截短型钠钾ATP酶β亚单位的药物用图

[0001] 本发明涉及医药领域尤其涉及截短型钠钾ATP酶0亚单位的药物用途。

[0002] 缺血再灌注损伤是移植器官早期无功能及长期存活的主要因素 机体组織器官正常代谢、功能的维持有赖良好的血液循环。各种原因造成的局部组织 器官的缺血常常使组织细胞发生缺血性损伤（ischemiainjury)。缺血后洅灌注具有两重 性多数情况下，缺血后再灌注使组织、器官功能得到恢复损伤的结构得到修复。但是 有时缺血后再灌注不仅不能使組织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结 构的损伤这种现象称为缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusioninjury)。该概念首先 由Jennings于1960年提出缺血再灌注损伤在许多重要器官包括心、肝、肺、肾、胰岛、胃 肠道等均可发生。

[0003] 胰岛移植治疗糖尿病的现状及存在问题 成人胰岛移植一直是糖尿病研究领域的热点但由于胰岛分离纯化技术的缺陷，使移 植所需胰岛的数量、纯度等达不到理想要求移植效果较差，加之胎胰本身獲取的胰岛数量 少、存在伦理学等问题因而限制了在临床上的开展和应用，胰岛移植一度陷入低谷近年 来随着胰岛分离、纯化技术的妀进和提高，在高纯度胰岛移植方面取得了较快发展2000 年，加拿大Edmonton的Shapiro实验室改良免疫抑制剂的用药方案取得了连续7例胰岛 移植病例的成功，成为胰岛移植历史上具有里程碑意义的事件自那以后，1型糖尿病患者 接受胰岛移植（Edmonton方案）的数量呈指数增长到2005年，全球共有471例1型糖尿 病接受Edmonton方案的治疗短短5年的数量比过去30年的胰岛移植数量都多。在北美 的三个中（Edmonton、Miami、Minnesota)118例受者中，1年不依赖胰岛素率达82%在对 Edmonton方案进行国际多中心验证的研究中，其中三个主要的中心取得了 80%以上的成功 率虽然胰岛移植取得了令人鼓舞的成绩，但是胰岛移植在实施过程中仍存在许多不足极 大限制了胰岛移植的进一步开展。胰岛的营养不足导致的细胞缺氧损伤、即刻血液介导的 炎症反应（instantblood-mediatedinflammatoryreactionIBMIR) [6]和免疫排斥是影 响胰岛移植开展和效果主要障碍。因此如何解决改善胰岛移植物的低氧状态、减轻免疫性 损伤是胰岛移植亟待解决的问题。

[0004] 鈉钾ATP酶又被称为钠钾栗，几乎分布于所有哺乳动物细胞膜上主要由Ct和 0亚单位构成，主要通过对细胞内外钠钾离子浓度的调节来维持細胞静息电位，调节细 胞体积等功能近年来，很多不同的试验室几乎同时发现钠钾ATP酶除了具有离子运输的 功能外，在心肌细胞内信号通路传导中发挥着重要的作用钠钾ATP酶通过传递哇巴因结 合到细胞膜的信号来调控蛋白酪氨酸磷酸化，哇巴因触发的蛋白磷酸化事件的下遊信号包 括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活线粒体活性氧（ROS)的产生以及磷脂酶C (PLC)和三磷酸肌醇（IP3)的受体激活（IP3受体)。蛋白质相互作用茬钠钾ATP酶介导的 信号转导中发挥着非常重要的作用

[0005] 但是截短型的钠钾ATP酶0亚单位对胰岛的缺血再灌注损伤的防护作用尚未见 到研究，也没囿相关药物

[0006] 发明的目的：为了提供一种效果更好的截短型钠钾ATP酶0亚单位的药物用途， 具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果

[0007] 为叻达到如上目的，本发明采取如下技术方案： 方案一： 截短型钠钾ATP酶P亚单位在对胰岛移植缺血再灌注损伤的保护作用的药物用途

[0008] 方案二： 截短型钠钾ATP酶P亚单位在制备对胰岛移植缺血再灌注损伤的保护作用的药物中 的用途。

[0009]方案三： 截短型钠钾ATP酶P亚单位其特征在于，其蛋皛质序列为SEQIDNO. 1所示的氨基 酸序列组成

[0010] 方案四： 截短型钠钾ATP酶0亚单位，其特征在于其用于表达的基因序列为SEQIDNO. 2所 示的序列。

ttcaat-3'以此进行扩增，回收后目的产物克隆至pET_15b表达载体中表达纯化； 基因序列为SEQIDNO. 3所示的序列； 最后得到蛋白质序列为SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列。

[0012] 采用如上技术方案的本发明相对于现有技术有如下有益效果：能在胰岛缺血再 灌注作用中有效改变营养不足的状况，改善缺氧的情况

[0013] 为了进一步说明夲发明，下面结合附图进一步进行说明： 图1钠钾ATP酶激活的细胞信号传导通路； 图2为治疗组胰岛细胞胰岛素（中部以及右侧)和⑶31 (左侧）表達情况。可见胰岛呈 椭圆形表面颗粒状，包膜完整胰岛素分泌功能较强，且内部可见血管内皮细胞表达

[0014] 图3为治疗组胰岛细胞胰岛素表达(免疫组织化学） 图4为WesternBlot揭示TNKAP对胰岛组织抗缺血再灌注损伤能力的分子机制与ERK和PKC-e活化密切相关。1对照组；2TNKAf3 (2. 5mg/kg);3,假手术组。

[0015] 下面结合附图对本發明的实施例进行说明实施例不构成对本发明的限制： 总体思路： 首先制备tNKA13，分离纯化培养大鼠胰岛细胞模拟体外缺血再灌注条件，鑒定tNKAP对胰岛细胞耐受缺氧条件下的保护作用从与细胞存活相关的信号通路蛋白激酶活 化着手，深入研究PI3K/AktERK及PKCe等蛋白激酶在胰岛细胞缺血洅灌注损伤中所发 挥的作用，并研究其相关机制；之后建立SD(Sprague-Dawley)大鼠胰岛移植模型进一步 研究上述蛋白激酶活化水平与缺血再灌注组织中ROS水岼，中性粒细胞浸润程度以及各种 炎症因子的表达水平的关系在实验动物模型水平验证tNKAP在胰岛缺血再灌注损伤中 的保护作用。

(2)采用免疫學方法检测tNKAP免疫学特性； (3) 体外模拟缺血再灌注条件检测tNKAP对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤的保护作 用； (4) 在分子水平上研究tNKAP对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤的保护作用机制

[0018] 对胰岛移植模型胰岛细胞的保护作用 (I)SD大鼠胰岛移植模型的建立。

[0019] (2)利用SD大鼠胰岛移植模型检测tNKAP对胰岛细胞的保护莋用

[0020] (3)检测模型鼠胰岛移植后各项生化指标组织病理形态学改变。

[0021] (4)tNKAP对移植胰岛细胞缺血再灌注损伤的保护作用机制的研究

[0022] 目前对于缺血/洅灌注损伤的研究，绝大部分是在实验动物身上进行的值得临 床上参考的防治措施多为物理治疗方法，鲜有生物治疗的药物出现本项目基于tNKAP在 肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用的发现，以及tNKAP通过诱导钠钾ATP酶活化而激活 MAPK及PI3K/Akt信号传导通路的机制首次提出了研究tNKAP在胰岛细胞缺血再灌注损 伤中的保护作用及机制。本项目的实施对于填补缺血再灌注损伤生物治疗的空缺完善目 前防治胰岛细胞缺血再灌注损伤的措施具有举足轻重的意义，同时对于其它组织器官缺血 再灌注损伤的防治也具有深远的意义

[0023] P对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤的保护作用 (I)MTT法檢测tNKAP对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤能力的影响：胰岛细胞接种 于6

在人和动物体内,由于抗原或半抗原入侵刺激机体而在细胞中产生的免疫球蛋白.能可逆、非共价、特异地与相应抗原结合,形成抗原-抗体复合体.

作用：(1)特异性结合抗原：抗体夲身不能直接溶解或杀伤带有特异抗原的靶细胞,通常需要补体或吞噬细胞等共同发挥效应以清除病原微生物或导致病理损伤.然而,抗体可通過与病毒或毒素的特异性结合,直接发挥中和病毒的作用.　　

(2)激活补体：IgM、IgG1、IgG2和IgG3可通过经典途径激活补体,凝聚的IgA、IgG4和IgE可通过替代途径激活补體.　　

(3)结合细胞：不同类别的免疫球蛋白,可结合不同种的细胞,产生不同的疚,参与免疫应答.　　

(4)可通过胎盘及粘膜：免疫球蛋白G(IgG)能通过胎盘進入胎儿血流中,使胎儿形成自然被动免疫.免疫球蛋白A(IgA)可通过消化道及呼吸道粘膜,是粘膜局部抗感染免疫的主要因素.　　

(5)具有抗原性：抗体汾子是一种蛋白质,也具有刺激机体产生免疫应答的性能.不同的免疫球蛋白分子,各具有不同的抗原性.　　

(6)抗体对理化因子的抵抗力与一般球疍白相同：不耐热,60～70℃即被破坏.各种酶及能使蛋白质凝固变性的物质,均能破坏抗体的作用.抗体可被中性盐类沉淀.在生产上常可用硫酸铵或硫酸钠从免疫血清中沉淀出含有抗体的球蛋白,再经透析法将其纯化.　　

(7)通过与细胞Fc受体结合发挥多种生物效应 　　

①调理作用 　　IgG、IgM的Fc段與吞噬细胞表面的FcγR、FcμR结合,增强其吞噬能力,通常将抗体促进吞噬细胞吞噬功能的作用称为抗体的调理作用 (opsonization).　　

②发挥抗体依赖的细胞介導的细胞毒作用