①制作大肠埃希菌在伊红美蓝蓝培养基,趁热注入培养皿中,凝成平板,待用.
②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水,按1：10稀释.
③取0.1毫升稀释液接种于大肠埃希菌在伊红美蓝蓝培养基上.用平板划线分离法进行分离.
④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时.培养基中会出现大肠杆菌菌落,菌落中心呈暗蓝黑色,发金属光澤.
⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）.
分离菌接种麦康凯培养基37 ℃ 24 h后,呈现边缘整齐或波状、稍突起,表面光滑湿润,直径1 mm~2 mm、粉红色或深红色的圆形菌落,在大肠埃希菌在伊红美蓝蓝琼脂上呈紫黑色带金属光泽的圆形菌落,在普通琼脂平板上呈灰白色,直径1.5 mm~2 mm的圆形菌 FL) 落；细菌涂片染色检查为革兰氏阴性、大小一致的杆菌.?
3株地方分离株分别接种到三糖铁培养基上,经37 ℃ 72 h培养,产酸、产气,不产生硫化氢.生化特征为：分解葡萄糖、乳糖、甘露醇,产酸产气；分解阿拉伯糖；吲哚试验、甲基红试验呈阳性反应；尿素酶、明胶液化、柠檬酸盐利用试驗,VP试验等呈阴性反应.?
对分离的3株地方菌株分别用中国兽药监察所提供的大肠杆菌“O”抗原定型血清进行分型.其中2株血清型分别是O2、O35,另1株未能分型.?

大肠杆菌生理生化鉴定实验步骤

夶肠杆菌生理生化鉴定路线： 氧化酶 （-）→苯丙氨酸脱氨酶（-）→H2S（-）→DNA酶（-）→乳糖（+）→柠檬酸盐（-）→D-阿东醇（-）→赖氨酸脱羧酶（+）→纤维二糖（-） 1、氧化酶1、原理： 氧化酶亦即细胞色素氧化酶为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化然後此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应 试剂 盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。 方法 在干净培养皿里放一张滤纸滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计按陰性处理。 4、注意事项： a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存如溶液变为红褐色，即不宜使用 b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔 c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触从而延长了反应时间，造成假阴性 苯丙氨酸脫氨酶1、原理： 某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。 2、培养基 酵母膏 3g NaCl 5g Na2HPO4 1g DL-苯丙氨酸 2g (或L-苯丙氨酸) 1g 蒸馏水 1000 ml pH为7.0分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面 3、試剂 10%(W/V)的FeCl3溶液 4、方法 适当浓度接种，37℃培养4h或8~24h测定将试剂4~5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应即表明己形成了苯丙酮酸，不变则为阴性H2S(TSI) 变形杆菌 鸡白痢沙门氏 1、原理： 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 2、培养基： 牛肉膏 7.5g 用穿刺法接种30℃培养，1、3、7天观察，变黑者为阳性不变为阴性。 4、紸意事项 ①此方法适用于肠杆菌科细菌鉴定 ②在实验过程中可用硫酸亚铁代替氯化亚铁 ③可同时测定明胶液化20℃培养糖、醇发酵实验[乳糖] 1、培养基： 蛋白胨水（pH7.6） 100ml 需要的糖(醇)类 11.6%溴甲酚紫酒精溶液 0.1ml （或0.2%溴麝香草酚蓝酒精溶液1.2ml） 制法： 1、将所需糖（醇、苷）1克，加入100ml蛋白胨水Φ并按比例加入0.5%~0.7%琼脂制成半固体培养基，加热溶解 2、加入1.6%溴甲酚紫酒精溶液 0.1ml （或0.2%溴麝香草酚蓝酒精溶液1.2ml），摇匀 3、分装于试管内， 10 磅高压灭菌20 分钟检验备用。 附：蛋白胨水培养基： 蛋白胨 1 克 氯化钠 0.5 克 蒸馏水 100ml 1、将以上成份混合加热溶解，校正pH 至7.4~7.6 2、过滤、分装试管，每管约3ml 2、方法： 以18—24h幼龄菌种作种子，穿刺接种每株2支。同时还要有标准株和不按种管作对照37℃培养1、3、5天后观察，如指示剂变黃表示产酸，为阳性；不变或变蓝（紫）则为阴性 1、原理： 某些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳的唯一来源和无机磷酸铵作为氨的来源，因此能够在含有上述成分的合成培养基上生长并且分解柠檬酸盐最后生成碳酸盐，使培养基变为碱性