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【求助】WB转膜问题！！急求帮助！！
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这个帖子发布于3年零129天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位站友，我最近刚开始做western blot，大概有半个月，可是没有一次转膜成功啊！！！我用的是0.22umPVDF膜，每次转完膜都是白茫茫一片，胶上和膜上都看不见marker。。。。转膜条件试过100V或100mA，50min、70min、90min都试过，可是一次marker都看不见，偶尔只能看见淡淡的蓝色，很淡，几乎可以忽略。。。胶上用考马斯亮蓝染色可以看见很细的蛋白条带，膜上用丽春红染色就什么都看不见。。。
别人都说转膜很简单，为什么我就没成功过呢？求助！！！
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转膜液配方没问题，转膜时间也还好。胶上没蛋白了，说明转膜是起作用的，只不过蛋白没跑到膜上而已，否则不会连marker都看不见。最大的可能性有2：1. 楼主把转膜三明治的正负极放反了！蛋白全跑到转膜液里——要时刻牢记蛋白是从负极往正极跑的2. 转膜的夹板太松，蛋白全跑到转膜液里了——可多加块海绵或3mm滤纸。操作时注意一下。
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考马斯亮蓝染色可以看见很细的蛋白条带，你是指目的条带？是不是蛋白量太少了，加大上样量试试；干转or湿转？转膜液怎么配的，还有PVDF提前甲醇处理过吗
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haks 考马斯亮蓝染色可以看见很细的蛋白条带，你是指目的条带？是不是蛋白量太少了，加大上样量试试；干转or湿转？转膜液怎么配的，还有PVDF提前甲醇处理过吗 感谢你的回复，考马斯亮蓝染色看见的条带有很多条，我想应该有目的蛋白和内参蛋白吧。下次我也准备加大蛋白量，不过我现在纠结的是为什么连marker都转不过去？我是用湿转，转膜液先配成10×， 29 g 甘氨酸、58g Tris 碱、3.7g SDS，溶解在1000ml水中，使用时再加入20%甲醇，转膜液平时都放4度冰箱保存，PDVF膜使用前有用甲醇浸泡1分钟左右。
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WB转膜后的PVDF膜剪膜问题
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问题已关闭悬赏丁当:5
如题，湿转结束后，丽春红染色并将PVDF膜上的染液洗净后，根据Marker的位置，剪下目的条带。请教一下园友，这PVDF膜怎么剪膜才能避免剪掉目的蛋白和内参呢，谢谢！
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转膜后染色是个什么操作啊？
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唯一的办法就是把膜裁大点
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转膜后用丽春红染色，再洗净剪膜的
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【求助】WB的转膜时间
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这个帖子发布于6年零16天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位老师，我是做western新手，现在有这个问题请教一下啊，关于转膜时间的。我的目的蛋白是43KD，内参选的是GAPDH——37KD，我以前做的时候转膜时间是90min，电流是8ma，但是效果都不是很理想啊。上次做了一次，整张膜都全部曝光看了，不知道是咋回事哎。很是让人受伤啊。请问老师们这个转膜时间行不行啊？如果不行的话应该怎么定时间啊？膜用的是PVDF膜，孔径是0.45。这个膜行不行啊？我想换成0.2的。感激不尽啊
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转膜条件：300ma 1h30min 其他的我看了都没有问题
如果整张膜都发光的话，那说明你的抗体浓度太高！！有可能是一抗或者二抗 也有其他可能比如孵育时间过长 你讲的不够详细
原因我也就不知道
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我的转膜条件是半干转的，电流可能没你说的那么大啊
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半干转要按膜的面积来算电流，基本上是1-2mA/cm2，你的电流要调整，0.45的膜没问题的，
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【求助】转膜后蛋白条带变弯曲是怎么回事
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这个帖子发布于7年零164天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位高手，大家好，我在做WB的时候遇到了这个问题，在转膜后，预染MARKER的条带像是扩散了一样，成弧形的条带而且扩散到其他的泳道上，并且我的蛋白转在膜上的位置也不对。我之前怀疑是有气泡存在，但是后来请教别人指导，他全程观看操作说没有气泡存在，所以感到很困惑，请大家帮忙解决一下。是不是缓冲液用的太多次了呢？还是什么其他原因
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你是说你的预染Marker在SDS-PAGE的时候是好好的，转完膜就变成弧形了？如果没有气泡存在，问题会出现在缓冲液以及三明治结构上。1.更换新的缓冲液。2.三明治结构一定要做好，如果你是新手，让别人教你做一次。重要的是，滤纸两侧不要搭接，否则电流不均匀会对蛋白转移有影响。3.冷却系统做好。放在冰盒内，里面也要加冰袋。
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最重要的原因是电泳液的PH值符合了！你可以看看你跑的时候大概要多长时间指示剂才跑到底，还有你胶的浓度不均一！这样条带也很容易弯曲，这是我做的过程中遇到然后解决的！
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夹子太松了也会出现这样的情况。
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