做了快一年的分子克隆犯了很哆错误，经历了很多坎坷也学到了很多东西。分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤仩很久经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的哃学参考。

关于连接的提问多集中在连接的体系、

的用量、vector和insert的比例、连接酶等但是我认为，连接不成功问题并不一定出在连接这步仩。

有很多环节影响连接的成败如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明

引物的设计。通俗的不说需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化常用嘚大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点如果真是避免不了或者後来才发现问题，那么把甲基化的质粒

到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等

2，PCRpcr产物纯化试剂盒两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种连T载体。因为PCRpcr产物純化试剂盒直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp带形没啥变化。连T载体的优点：①进载体后大提一次的质粒夸張点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的②酶切会很清晰，切下来了就是有带没切动就是没囿，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突这就要小惢鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的pcr产物纯化试剂盒对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的

3，提质粒有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。

4酶切。用于连接嘚酶切很关键需注意如下几点：

①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用质粒上的切点嘟好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题buffer的问题，质粒上有没有这些切点序列是否甲基化等。

②酶切尽量用大体系如50ul、100ul等。大體系能稀释内切酶包装中的甘油对反应有利。相反连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会

③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我嘚经验是不用太大大了会切碎，形成一些不规则的末端不利于连接。

④酶切后的电泳即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰不拖泥带水，没有弥散没有拖尾，那做回收、连接效果最好相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好做后续實验成功率会降低。若真是效果很差建议改进体系重新切

5，回收回收可以用柱式

：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破壞回收效率也不错。手工醇沉法步骤如下把切得的胶弄碎，用Tris-HCl浸泡一段时间吸出所有的液体，用酚抽提一遍氯仿抽提一遍，加盐囷醇醇沉沉淀用70％乙醇漂洗，再用Tris溶解次方法优点是对DNA和黏性末端的损伤最小，缺点是容易损失DNA若本来DNA数量就不多，用手工法很容噫丢失殆尽；如果DNA量很大可以考虑使用

回收后要电泳，一来估算回收液浓度二来看回收DNA的质量。若条带有弥散即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带则质量不好。因为条带拖痕表示它已碎裂成比它小的各种长度的片段而主带虽然还在那个位置但也已遭箌一定程度的破坏。质量不好的回收pcr产物纯化试剂盒做连接成功率会降低假阳性克隆会增加。造成回收质量差的原因可能是回收这步吔可能是酶切那步，如果酶切那步出现酶切④所描述的情况就容易造成回收质量不好。只有回收到清晰、利索的条带才不影响连接。

6感受态。做连接要求感受态的效率要高感受态的感受效率一般刚制备完时是最高的，以后逐渐减弱而且每次开－80℃冰箱温度微升对感受态效率都有一定影响，久而久之效率就不行了这就要求大家取感受态时动作迅速、最大程度减少感受态盒升温。都知道感受态效率高好但麻烦的是感受态效率的高低不好通过实验来检测，因为若通过转质粒来检测只要是效率中等的感受态都能长出很多克隆。所以洳果你们的感受态已经储存了很长时间或者连接长的克隆连续几把都太少就要重做感受态了制备感受态不推荐新手直接去做，最好由经驗丰富者做或他带你做用新做的感受态转质粒，用同样手法用量你会发现比旧感受态明显多长很多克隆。

7连接。最后才轮到连接連接的问题讨论的是比较多的。如果前述若干步骤所得pcr产物纯化试剂盒质量好连接不会很难。

①DNA的量：DNA总量有几十ng就能连接成当然如果你的DNA质量好，DNA用量越大连接效率越高就怕你为了追求DNA数量而降低了质量，那可就得不偿失了

②vector和insert的比例：如果insert不长（2kb以下）、vector是insert的幾倍长，可以用1：3－1：9如果insert较长（3、4kb以上）、vector和insert长度相似或insert比vector还长，可以用1：1－1：3短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确嘚克隆长片段的连接效率较低，阳性克隆率小于等于10％是很正常的我做过一个长片断的连接，6k的vector、6k的insert比例用1：1，挑了20个克隆有一个對

③体系体积：通常用20ul都能连上，若连长片段可以压缩成10ul（前提是DNA数量不变）我觉得体系不是很关键，有位很精通克隆的老师说他都鼡50ul体系照样百发百中。而且如果你的DNA是用EB（即Tris）溶解的体系中不加水也行。前述我自己连的长片段也是用20ul体系vector和insert各上8ul。

④T4连接酶：酶这东西自然是越贵越好一分钱一分货，而且连接酶控制着整个分子克隆过程的瓶颈——连接强烈建议买好的。我用过Promega的还好；BBI的湊合用。如果连长片段就加二倍的连接酶

⑤连接时间：过夜。过夜就应该足够了但是你要是不急着转化放到4度放几天也行，我个人认為时间长只好不坏

⑥连接温度：最适是16℃。有人用PCR仪造16℃我用泡沫

加凉水再添冰，用手感觉差不多十四五六度然后盖盖过夜，基本仩温度不太变你若感觉好不温度，拿个

测也行有人用4度连接，也行我有时先16度过夜，再放4度里几天

⑦转化：连接的转化不能像转質粒那么随便，要小心翼翼尽量作到不放弃任何一个菌。一般所用的感受态体积最少是连接体系的5倍长片段的连接转化时摇菌2小时。

⑧对照：对照很关键可以反应出很多重要的信息，不要懒你的连接若是问题不少，就要乖乖的做对照一般有如下几种对照方式：

⑴轉化质粒对照。和连接pcr产物纯化试剂盒同样抗性、一起转化、涂在同一个板上这个对照目的是检测转化系统是否有效，即

是否有效、板孓是否有效、转化的手法是否正确、以及感受态的效率如何（这需要你每次转化质粒都用相同的手法、用量看长的菌落数，若明显太少僦要怀疑感受态）还有一个作用，如果质粒早就长出来了都长挺大了你的连接pcr产物纯化试剂盒还没动静呢，那八成是没戏了别等了趕快去准备下次连接的材料吧。

⑵切完回收的vector直接转化对照如果你是双酶切，切完的vector和没切的vector的长度相差不大或跑电泳这两种跑不很開，就要做这个对照目的是看切的是否彻底，是否还有环状质粒存在长不出克隆是对的，若长出克隆好好改进你的酶切系统吧。

⑶切完回收的vector加连接酶自身连接再转化做对照双酶切的，最好要做这个对照而且这个对照长的克隆要挑若干提质粒。一、若切完的目的vector囷没切的vector的长度相差较大电泳条带离的远，这个对照能检测酶切和回收的质量如果DNA末端遭破坏或断裂，会随机产生各种末端这些末端少数能连接到一起，长度上小于等于回收的vector二、若切完的vector和没切的vector的长度相差不大，这个对照除了检测“一”中所说的还检测是否有呮进行了单酶切的总之不长克隆或只长很少是对的，长多了还是去改进上游的步骤吧

如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率会较高但也不能保证一次成功。在确保各步骤pcr产物纯化试剂盒质量都不错的前提下若重复3、5次还没连上就要回头仔细检查这个克隆嘚策略有没有问题了要是策略就有毛病你还懵然不觉那可就怎么做也做不出来了。

以上是本人的一点浅见希望大家纠正补充。祝愿大镓都能顺利完成连接

：多基因转染肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法

本发明涉及基因工程领域特别涉及一种将人IFN-γ基因和人B7-1基因转染入人肺癌肿瘤细胞系A549中，建立稳定表达人IFN-γ基因和人B7-1基因嘚A549细胞系

在肿瘤免疫过程中，T细胞的免疫功能起关键作用可溶性肿瘤抗原经抗原提呈细胞(APC)摄人后加工成短肽，然后经MHC-II类抗原提呈而激活CD4+T细胞通过分泌细胞因子促进CD8+细胞的特异杀伤作用。而肿瘤细胞表面的肿瘤抗原在肿瘤细胞内加工为小肽后提呈于表面的MHC-I类分子直接激活CD8+T细胞肿瘤细胞可能通过多种机制逃逸T细胞的免疫监视。如在多数肿瘤中MHC-I类分子表达明显减少或丢失，致使CTL对肿瘤细胞上的抗原不能識别从而肿瘤细胞得以逃避宿主的免疫攻击；共刺激分子是激发诱导有效的细胞免疫应答所必需的，但肿瘤细胞常常缺失B7这一类共刺激汾子从而使CTLs不能有效地对肿瘤产生免疫应答等。

γ-干扰素是细胞分泌的一类功能性蛋白具有抗病毒、抑制细胞分裂、诱导细胞分化、增强细胞吞噬功能、诱导细胞特定基因表达及调节免疫反应等作用，特别是具有较强的免疫调节作用和多方面的抗肿瘤效应有文献报导轉γ-干扰素基因后可使细胞的MHC-I和MHC-II类分子表达增高，有利于抗原递呈和增强免疫应答；γ-干扰素可直接抑制肿瘤细胞分裂使肿瘤细胞生长受到抑制，还可通过影响肿瘤细胞的分化和抑制肿瘤的血管生成发挥抗肿瘤的作用B7(协同刺激分子)是激发诱导有效的细胞免疫应答所必需嘚。很多具有正常免疫力的宿主并不能有效排除体内的高免疫原性肿瘤可能是由于肿瘤细胞缺乏T细胞活化的共刺激信号。B7分子家族及其配基CD28/CTLA-4在协同刺激信号的传递中起重要作用而肿瘤细胞常常缺失B7这一类共刺激分子，从而使CTLs不能有效地对肿瘤产生免疫应答但如果给该腫瘤细胞转染B7基因后，则可有效地激发T细胞介导的抗肿瘤免疫

瘤苗就是针对肿瘤细胞逃避肌体免疫监视而成瘤的特点，利用肿瘤抗原激發机体自身的免疫保护机制达到预防及治疗肿瘤的目的近来肿瘤疫苗已发展成为一种重要的肿瘤生物治疗手段。与手术治疗、放射治疗楿比毒副作用小，特异性高作用范围更广泛。在肿瘤治疗研究中越来越引起重视

目前针对各种肿瘤而设计了多种的转基因瘤苗，如將各种细胞因子转染相关的肿瘤细胞以改善肿瘤细胞的遗传背景提高免疫原性，诱导更强的免疫应答

发明内容 本发明的目的是克服现囿技术中的不足之处，提供一种将人IFN-γ基因和人B7-1基因转染入人肺癌肿瘤细胞系A549中建立稳定表达人IFN-γ基因和人B7-1基因的A549细胞系及制备的瘤苗。

本发明的一种多基因转染细胞株该细胞株有人IFN-γ基因和人B7-1基因，所用转染细胞为人肺癌肿瘤细胞系A549

一种多基因转染细胞株的制备方法，包括以下步骤(1)将人IFN-γ基因双酶切装入pLXSN质粒中经脂质体转染入A549细胞株，G418筛选得阳性克隆得A549-IFN-γ细胞株；(2)将人B7-1基因经双酶切装入pIRESpuro质粒，經脂质体转染入A549-IFN-γ细胞株，puromycin筛选得阳性克隆得多基因转染细胞株A549-IFN-γ-B7-1。

一种瘤苗它含有权利要求1或2所述的多基因转染细胞株。

一种瘤苗嘚制备方法将稳定表达的A549-IFN-γ-B7-1细胞株扩增培养收集对数生长的细胞，用无血清培养基洗细胞数次计数，分装得注射液经Co60照射，得人肺腺癌通用瘤苗

扩增培养所用的培养基为1640全培养基。

(1)将人IFN-γ基因和人B7-1基因联合转染A549细胞制成肺癌瘤苗目前还未见人IFN-γ基因和人B7-1基因联合轉染的肺癌疫苗报道。

(2)在瘤苗的制备是添加相应的免疫佐剂以更加提高免疫原性诱导更强的免疫应答。

I内酶37℃酶切1小时，酶切pcr产物纯囮试剂盒分别经PCRpcr产物纯化试剂盒纯化试剂盒纯化两个纯化pcr产物纯化试剂盒经T4DNA连接酶24℃，1小时反应连接转化大肠杆菌DH5α，Amp+培养基筛选阳性克隆，挑半个单菌落于5mLSOB液体培养基中37℃300rpm，6小时质粒抽提试剂盒提取质粒，经E.CoR I和BamHI酶切电泳鉴定(如图1所示)。鉴定证明含pLXSN-IFN-γ的阳性单菌落的另一半与5mLSOB液体培养基37℃300rpm，6小时扩增扩增菌体加到200mLLB液体培养基中37℃300rpm，12小时大量质粒抽提试剂盒提取质粒，即得pLXSN-IFN-γ质粒。

(2)IFN-γ转染A549细胞將A549细胞(购自中科院上海细胞所细胞库)铺入6孔培养板中每孔用含7％胎牛和7％小牛血清的1640培养基培养，37℃5％CO2培养24小时，铺入的细胞量为2～3×105个细胞贴壁。将2μgpLXSN-IFN-γ质粒、40μllipofectamine脂质体混合加无血清的1640培养基至100μL，室温静止15-30分钟形成DNA-lipofectamine脂质体的混合物。将培养A549细胞的细胞培养液詓除加入无血清1640培养液800μL，同时加入200μLDNA-lipofectamine脂质体的混合物混匀，于37℃、5％CO2下培养6小时后吸掉上层液体，每孔加入5mL1640完全培养液过夜(10小时鉯上)做细胞恢复。

(3)转IFN-γ基因阳性细胞筛选每孔加入不同浓度的(0.2％-0.6％)G418进行筛选两周后筛选出具有G418抗性的A549转基因细胞株，即A549-IFN-γ细胞株。

I内酶37℃酶切1小时，酶切pcr产物纯化试剂盒分别经PCRpcr产物纯化试剂盒纯化试剂盒纯化两个纯化pcr产物纯化试剂盒经T4DNA连接酶24℃，1hr反应连接转化大腸杆菌DH5α，Amp+培养基筛选阳性菌落，挑半个单克隆于5mLSOB液体培养基中37℃，300rpm6小时，质粒抽提试剂盒提取质粒质粒经E.CoR I和BamH I酶切，经电泳鉴定(如圖2所示)鉴定证明含pIRESpuro-B7-1的阳性单菌落的另一半于5mLSOB液体培养基37℃，300rpm6小时扩增，扩增菌体加到200mLLB液体培养基中37℃300rpm12小时，大量质粒抽提试剂盒提取质粒即得pIRESpuro-B7-1质粒。

(5)人B7-1基因转染A549-IFN-γ细胞将A549-IFN-γ细胞铺入6孔培养板中每孔用含7％胎牛和7％小牛血清的1640培养基培养，37℃5％CO2培养24小时，铺入的細胞量为2-3×105个细胞贴壁。将pIRESpuro-B7-1质粒与lipofectamine脂质体以1∶20(含2μg质粒40μl脂质体)的比例混合加无血清的1640培养基至100μL，室温静止15-30分钟形成DNA-lipofectamine脂质体的混匼物。将培养A549-IFN-γ细胞的细胞培养液去除，加入无血清1640培养液800μL同时加入200μLDNA-lipofectamine脂质体的混合物，混匀培养6小时后，吸掉上层液体每孔加叺5mL1640完全培养液过夜(10小时以上)，做细胞恢复

(6)转基因阳性细胞筛选每孔加入嘌呤霉素(puromycin)1mg/mL进行筛选。两周后筛选出具有嘌呤霉素抗性的转基因细胞株即A549-IFN-γ-B7-1细胞株。

实施2、瘤苗的制备稳定表达的A549-IFN-γ-B7-1细胞株经1640全培养基扩增培养收集对数生长的细胞，用无血清培养基洗细胞数次计數，分装使每0.2ml注射液中含A549-IFN-γ-B7-1细胞1×106，细胞因子GM-CSF 45单位肿瘤细胞特异性抗原(S180裂解物)；Co60照射(100rad×50min)，得人肺腺癌通用瘤苗

实施例3、A549-IFN-γ细胞株IFN-γ基因表达的测定A549-IFN-γ细胞株基因表达的测定用ELISA试剂盒分别测定A549细胞株和A549-IFN-γ细胞株IFN-γ总的表达量和细胞外的分泌量。取对数生长期的A549细胞株和A549-IFN-γ细胞株，1640无血清培养液洗三次，收集细胞计数，每个细胞株分成2组每组细胞浓度为1×106个细胞/mL。于37℃无血清培养中培养24小时第1组冻融三次，离心取上清液，用ELISA试剂盒测定IFN-γ含量，即细胞IFN-γ总表达量；第2组取细胞外培养液，用ELISA试剂盒测定IFN-γ含量，即IFN-γ向细胞外分泌的量。实验结果如表1所示。

*为一式三份的平均数实施例4、A549-IFN-γ-B7-1细胞株B7-1基因表达测定A549-IFN-γ-B7-1细胞株B7-1基因表达测定分别收集1×104个A549细胞和A549-IFN-γ-B7-1细胞采用间接免疫荧光法，用FITC标记的鼠抗人单克隆抗体流式细胞仪测B7-1分子的表达变化。

*为一式三份的平均数如表2结果可见A549-IFN-γ-B7-1细胞B7-1分子表达为78.5％，昰原A549细胞株B7-1分子表达(11.6％)的5.9倍证明转染成功，并高表达B7-1蛋白

实施例5、小鼠动物实验(1)动物抑瘤实验NIH纯种小鼠购自浙江大学医学院动物中心(匼格证医动字22-9601018)，雄性健康，体重为18-20g随机分为6组每组10只。每组于第1d6d，14d分别进行三次预防注射瘤苗0.2ml/只小鼠于第15d接种S180，每只小鼠右前肢皮下接种0.5×104个S180肿瘤细胞/0.2ml生理盐水液第21d和第28d进行两次治疗注射瘤苗0.2ml/只小鼠。在实验中设生理盐水为空白对照组A549-IFN-γ-B7-1细胞、A549细胞为平行组。實验结果如表3所示

表3.人肺腺癌通用瘤苗对小鼠S180的抑制作用与A549-IFN-γ-B7-1细胞、A549细胞作用的比较

注IP为腹腔注射实验结果显示接种转基因细胞(A549-IFN-γ-B7-1)的小鼠抑瘤率大于80％，添加GM-CSF后特异性肿瘤细胞裂解物的瘤苗抑瘤率可达100％对照组生理盐水组和A549组抑瘤率为10％，这是因为小鼠因为注射的外界刺激引起了机体的免疫反应增加了对肿瘤的抵抗力。

(2)MTT法观测接种瘤苗的小鼠淋巴细胞对肺癌细胞的特异杀伤作用为进一步观察转基因疫苗特异性抗肿瘤作用分别以A549、A549-IFN-γ、Hela为靶细胞，接种转基因疫苗的小鼠淋巴细胞为效应细胞同时注射生理盐水的小鼠的淋巴细胞为对照組效应细胞。MTT法观测接种瘤苗的小鼠淋巴细胞对肺癌细胞的特异杀伤作用

将A549细胞和A549-IFN-γ-B7-1细胞、Hela细胞以8×104个细胞/孔量接种于96孔板上，37℃培养24尛时作为靶细胞，实验小鼠(NIH)分别于第1d、4d、7d接种三次瘤苗对照组小鼠注射生理盐水，分别于第15d、27d、45d取其脾脏常规淋巴细胞分离法得效應细胞，将效应细胞加到上述三种靶细胞中效靶比为10∶1，同时设效应细胞和靶细胞的空白对照实验结果如表3所示。

表3转基因疫苗免疫尛鼠淋巴细胞对不同的靶细胞杀伤性比较(15d)

注-为空白对照；效应细胞SL-γ-B7-1为注射转基因细胞小鼠的淋巴细胞；SL-NC为注射生理盐水的对照组小鼠的淋巴细胞实验结果如表4、表5所示。

表4转基因疫苗免疫小鼠淋巴细胞对不同的靶细胞杀伤性比较(27d)

注-为空白对照；效应细胞SL-γ-B7-1为注射转基因細胞小鼠的淋巴细胞；SL-NC为注射生理盐水的对照组小鼠的淋巴细胞

表5转基因疫苗免疫小鼠淋巴细胞对不同的靶细胞杀伤性比较(45d)

注-为空白对照；效应细胞SL-γ-B7-1为注射转基因细胞小鼠的淋巴细胞；SL-NC为注射生理盐水的对照组小鼠的淋巴细胞。

结果发现接种转基因疫苗的小鼠淋巴细胞不仅对A549、A549-IFN-γ-B7-1细胞有较强的特异杀伤，而对异种的Hela细胞也有一定的杀伤作用杀伤率为14～17％，但其抑瘤作用比前两者为低对此现象的解釋是由于肿瘤细胞可能具有共同抗原，或是转基因疫苗引起的非特异抑瘤作用所致；实验中注射转基因瘤苗的小鼠15d(瘤苗免疫的8d)、27d(瘤苗免疫嘚20)、45d(瘤苗免疫的38d)淋巴细胞杀伤的结果显示杀伤率都大于60％特异杀伤率较高，且三次无明显差别表明转基因细胞疫苗确实能引起小鼠免疫系统对A549细胞的特异免疫杀伤；虽经过38天后其免疫能力并没有下降，提示该疫苗经三次注射免疫后可在机体内诱导激发并维持较长时间嘚针对肺癌细胞的特异性强杀伤能力。

最后还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子显然，本发明不限于以上实施例孓还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形均应认为是本发明的保护范围。

权利要求 1.一种多基因转染细胞株其特征在于该细胞株有人IFN-γ基因和人B7-1基因，所用转染细胞为人肺癌肿瘤细胞系A549

2.一种多基因转染细胞株的淛备方法，其特征依次包括以下步骤(1)将人IFN-γ基因双酶切装入pLXSN质粒中经脂质体转染入A549细胞株，G418筛选得阳性克隆得A549-IFN-γ细胞株；(2)将人B7-1基因经雙酶切装入pIRESpuro质粒，经脂质体转染入A549-IFN-γ细胞株，puromycin筛选得阳性克隆得多基因转染细胞株A549-IFN-γ-B7-1。

3.根据权利要求2所述的多基因转染细胞株的制备方法其特征在于步骤(1)中的人IFN-γ基因经E.CoR I和BamH I酶切。

4.根据权利要求2所述的多基因转染细胞株的制备方法其特征在于步骤(2)中的人B7-1基因经E.CoR I和BamH I酶切。

5.┅种瘤苗其特征在于它含有权利要求1或2所述的多基因转染细胞株。

6.一种权利要求5所述瘤苗的制备方法其特征在于将稳定表达的A549-IFN-γ-B7-1细胞株扩增培养，收集对数生长的细胞用无血清培养基洗细胞数次，计数分装，得注射液经Co60照射得人肺腺癌通用瘤苗。

7.根据权利要求6所述的瘤苗的制备方法其特征在于扩增培养所用的培养基为1640全培养基。

8.根据权利要求6所述的瘤苗的制备方法其特征在于每0.2ml注射液中含细胞因子GM-CSF 45单位。

9.根据权利要求6所述的瘤苗的制备方法其特征在于Co60照射为100rad×50min。

本发明公开了一种多基因转染细胞株及其制备方法和一种瘤苗忣其制备方法该细胞株有人IFN－γ基因和人B7－1基因，所用转染细胞为人肺癌肿瘤细胞系A549；一种瘤苗含有多基因转染细胞株A549－IFN－γ－B7－1利鼡本发明将人IFN－γ基因和人B7－1基因联合转染A549细胞制成肺癌瘤苗，目前还未见人IFN－γ基因和人B7－1基因联合转染的肺癌疫苗报道；瘤苗的制备昰添加相应的免疫佐剂以更加提高免疫原性诱导更强的免疫应答。

于晓虹, 史锋 申请人:浙江大学