定量两种mirna靶基因预测网站是要提取两次还是提取一次分装

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血浆miRNA快速制备方法建立和优化,血浆制备,血浆的制备,富血小板血浆制备,小鼠血浆制备,富血小板血浆的制备,mirna,mirnabase,mirna引物设计,mirna数据库
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血浆miRNA快速制备方法建立和优化
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即送15丁当
【技术答疑】miRNA技术答疑进行时
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af203 楼主好,想咨询两个问题。我已做完芯片筛选,下一步向做microRNA功能验证,正在培养一半贴壁细胞。想做瞬时转染,订购了mimics和inhibitors。现在关于转染试剂比较纠结,这个细胞做的人不多,又属于半贴壁细胞,到底是用lipo2000还是罗氏转染试剂,能给推荐一款吗?谢谢。坦率讲,lipofectin2000和专用转染试剂多数情况差异并不是很大。至于推荐试剂,因为不了解,所以不敢妄言。请根据自身实际情况选择。
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老师你好,请问在那些靶标预测软件上通常有几个分值,有正的负的,想请老师讲下它们的意义呢?
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你好!我也是做miRNA方面的,在做荧光素酶分析的时候,有的人将靶基因3‘UTR的mutant作为control,但是有的用negative control。这两种都是用作control,这两种有什么区别吗?做的时候难度有区别吗?
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小香菜 老师你好,请问在那些靶标预测软件上通常有几个分值,有正的负的,想请老师讲下它们的意义呢?通常靶标预测软件是通过一系列计算,而后对mRNA进行打分。不同的预测软件有不同的打分方法和选择阈值,从而进行靶mRNA判断。例如miRanda 取score &=500作为阈值,而 Pita取score &=-10作为阈值。也就是说,在用miRanda软件预测时,打分大于500的mRNA被选择,分数越大,说明该mRNA是被预测miRNA的靶基因的可能性越大;而Pita则是取打分低于-10的mRNA,分值越小,则该mRNA是被预测miRNA的靶基因的可能性越大。
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你好,我想从血浆提取总RNA,然后对里面的microRNA进行定量检测,请教一下提取RNA的方法,以及用什么试剂盒比较好。谢谢!
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ziyue1 你好!我也是做miRNA方面的,在做荧光素酶分析的时候,有的人将靶基因3‘UTR的mutant作为control,但是有的用negative control。这两种都是用作control,这两种有什么区别吗?做的时候难度有区别吗?这两种做法都可以,但前一种方法更严格,在机理研究中更有意义,用哪一种,就看研究的具体需要了。荧光素酶分析的实验本身两者没有太大区别,序列才是关键。
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mirror122 你好,我想从血浆提取总RNA,然后对里面的microRNA进行定量检测,请教一下提取RNA的方法,以及用什么试剂盒比较好。谢谢!我们公司用的是Ambion的试剂盒,结果还不错。具体方法按照protocol进行就好了。
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构建miRNA质粒是选取miRNA的前体序列就可以,还是把mRNA上miRNA区域的一大段序列克隆出来,再连到载体?
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上海欧易 如果您想通过qPCR来验证,应该提取总RNA。miRNA的qPCR检测,无论加尾法还是茎环法,都需要提取总RNA然后反转录。对于micRNA的qPCR检测,提取“小RNA”反转后检测不是更好?
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wly666 构建miRNA质粒是选取miRNA的前体序列就可以,还是把mRNA上miRNA区域的一大段序列克隆出来,再连到载体?通常miRNA克隆包含茎环以及上下游序列,上下游序列长度选多少和载体有关,例如前面网友用pMXs-miR-GFP-Puro 逆病毒载体,就是茎环+上下游100bp。
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amylbl 对于micRNA的qPCR检测,提取“小RNA”反转后检测不是更好?总RNA完全可以做模板,为何要提取小RNA?
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amylbl 对于micRNA的qPCR检测,提取“小RNA”反转后检测不是更我们提取的总RNA,取1ug进行反转录已足以。
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ziyue1 你好!我也是做miRNA方面的,在做荧光素酶分析的时候,有的人将靶基因3‘UTR的mutant作为control,但是有的用negative control。这两种都是用作control,这两种有什么区别吗?做的时候难度有区别吗?我们用的是negative control,然后把野生的和突变的都做上。首先分析野生型比negative control是否有所降低,然后再分析突变后是否获得相反的结果。这样应该是比较好的结果。
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上海欧易 通常miRNA克隆包含茎环以及上下游序列,上下游序列长度选多少和载体有关,例如前面网友用pMXs-miR-GFP-Puro 逆病毒载体,就是茎环+上下游100bp。楼主能够将常用的用于构建miRNA的载体在构建时除了茎环结构之外还需要多少bp总结一下呢?我这一直也很纳闷,因为有一个熟人他们用的是pcDNA3载体,就随便选的。
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你好!我做miRNA,最近做real time PCR结果不好,我用的是试剂盒,引物是生工的,用的是deta deta CT的计算方法。是不是CT值大于30就不能用啊?我反复做,试着把模板浓度增加,但是结果还是不好。而且之前用的引物浓度,阴性对照(就是加了除模板以外的试剂)总能有CT值,大概36、37、38有时候39,请问您这样的阴性对照出结果的可不可以用啊?发文章的话有什么影响嘛?后来我试着将循环数减少到35(之前是40个循环),阴性对照是没有CT值了,但是目的基因也出不了CT值了。到底阴性对照那样的CT值(36、37、38、39)可不可以接受啊?期待楼主的回答。谢谢!
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sunyaru 你好!我做miRNA,最近做real time PCR结果不好,我用的是试剂盒,引物是生工的,用的是deta deta CT的计算方法。是不是CT值大于30就不能用啊?我反复做,试着把模板浓度增加,但是结果还是不好。而且之前用的引物浓度,阴性对照(就是加了除模板以外的试剂)总能有CT值,大概36、37、38有时候39,请问您这样的阴性对照出结果的可不可以用啊?发文章的话有什么影响嘛?后来我试着将循环数减少到35(之前是40个循环),阴性对照是没有CT值了,但是目的基因也出不了CT值了。到底阴性对照那样的CT值(36、37、38、39)可不可以接受啊?期待楼主的回答。谢谢!您好!我一般做的内参10-15循环,目的基因20个循环。不知道你反转录时有没有问题,可以加大反转录时RNA的含量。不知道你的溶解曲线怎么样呀?
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qijianniheihei 您好!我一般做的内参10-15循环,目的基因20个循环。不知道你反转录时有没有问题,可以加大反转录时RNA的含量。不知道你的溶解曲线怎么样呀?反转录是用试剂盒做的,说明书上写RNA量&1微克。real time PCR的试剂盒上是要求35到40个循环的。内参和目的基因是一样的。想问下,40个循环时阴性对照那样35、36、37、39的CT值可不可以接受?还是必须测不出才可以?发文章有影响嘛?还有目的基因的CT值是不是必须要&30呢?谢谢!
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请教楼主:已知某miRNA在肿瘤中高甲基化,能否通过芯片或其他技术找到使其高甲基化的调控因子?谢谢!
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sunyaru 你好!我做miRNA,最近做real time PCR结果不好,我用的是试剂盒,引物是生工的,用的是deta deta CT的计算方法。是不是CT值大于30就不能用啊?我反复做,试着把模板浓度增加,但是结果还是不好。而且之前用的引物浓度,阴性对照(就是加了除模板以外的试剂)总能有CT值,大概36、37、38有时候39,请问您这样的阴性对照出结果的可不可以用啊?发文章的话有什么影响嘛?后来我试着将循环数减少到35(之前是40个循环),阴性对照是没有CT值了,但是目的基因也出不了CT值了。到底阴性对照那样的CT值(36、37、38、39)可不可以接受啊?期待楼主的回答。谢谢!我以前做遇到过这种问题,目标基因和阴性对照的溶解曲线一个位置,阴性对照应该是被污染了,后来我们换了个新的,没有出现过了。还有你的目标基因的ct值很大,即使加大反转录,也还是效果不好,你要看看你的mir在你的样品是否高表达,文献怎么说的,可能本身就很低,扩出来就ct很大了,个人意见仅供参考,如果问题解决了希望共同交流。
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小香菜 我以前做遇到过这种问题,目标基因和阴性对照的溶解曲线一个位置,阴性对照应该是被污染了,后来我们换了个新的,没有出现过了。还有你的目标基因的ct值很大,即使加大反转录,也还是效果不好,你要看看你的mir在你的样品是否高表达,文献怎么说的,可能本身就很低,扩出来就ct很大了,个人意见仅供参考,如果问题解决了希望共同交流。预期应该是高表达的。那请问您阴性对照被污染是什么意思?是试剂被污染了吗?我做的96孔板的应该没有问题。如果是体系被污染了,那为什么目的基因和内参没有什么影响啊?还有就是想问阴性对照必须没有CT值吗?还是说CT值在36以上都可以接受?
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你好,我想请教两个问题:1、提取microRNA再反转录成cDNA,在Real-time PCR中选择相对定量方法,制作标准曲线时,是用cDNA梯度稀释还是反转录前的microRNA进行梯度稀释?哪个效果会比较好?2、我想减少反转录产生的差异,是将每个microRNA反转录三次然后混合做定量,还是将三次反转录的产物分别做定量呢?谢谢!
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四叶草琳 edited on
qijianniheihei 我们用的是negative control,然后把野生的和突变的都做上。首先分析野生型比negative control是否有所降低,然后再分析突变后是否获得相反的结果。这样应该是比较好的结果。正解。
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qijianniheihei 楼主能够将常用的用于构建miRNA的载体在构建时除了茎环结构之外还需要多少bp总结一下呢?我这一直也很纳闷,因为有一个熟人他们用的是pcDNA3载体,就随便选的。用普通的真核表达载体例如pCMV或pcDNA3就可以表达miRNA,通常两翼序列bp,1000bp较多。专用的miRNA表达载体则根据说明操作,说明书上给出了两翼序列长度,就像刚才说的pMXs,说明书提供两侧长度建议100bp。
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sunyaru 你好!我做miRNA,最近做real time PCR结果不好,我用的是试剂盒,引物是生工的,用的是deta deta CT的计算方法。是不是CT值大于30就不能用啊?我反复做,试着把模板浓度增加,但是结果还是不好。而且之前用的引物浓度,阴性对照(就是加了除模板以外的试剂)总能有CT值,大概36、37、38有时候39,请问您这样的阴性对照出结果的可不可以用啊?发文章的话有什么影响嘛?后来我试着将循环数减少到35(之前是40个循环),阴性对照是没有CT值了,但是目的基因也出不了CT值了。到底阴性对照那样的CT值(36、37、38、39)可不可以接受啊?期待楼主的回答。谢谢!你的反转录是怎么做的?
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小香菜 我以前做遇到过这种问题,目标基因和阴性对照的溶解曲线一个位置,阴性对照应该是被污染了,后来我们换了个新的,没有出现过了。还有你的目标基因的ct值很大,即使加大反转录,也还是效果不好,你要看看你的mir在你的样品是否高表达,文献怎么说的,可能本身就很低,扩出来就ct很大了,个人意见仅供参考,如果问题解决了希望共同交流。我也这样考虑过,包括前面网友说的都有可能,目的基因ct值很大,阴性对照情况类似目的基因。而该miRNA又不属于低丰度的,所以不知道这个反转录是什么情况?溶解曲线怎么样?
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alex-tt 请教楼主:已知某miRNA在肿瘤中高甲基化,能否通过芯片或其他技术找到使其高甲基化的调控因子?谢谢!能否说的详细点?是miRNA基因启动子区高甲基化还是?
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上海欧易 我也这样考虑过,包括前面网友说的都有可能,目的基因ct值很大,阴性对照情况类似目的基因。而该miRNA又不属于低丰度的,所以不知道这个反转录是什么情况?溶解曲线怎么样?你的CT值几乎都大于36个循环了,个人感觉主要问题还是在RNA的抽提和反转录步骤。
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sunyaru 你好!我做miRNA,最近做real time PCR结果不好,我用的是试剂盒,引物是生工的,用的是deta deta CT的计算方法。是不是CT值大于30就不能用啊?我反复做,试着把模板浓度增加,但是结果还是不好。而且之前用的引物浓度,阴性对照(就是加了除模板以外的试剂)总能有CT值,大概36、37、38有时候39,请问您这样的阴性对照出结果的可不可以用啊?发文章的话有什么影响嘛?后来我试着将循环数减少到35(之前是40个循环),阴性对照是没有CT值了,但是目的基因也出不了CT值了。到底阴性对照那样的CT值(36、37、38、39)可不可以接受啊?期待楼主的回答。谢谢!我想再问一下,您在反转录的时候加的是特异性引物吗?内参的和目的基因的特异性引物都加了吗?
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请问,mmu-miR-21_st是什么意思?能看出来这是成熟体还是前体吗?
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qijianniheihei 我想再问一下,您在反转录的时候加的是特异性引物吗?内参的和目的基因的特异性引物都加了吗?我是用试剂盒做的逆转录,直接加&1微克的RNA模板,然后逆转的。不太懂你说的特异性引物是什么意思。我现在真不知道该怎么办了。。。主要现在最怕的就是逆转的cDNA没有了,取的组织做的,到时候再取组织重新做的话就毕不了业了。。。怎么办啊?溶解曲线都还好,引物二聚体不是很明显,就是不知道为什么阴性对照总是和目的基因的CT值差不多(包括正常组和对照组)。
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上海欧易 你的反转录是怎么做的?直接用试剂盒做的,按照说明书的温度,在普通PCR仪代替水浴做的。您好,我还想问下,是不是提出来的RNA必须在几小时之内逆转录,之后的RNA就不能用来逆转了?是不是这样的?
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已知某miRNA在肿瘤中高甲基化,能否通过芯片或其他技术找到使其高甲基化的调控因子?谢谢!是启动子区的高甲基化,但是什么因素使其高甲基化的不清楚。
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楼主我想问个问题,我用生物信息学预测一个靶基因的microRNA,得到一些结果,他们按照 mirSVR score和phastCon scores ,进行了排序,我想知道,以上这两个评分是什么意思,一般来说,评分达到多少以上/以下,才可能相关性更大。希望楼主能讲解一下,谢谢楼主!
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上海欧易 我们公司用的是Ambion的试剂盒,结果还不错。具体方法按照protocol进行就好了。请问您们用Ambion的试剂盒是提small RNA,还是只用一个filter提总RNA?用taqman试剂盒做逆转录cDNA时,是按protocol用2ng/ul的浓度吗?我们是用mir-26b作为内参,与其他内参比较有什么不同吗?谢谢!
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sunyaru 我是用试剂盒做的逆转录,直接加&1微克的RNA模板,然后逆转的。不太懂你说的特异性引物是什么意思。我现在真不知道该怎么办了。。。主要现在最怕的就是逆转的cDNA没有了,取的组织做的,到时候再取组织重新做的话就毕不了业了。。。怎么办啊?溶解曲线都还好,引物二聚体不是很明显,就是不知道为什么阴性对照总是和目的基因的CT值差不多(包括正常组和对照组能否将你的说明书上传一份。或者说明一下是哪个公司的产品,最好有货号。
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【求助】血浆miRNA提取,哪种试剂盒性价比高?
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我最近要提取血浆中的miRNA,用天根试剂盒试过,OD值太低了~大家用的都是哪种?有人推荐用axygen的,有用过的吗?效果如何???
不知道邀请谁?试试他们
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微量试剂盒可以使样本浓缩10~20倍,洗脱体积最小只需5ul,样品被高度浓缩,性价比高
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用过norgen和qiagen,效果差不多,提取完成后浓度会很低,然后你需要浓缩,就好了
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如何浓缩呢?OD值低不会影响后续操作吗?
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知识点都错了,血浆,血清的RNA浓度很低,已经超过了吸光值可以测量的范围,所以,不能用OD值去测,或者跑电泳检测, 这个都没有意义的。‘北京艾德莱生物技术人员是05年第一个国内做microRNA提取试剂盒的,一直到现在保持着技术最高,种类最全,独家产品最多的记录。请参考下面是用艾德莱的microRNA提取试剂盒,下面血清,血浆,发表的文章。附件上传一篇另外一篇文章:
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MicroRNA提取选择指南1. 从组织细胞中提取microRNA。首选RN05 RNAmisi microRNA提取试剂盒,这个和qiagen的miRNeasy Mini kit (qiagen的货号:217004 )完全相同。而且,我们配了富集microRNA的,比qiagen的还要方便,Qiagen如果需要富集microRNA,还要另外购买吸附柱子。一个盒子,既可以提取包括microRNA,28s,18s,mRNA的总RNA,也可以单独提取富集的microRNA。质量确保200%和qiagen的一样,否则,无条件退货,赔钱。qiagen的目录价格是3710 50次。我们价格只有qiagen的三分之一。2. 从全血,液体样品,血浆,血清中提取microRNA。首选RN24 BLOODmisi全血(液体样品)microRNA快速提取试剂盒。此试剂盒在qiagen和ambion的上述组织细胞RNA提取试剂盒上面改进而成。为我们独创,qiagen和进口公司也没有。是最快速方便的提取血液microRNA的产品。如果仅仅是从血浆/血清中提取microRNA,应该选择RN4601 血清/血浆microRNA快速提取试剂盒。3. 从石蜡包埋组织提取microRNA。首选RN31 EASYspin 石蜡包埋组织microRNA快速提取试剂盒。该款试剂盒原理,方法,基本和qiagen的一致。对应qiagen产品是miRNeasy FFPE Kit,货号是:217504。4. 从植物中提取microRNA。一般来说,如果TRIzol可以提取的植物样品,首选RN05 RNAmisi microRNA提取试剂盒。TRIzol无法提取的样品,应该首选RN40 EASYspin植物microRNA快速提取试剂盒,为本公司独创产品。
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植物microRNA/Trizol提取失败多糖多酚/复杂植物microRNA提取选择指南(北京艾德莱原创)1. Trizol 可以提取的植物样品。推荐RN05-RNAmisi microRNA快速提取试剂盒 , 这个是Trizol类原理的方法来提取microRNA,只要Trizol可以提取的样品,都可以用这款来提取microRNA。对应天根的DP501和Qiagen的217004,我们的和他们的原理方法完全一样,我们的优点在于,我们比Qiagen的更好在我们有两套柱子,除了提取包括microRNA的总RNA, 我们还可以分提RNA和microRNA,也就是专门分离富集microRNA,不需要再花钱买一个试剂盒来富集microRNA了。2. Trizol 不可以提取的植物样品。推荐RN40-EASYspin 植物microRNA快速提取试剂盒 ,这是我们的世界首创,独家的产品,它没有竞争对手,天根,全式金,omega,qiagen,takara这些公司都没有这种原理方法的植物RNA提取试剂盒, 他们只有Trizol类原理的植物microRNA提取试剂盒,也就是等于我们的RN05,
microRNA提取试剂盒,这款的原理是用Trizol类的,苯酚氯仿类的原理,Trizol能提取的植物样品,可以用它来提取microRNA,但是,大家知道,很多植物样品是无法用trizol来提取的,所以,这款Trizol原理类的microRNA试剂盒对于这种trizol无法提取的植物样品不要说microRNA了,就是RNA都无法提取。所以,全世界只有我们一家有这款试剂盒。 如果客户说这款产品为啥这么贵,你就要给客户解释一下, 别家的试剂盒原理是Trizol类的,是用苯酚/氯仿类原理的,这款因为很简单,所以,它比较便宜,但它是无法提取复杂多糖多酚样品植物的microRNA的,如果你要这款便宜的,我们也有,就是我们的RN05 RNAmisi microRNA提取试剂盒这款,而且,确保和Qiagen的质量一样甚至更好,你要便宜,这款我们有的, 可以更便宜。但是这款Trizol类原理的是无法提取复杂植物样品的,就是进口Qiagen的也无法提取的。不要说microRNA了, Trizol复杂样品的总RNA都无法提取, 怎么可能能提取microRNA呢? 所以,便宜但是无法用的。而我们的RN4001, 是我们世界独创的不用Trizol/苯酚/氯仿毒性物质原理的植物microRNA提取试剂盒, 可以提取包括复杂植物样品microRNA的一切样品,适合做microRNA测序,高通量测序,建库等各种流行应用,而且,已经有4篇发表文章(可以看说明书附录)包括复杂的丹参等样品。附录4:使用RN40 EASYspin植物microRNA快速提取试剂盒的部分发表文章:1.毛泡桐:Dynamic expression of novel and conserved microRNAs and their targets in diploidand tetraploid of Paulownia tomentosa. Biochimie : 68–772.丹参:Genome-wide analysis and molecular dissection of the SPL gene family in Salvia miltiorrhiza. J Integr Plant Biol –503.短葶飞蓬Transcriptomic comparison of the selfpollinated and cross-pollinated flowers of Erigeron breviscapus to analyze candidate self-incompatibility-associated genes. BMC Plant Biology 84.梧桐树:Identification and Functional Analysis of MicroRNAs and Their Targets in Platanus acerifolia under Lead (Pb) Stress. Int. J. Mol. Sci. 98-7111 最后,客户在不知道我们的情况下,用Qiagen,天根的Trizol类 microRNA盒子提取失败的情况下,没有办法,只能用Trizol或者手工方法做,但是Trizol/手工方法的异丙醇乙醇沉淀无法充分沉淀微小的microRNA,所以会丢失大量的microRNA,但是客户没有办法,只能凑合用 。我们这个时候,可以给客户讲清楚道理,客户只要经费允许,是愿意花1个天根普通microRNA提取试剂盒的钱来买一个真正管用的植物micrRNA盒子的!
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有需要可以联系我。价格优惠,质量保证
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@zxling1992 ,请问你买试剂盒了么?最后用的哪个?
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用过norgen和qiagen,效果差不多,提取完成后浓度会很低,然后你需要浓缩,就好了 请问,您是怎么浓缩的呢?能否给个详细的步骤,非常感谢。
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我没用试剂盒,用的trizol.
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