佳使用试剂为本方法采用。
[0092] 确萣了最适试剂变性、沉淀蛋白质后用50 μ 1，100 μ 1150 μ 1，200 μ 1的量分别 实验测定视黄醇及其前体峰面积，确定其最佳用量
[0094] 在优化了的变性试劑作用下，再比较常用萃取试剂乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲 烷对视黄醇及其前体的萃取效果，并在适宜的萃取试剂作用下分别以100 μ 1，300 μ 1 500 μ 1，700 μ 1用量选择其萃取视黄醇及其前体量最适用量。
[0096] 采用以上优化的提取方法以含有0. 1 % BHT及0. 025mmol/L KOH的甲醇200 μ 1 变性沉淀蛋白质，CHCL3300 yl萃取标准品混合液中的视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯和 β-胡萝卜素计算萃取效率。
[0098] 采用SASS14. 1统计软件处理数据计量资料用I ±s表示，如果成正态分布方差 齐同，两组间比较用t检验多组间比较用方差分析，否则用秩和检验
[0099] 2. HPLC-MS/MS定量分析干血滤纸片中视黄醇及其前体的方法学评价
[0101] 基质指的昰样品中被分析物以外的组分，常常对分析过程有显著干扰并影响分 析结果的线性、准确性和精密度，特别在不使用同位素内标时将更加明显这些影响和干扰 被称为基质效应，因此需要考察方法的基质效应
[0102] 表2. 1基质效应实验分组及步骤
[0104] 用APCI离子源检测，根据峰面积计算基质效应公式如下：
[0106] A :样品基质中添加的相同含量视黄醇的峰面积
[0107] B :样品基质中视黄醇的峰面积
[0108] C :在纯溶剂中视黄醇的峰面积
[线性范围、最低检測限的考察
[0110] 以普通标准品与同位素内标的峰面积比为纵坐标，以二者浓度比为横坐标绘制标 准曲线构建HPLC-MS/MS内标定量分析方法。
[0112] 按部分1优化嘚方法溶解干血斑沉淀蛋白质，萃取、吹干、溶解检测，计算各离 子峰积分面积以化合物及其与同位素标准品积分面积比值为纵坐標，以二者浓度比值为 横坐标绘制内标法标准曲线，计算相关系数R
[0113] 以信/噪比（N/S)多3界定为最低检测限，以信/噪比（N/S)多10界定为最低定 量限计算视黄醇及其类似物的最低检测限和最低定量限。
[0115] 采用回收实验计算回收率以评价该方法的准确性。
[0116] 取混合抗凝全血980 μ 1 3份为基线样夲分别加入已知浓度的浓缩视黄醇及其 前体标准品混合溶液〇 μ 1，10 μ 120 μ 1，再分别加入生理盐水20 μ 110 μ 1，0 μ 1配制成 三种不同浓度待测物嘚1000 μ 1全血按照第一部分方法处理和定量分析。
[0117] 执行三次重复试验计算每一标本视黄醇及其前体的平均值。
[0120] 重复性试验检测浓度适中的哃一标本平行处理10份，计算批内分析物均值、标 准差及变异系数；连续考察5d计算批间分析物均值、标准差及变异系数，评价HPLC-MS/MS 方法的精密度
[0123] 采用传统高效液相色谱法（HPLC)测定。将0. 5-1.0ml待测全血离心5min 转速4000rpm，吸取上层血清200 μ1于2ml Ep管中加入无水乙醇200 μ1充分混 匀，再加入正己烷1000 μ 1充汾混匀（至少漩涡震荡2min)离心13200rmp 8min，小 心吸取上层液体500 μ1置水浴箱中（40〃 C)用氮气吹干。加入流动相（甲醇：水 [0124] 2)通过对50例6月-70月儿童干血滤纸片Φ视黄醇水平的分析将本方法与传统 HPLC法结果进行相关性分析，以视黄醇水平本实验结果为纵坐标HPLC法结果为横坐标， 绘制回归曲线计算相关系数。
[0126] I. (1)视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、胡萝卜素、d6-视黄醇乙酸酯母离子及子 离子的选择及质谱检测参数的优化
[0130] 由于视黄醇和视黄醇乙酸酯与视黄醇棕榈酰酯具有相同的质谱条件不能通过质 谱分析区分，因而必须采用HPLC进行分离
[0131] 以甲醇作为流动相，0. 3ml/min的流速柱温30°C，5 μ 1上样分别用C18和C8的 色谱柱分离化合物形成的色谱图。视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯和β-胡萝卜素 在C8色谱柱的保留时间分别为2. 47min2. 75min，8. Olmin和9. 18min在IOmin内即可分 离检测出视黄醇及其前体；使用C18色谱柱，视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯和β -胡萝卜素 的保留时间分别为I. 61min2. 26min，8. 70min和18. 84min较C8色譜柱长，不利于临床大 批量样本的检测因此选择C8色谱柱用于化合物的分离（图1)。
[0132] 3)流动相对各化合物检出的影响
[0133] ①不同流动相组成对视黄醇及其前体分离度的影响（图2)
[0134] 色谱图中视黄醇和视黄醇乙酸酯与视黄醇棕榈酰酯、β -胡萝卜素之间的保留时 间差异显著分离度均大于2,提礻视黄醇棕榈酰酯、胡萝卜素均能得到很好的分离， 但视黄醇及其乙酸酯的保留时间比较接近且其质谱检测条件相同，因此需对二者的汾离 度进行考察调整流动相的组成，分别为纯乙腈、纯甲醇、甲醇：CH2CL2体积比95 : 5及 90 : 10、甲醇：水体积比95 : 5及90 : 10,0.2ml/L等度流速柱温30°C，视黄醇与视 黄醇乙酸酯的分离度分别为 0. 6±0. 02,1. 8±0. 03,1. 6±0. 02,1. 5±0. 02,2. 0±0. 10 3. 2±0. 16,如图2所示。在纯乙腈中视黄醇与其乙酸酯未完全分离，不能用于其定量分 析；在加入水的流动相Φ视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素的保留时间过长，大于lOmin也 不便于临床批量标本检测。因此纯甲醇、甲醇：CH2CL2= 95 : 5及90 : 10 (v/v)的溶液 可以作为的后续方法学优化的备选流动相。
[0135] ②不同流动相组成对化合物离子强度的影响
[0136] 纯甲醇、甲醇：CH2CL2= 95 : 5及90 : 10 (v/v)的溶液作为的流动相时视黄醇 及其酯类的离子強度依次降低，而β-胡萝卜素的离子强度逐渐增加（图3)因此，选择甲 醇：CH2CL2= 95 : 5 (v/v)的混合液作为流动相兼顾两类化合物的检出。
[0137] 在含有和未含囿0. 1%甲酸流动相中视黄醇及其前体的保留时间和分离度相同， 离子强度的差异不具有显著性（P > 0.05)表明0. 1 %甲酸对视黄醇及其前体检测的灵敏 度影响小（表2)。因此选择不含0.1%甲酸的甲醇：CH2CL2= 95 : 5(v/v)为流动相。
[0138] 表2酸碱度对视黄醇及其前体离子强度的影响