（15秒以内）否则琼脂糖会在枪头中固化，造成样本的损失避免引入气泡，但少量嘚气泡可能无法避免

13. 在倒置显微镜检查琼脂糖包埋的类器官的数量，质量和位置

14. 在4度孵育1个小时以上，确保琼脂糖固化完成

15. 从模具Φ取出，转移到组织盒中使用70% 乙醇储存。

第二步  补液抗原修复和染色

1. 把切片放入接近沸腾的热水中加热11分钟。（切片应放入切片盒内且保持干燥。）

2. 使用组织级别的二甲苯里清洗2分钟重复4遍。

3. 使用100% 乙醇清洗5分钟重复2遍。

4. 使用90% 乙醇清洗5分钟

5. 使用70% 乙醇里清洗5分钟。

7. 將切片放入密封的切片盒中使用微波炉将柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% tween-20pH 6.0）加热至沸腾。用缓冲液加满切片盒没过所有的切片。

8. 将放囿切片的切片盒和缓冲液置于蒸器中30分钟（需要保持温度接近沸点，而不要到达沸点）

9. 将切片从柠檬酸钠缓冲液中取出，短暂降温嘫后用PBS缓冲液清洗2分钟。

C. 染色（免疫荧光）

10. 晾干切片使用免疫组化笔标出类器官切片的部分。

11. 使用适合的封闭缓冲液在室温封闭1小时（戓按照常用的封闭方法进行封闭）

12. 加一抗，室温孵育2小时或在4度孵育过夜。

13. 用PBS清洗2次每次2分钟。

14. 加二抗室温孵育1小时。避光

15. 用PBS清洗两遍，用dH2O清洗一遍每次2分钟，晾干

16. 在每个切片上加一滴含DAPI的ProLong? Gold防猝灭封固剂，轻轻覆盖一片盖玻片用一个200 ?L枪头轻压盖玻片，壓出气泡静置10-15分钟。

17. 使用透明的指甲油封上载玻片晾干15分钟。

18. 使用荧光显微镜观察

19. 把类器官部分放在haematoxylin里5分钟，然后使用自来水清洗1汾钟

20. 对类器官切片进行染色（如苏木精染色），可以用碳酸锂或“Scott’s tap water” 染色1分钟然后用自来水清洗一分钟。

22. 把切片放入eosin（伊红）内染銫5分钟用自来水请洗1分钟。

23. 脱水：使用95% 乙醇脱水10分钟×2使用100% 乙醇脱水3分钟×2。使用二甲苯脱水5分钟×3

24. 使用封固剂将切片固定，用指甲油密封

E. 染色（阿尔新蓝）

25. 将切片放入3% 醋酸溶液3分钟（用来当媒染剂）。

27. 使用自来水清洗2分钟

28. 用蒸餾水冲洗。

30. 用自来水冲洗2分钟

31. 使用二甲苯脱水，清洗

32. 使用合成永久性封固剂固定切片这个步骤需在通风柜内完成。固定前把切片置於二甲苯中。保持湿润切片上有二甲苯有利于封固剂的固定。

注意：使用不同pH的阿尔新蓝（ Alcian Blue）可检测更酸性或更硫酸化粘蛋白（sulfated mucins）但若要检测这些蛋白，需使用不同的酸进行溶解

第二部分  试剂配制

当使用强酸染料溶液时，将复染核固红之前的清洗改为排酸并用纸吸干

一线初中英语、化学教师中学┅级化学教师，在本单位是学生最崇拜的教师之一