蛋白质翻译后修饰及其相互作用预测方法研究--《东北师范大学》2013年博士论文
蛋白质翻译后修饰及其相互作用预测方法研究
【摘要】：蛋白质翻译后修饰和蛋白质间的相互作用是蛋白质发挥正常生物学功能的基础，在生命体中具有十分重要的作用。由于实验研究手段欠佳和相关数据的零散不齐，尽管有350多种蛋白质翻译后修饰已经被实验所证实，仅有很少的几种蛋白质翻译后修饰被较好的研究。通过传统的实验方法鉴定蛋白质翻译后修饰位点既费时又费力，并且酶反应的优化又是一个极为耗时的过程，这些因素严重制约了相关研究的进展速度。因此，一些基于计算的方法逐渐被提出来，这些方法既可以高效地、准确地预测蛋白质的翻译后修饰位点，又可以对进一步的体内或体外的实验验证提供一些线索。而对蛋白质间相互作用的研究，将有助于从系统角度深入理解各种生物学过程，为进一步探索生物体疾病的发生机制提供可靠的数据来源，同时还可以为寻找新的药物靶标，新药研发开辟道路。本文针对蛋白质翻译后修饰位点及蛋白质间相互作用的预测方法进行了研究，主要成果如下：
(1)提出了一种基于集成学习的蛋白质泛素化位点预测方法，首先采用四种类型的特征，来编码每一个赖氨酸位点及其相邻位点的氨基酸；接下来，为了减少计算复杂度并提高预测方法的准确度，采用了一种有效的特征选择方法筛选最优的特征子集；最后，利用筛选出来的最优特征子集建立了一个集成分类器，并对最优特征子集中进行了特征分析。与其它方法预测方法在公共数据集上的对比实验表明该集成分类器良好的预测性能。
(2)通过提取有效的pupylation底物信息，建立了一个新的pupylation位点分类器。首先，对训练集中每个样本序列，提取五种类型的信息并对pupylation位点本身和它邻近的残基进行编码；接下来，对于这五种特征构成的集合，应用最大相关最小冗余(mRMR)和增量的特征选择(IFS)方法找出最优的特征子集；最后，基于最优特征子集，用最近邻算法(NNA)建模并预测pupylation位点，其留一法测试的预测准确率可以达到70.93%。通过对最优特征子集的生物学分析，研究发现进化信息和物理化学/生物化学属性在pupylation位点识别中发挥了极其重要的作用，位点7，10和11对pupylation位点识别的贡献最大。本文的工作结果表明：mRMR与IFS两种特征选择方法的结合能够有效地对生物数据集进行特征筛选，在此基础上的建模，既可以得到满意的预测性能，也容易发现所选特征的生物学意义。
(3)首次将一种新的编码方式，k-spaced氨基酸对构成编码(CKSAAP)，应用于预测磷酸化位点预测问题，并提高了磷酸化位点的预测准确度，通过与PPRED、DISPHOS和NetPhos这三种预测工具的比较，本章构建的CKSAAP_PhSite预测工具能够更加准确地预测磷酸化位点。CKSAAP_PhSite对丝氨酸磷酸化位点预测的敏感度是84.81%，特异度是86.07%，准确度是85.43%；对苏氨酸磷酸化位点预测的敏感度是78.59%，特异度是82.26%，准确度是80.31%；对酪氨酸磷酸化位点预测的敏感度是74.44%，特异度是78.03%，准确度是76.21%。实验结果验证了该方法的有效性和实用性，相应的特征分析表明CKSAAP编码方式能够有效地提取出磷酸化位点附近序列模式。基于该研究内容，建立了相应的在线预测工具。
(4)提出了一种新的基于扩增的Chou’s伪氨基酸构成编码的蛋白质间的相互作用预测方法，首先采用了三组描述符来编码每一个蛋白质交互对；然后利用PCA技术对编码后的930个序列特征进行降维，经PCA降维后得到的特征子集不但包含很少的特征，而且还尽可能多地保留了原始特征集合的信息；最后，通过将降维后的特征子集作为输入向量，建立了一个基于支持向量机的蛋白质相互作用预测模型，并在黑腹果蝇数据集和幽门螺杆菌数据集上与其它预测方法进行比较，实验结果表明，本文提出的预测模型能够更加准确地预测蛋白质间的相互作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：东北师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q51【目录】：
摘要4-6Abstract6-8目录8-11第一章 绪论11-17 1.1 研究背景11-15
1.1.1 生物信息学简介11-12
1.1.2 机器学习方法在生物信息学中的应用12-13
1.1.3 蛋白质翻译后修饰13-14
1.1.4 蛋白质相互作用14-15 1.2 本文工作15-17
1.2.1 本文的研究内容15-16
1.2.2 本文的组织结构16-17第二章 机器学习算法17-27 2.1 决策树算法17-19
2.1.1 决策树相关概念17-18
2.1.2 随机森林算法18-19 2.2 k近邻算法19-21 2.3 支持向量机算法21-25
2.3.1 统计学习理论21-22
2.3.2 支持向量分类器22-24
2.3.3 支持向量机核函数24-25 2.4 集成学习算法25-26 2.5 本章小结26-27第三章 基于集成学习的蛋白质泛素化位点预测27-38 3.1 引言27-28 3.2 实验材料和方法28-33
3.2.1 数据收集和整理28-29
3.2.2 序列编码29-31
3.2.3 基于互信息的特征选择31-32
3.2.4 模型构建和性能评价32-33 3.3 实验结果及分析33-37
3.3.1 集成分类器的性能33-35
3.3.2 与其它方法的比较35-36
3.3.3 特征分析36-37 3.4 本章小结37-38第四章 基于mRMR特征选择和分析的原核生物pupylation位点预测38-48 4.1 引言38-39 4.2 实验材料和方法39-43
4.2.1 数据收集和整理39-40
4.2.2 特征参数的选取40-41
4.2.3 mRMR特征选择方法41-42
4.2.4 增量的特征选择方法42
4.2.5 模型构建和性能评价42-43 4.3 实验结果及分析43-47
4.3.1 最优特征子集选取43
4.3.2 特征分析43-47 4.4 本章小结47-48第五章 基于k-spaced氨基酸对构成编码的蛋白质磷酸化位点预测48-61 5.1 引言48-49 5.2 实验材料和方法49-52
5.2.1 数据收集和整理49-50
5.2.2 特征向量的构建50
5.2.3 特征选择50-51
5.2.4 模型构建和性能评价51-52 5.3 实验结果及分析52-58
5.3.1 CKSAAP_PhSite预测工具的性能52-54
5.3.2 特征分析54
5.3.3 与二元编码方案的性能比较54-57
5.3.4 与其它预测工具的性能比较57-58 5.4 Web服务开发58-60 5.5 本章小结60-61第六章 基于扩增的Chou’s伪氨基酸构成编码的蛋白质-蛋白质相互作用预测61-71 6.1 引言61-62 6.2 实验材料和方法62-67
6.2.1 数据收集和整理62
6.2.2 蛋白质-蛋白质相互作用的编码表示62-66
6.2.3 主成分分析66
6.2.4 模型构建和性能评价66-67 6.3 实验结果及分析67-70
6.3.1 预测工具的性能67-68
6.3.2 与其它方法的性能比较68
6.3.3 特征分析68-70 6.4 本章小结70-71第七章 总结与展望71-74 7.1 总结71-72 7.2 展望72-74参考文献74-85致谢85-86在学期间公开发表论文及著作情况86
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请问怎样将相互作用的蛋白解离？
各位大神，我有个问题想请教：我的实验目的是检测与A蛋白相互作用时B蛋白的泛素化状态（已知在细胞中B与A可形成异源二聚体，B自身还有同源二聚体，B可被泛素化），目前的实验设计是用A的标签抗体做免疫共沉淀将AB复合物（可能还有A和其他蛋白的复合物）拉下来，然后将AB解离，然后用镍柱将B（带6*his标签）拉下来，最后得到的蛋白用泛素抗体检测。
& & 目前的问题是：1.如何将AB解离？查了一些资料，有说用低于4M尿素的，6M尿素的，具体解离相互作用的蛋白用哪个浓度好呢？
& && && && && && && && & 2. 加入尿素蛋白解离后可以直接上镍柱吗？尿素会影响B与镍柱的结合吗？
& && && && && && && && & 3. 连接在B上的泛素链（通过B的赖氨酸ε-氨基形成酰胺键与泛素连接）会在尿素作用下脱落吗？只有不脱落的情况下实验才能继续下去
& &本人在分子医学研究上是半路出家，很多问题都不懂，见笑了！诚恳地请各位帮助！
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你的意思是大小不等多条带就是B被泛素化降解？可是K63型ubiquitination不会引起蛋白降解
是呀。这些大小不等都比未被泛素化的要大，是被mono- 或poly ubiquitination所致。我刚开始的时候也像你一样迷茫，同学给我推荐了，上面很多牛人分享的科研经验，对新手很有帮助，你也可以下载来试试！
你这个试验设计我绝对不能同意！！
Co-IP with A antibody (tagged)是蛋白质的相互作用，Western with B antibody是蛋白质的相互作用，而蛋白质之间的相互作用，必然引起相互作用的各个蛋白质的相互作用区域的构象改变；何况抗体的分子量不小，如果是多克隆抗体，则各个抗体识别的同一蛋白质的抗原免疫簇不同，无论哪种情况，作为抗原的A结合A抗体，A 的与B相互作用的位点是否仍然暴露？不好说。即使Western blot时，也不能确定就是A与处于ubiquitination状态的B发生了相互作用。
大小不等的多带可能是B被蛋白酶体降解的产物，但是蛋白质酶体降解了B是成为多肽，其构象已经不像完整的B了，没有证据可以证明这些蛋白质B的降解仍然可以与原来与B能够相互作用的A蛋白质居然还能相互作用，这在蛋白质折叠和分子识别上绝对讲不通，何况现在的A还非共价地连接有A抗体！
如此实验设计太不严格了！！
看上去你并怎么做实验，或者说不明白co－IP是用来做什么的？更可能不了解蛋白泛素化都是怎么做的？
1、CoIP顾名思义是用A抗体免疫沉淀A下来，在这个过程中那些和A相互作用的蛋白质会被一并沉下来。如果你对这个有异议就没有讨论的必要了，这种铺天盖地的论文也不改发表了。简单说，“作为抗原的A结合A抗体，A 的与B相互作用的位点是否仍然暴露”这种担心是多余的。
2、经过“1”沉淀下来的复合物，经过变性后在做Western blot，如果出现B，说明B是被Co－IP下来的，因为二者之间有相互作用。当然，为了排除你的担心（即使Western blot时，也不能确定就是A与处于ubiquitination状态的B发生了相互作用），所以任何实验都有对照，这里也不例外，在IP时要用IgG做对照（只有没做过的人才会提出这类问题）。
3、Again，我说的“大小不等”都是被mono－或poly泛素化了的B产物，所以他们的大小都比B本身大，这和降解产物没有任何关系。而且，在做ubiquitination实验室，一般都先用蛋白酶抑制剂处理一段时间，抑制蛋白的降解，所以我猜测你不知道怎么做这类实验。
4、“何况现在的A还非共价地连接有A抗体！” 看到你这种评论我都不知道该说什么，Western blot之前已经变性过，蛋白间的所谓结构、构象、相互作用早已不复存在，不需要你去考虑这些问题。唯一要知道的是通过western blot看沉降物中有无B。
算了，不费口舌了。
泛素共价连接连接的蛋白质只要用MS-MS就可以高通量的检查出来。
“4、“何况现在的A还非共价地连接有A抗体！” 看到你这种评论我都不知道该说什么，Western blot之前已经变性过，蛋白间的所谓结构、构象、相互作用早已不复存在，不需要你去考虑这些问题。唯一要知道的是通过western blot看沉降物中有无B。”----这句你说对了，SDS PAGE破环任何人共价连接。
当然可以用MS检测，但目的是不同的，可能主要用来检测泛素化的位点。一般研究某种条件对某蛋白泛素化的影响等是不会用MS的。楼主的情况也是。
当然可以用pull down做。事实上，一般两者同时都做的，CoIP主要解决在细胞内环境下蛋白间的作用，而GST pulldown等则更具in vitro的性质。所以多数情况下两者同时做，互相支持。
有编辑功能吗？如有可以修正之。
免疫沉淀我是没有做过，怎么了！？不过，我还是经常做实验。
你的实验流程，我基本上看懂了，也同意你的实验方案。而且我承认在WB实验上说错了，因为当时只想着蛋白质折叠和免疫识别。
除了：蛋白A结合A抗体，仍然可以和蛋白B结合，游离的蛋白A是可以与蛋白B结合的，其他你的观点，我同意。在实验中可以用对照实验解决这步问题，但是从分子识别角度，不能认为蛋白A结合A抗体，仍然可以和蛋白B结合，游离的蛋白A是可以与蛋白B结合的，是普遍能够成立的观点。如果你不同这点，也有扑天盖地的证明：蛋白A结合A抗体后，不一定仍然可以和蛋白B结合，当游离的蛋白A是可以与蛋白B结合时。
当然，你可能不是这个意思，只是说明实验流程。
你的原话在这。。。
这个不需要反驳的。理论上你的担心是有道理的，但事实上这种情况极少发生。即便有时候效果不好，比如说明明知道A与B间有相互作用，但CoIP却不支持，这时候你仍有更多选择，如换一种抗体（是不是很支持你的担心:D），更多的时候反过来做：用抗B的抗体进行IP，等等。
这个就不用回复了，因为没有什么需要说明的了。
oops，还是回复了。
你认为我不怎么做实验，随便你怎么说吧。我无所谓，事实只有一个。
我是没有做过蛋白质泛素化实验，你的实验流程，我还是看懂了，至少基本上看懂了。看来里面还是有相当多的实验流程已经相当成熟。
吵归吵，但是你说的是对的！我愿意接受。
什么时候吵过了？别吓唬我。
我可是才来不到24小时。
:hand:我们是在讨论，讨论中进步:hand:
你太客气了，让我多不好意思？:cat9::cat39:
MMB-301-Ubiquitin–Proteasome Protocols(2005)& && &&&
http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=7674896&fpage=1
这本书送给你，今天要不是你的反驳，这本书，我都不会去看。:hand::hand::hand::hand::hand:
别鞠躬了，不然今后我都不好意思请教问题了。:sweat::sweat::sweat:
谢谢！我去看看。
谢谢你！不过我级别太低，看不了啊~:cry:
看了两位老师的讨论，很受启发，不过还是不能解决我的问题啊，即使WB时用B抗体看到比B本身大的大小不等的条带，也不能证明B与A结合时的泛素化状态啊，泛素化有K48，K63型的，我要分型~
如果co-IP后直接用K48，K63的泛素抗体进行WB，这样就不只有B，可能把A或者其它和A结合的蛋白泛素都结合了；如果co-IP后直接用B的抗体，则不能分型。是不是还是只能像我最初提问时那样Co-IP后将AB分离，再将B纯化，再用泛素分型抗体。
看了两位老师的讨论，很受启发，不过还是不能解决我的问题啊，即使WB时用B抗体看到比B本身大的大小不等的条带，也不能证明B与A结合时的泛素化状态啊，泛素化有K48，K63型的，我要分型~
如果co-IP后直接用K48，K63的泛素抗体进行WB，这样就不只有B，可能把A或者其它和A结合的蛋白泛素都结合了；如果co-IP后直接用B的抗体，则不能分型。是不是还是只能像我最初提问时那样Co-IP后将AB分离，再将B纯化，再用泛素分型抗体WB。
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【求助】请教NF-KB检测方法
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这个帖子发布于8年零25天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请问：测定NF-KB活性是采用EMSA,WB,还是ELISA?我查了一下还有卖ELISA试剂盒的，哪种方法检测更便捷有效？初做实验，对EMSA有恐惧心理，谢谢诸位赐教
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NF-kB比较特殊，他基本上是ready-to-use，也就是胞内总有一定量的转录和表达，总在那里，但是被IkB所抑制不发挥作用，当信号来时，IkB被IKK磷酸化失活被泛素蛋白酶体降解，NFkB释放进入核发挥转录因子的作用可参考下面的图因此对NF-kB的研究，如果只检测NFkB的WB就很难有结果了，而至少需要检测：1. 胞内和核内NF-kB的量，也就是要区别核蛋白和胞浆蛋白，这个可以用WB；2. 检测IkB的磷酸化，这个也可用WB，不过IkB有两个不同的泛素化位点作用不同，因此也不是很特异的方法；3. 最经典的还是要做EMSA，直接检测NF-kB与DNA的结合，这个应该是目前最权威的试验了，推荐！！祝好运！
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战友，我做EMSA半年了。也是做的NF-kB的结合活性。而且我还做了super shift assay
NF-kB关于经典通路和非经典通路现在研究的可以说是太多了。N多的病理进展过程中都与N-KB的激活有关。 如果你仔细的看近几年的文献的话，会发现WB是可以检测NF-KB的，至少可以检测几个亚单位。像P65 P50 CREL P52 REL-B。而且针对这几个抗体都有磷酸化的P65 p50等。 需要注意的是，NFKB的活化，最后是入核的。你提取的核蛋白是做EMSA的.wb我没用来做过核蛋白，做过全蛋白的。我认为用核蛋白做WB很有意义。而且国外很多文献是通过做胞浆蛋白和核蛋白分开做，然后对比。
至于ELISA 现在头SCI还有人理么？
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EMSA的放射性没那么强。放心好了，7mm厚的有机玻璃板就搞定了。我是用的试剂盒，很好用。这是我用的protocol 希望对你哟帮助
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NFkB确实有不少是用WB检测的，不过要注意几点：检测的是那个亚基；是在核内还是胞浆；是否检测的是磷酸化的蛋白。。。。不能像其他基因那样拿起来提RNA提蛋白就检测的EMSA换用不同的抗体可以不用做放射性的，我用的是Biotin标记的，灵敏度也挺好的另外ELISA作为一种实验方法，个人认为发SCI还是没有问题的，毕竟还是有优势的，简便、快捷而且通量大，但是大概不能只用这一个方法来证明，需要其他方法补充。欢迎讨论！
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楼上的战友是用生物素标记的啊，我一战友也是，感觉生物素的似乎背景颜色淡一些。因为老板强求，我很无奈的用同位素的方法。但是也快，准备好了3个小时内一个人就能跑完两块胶。
像p100磷酸化成p52用WB就非常的好。就是关于最后出来的条带分析很头痛。国外很多是采用了倍数的方法，直接标在泳道的下方就像/filebox/down/fc/e2f8e84a675c6c44c9f4ad9这篇文献的Fig2 B。超迟滞分析各个NFkb的亚基很是不容易，我分析了4个。想在一张片子上跑出所有的理想结果真得重复好多次。
比较同意楼上关于ELISA的看法。单独的靠这个方法很难发高质量的文章。比较流行的是 wb +emsa+ikk kinase assay 。有这样的结果发篇PNAS都没问题。
现在说实话关于NFkB研究的虽然很多，但是前沿都开始研究其上游调控因子例如IKK
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