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反转录PCR(RT-PCR)
反转录PCR(RT-PCR)
逆转录PCR recessive oncogene 隐性癌基因
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【目的】探寻一种快速、简便、灵敏而可靠的检测植物组织和单头蚜虫中柑橘衰退病毒的方法。【方法】运用反转录多聚酶链式反应(reverse transcription polymera
载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)和雌激素之间的相互作用机理被认为与阿尔兹海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)的病理过程密切相关.芳香化
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定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对
背景:间充质干细胞成骨分化早期是成骨性细胞外基质细胞外间质的堆积,其主要成分均是基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1(tissue Inhibitor of Metalloprote
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本研究根据 Wesseling 发表的犬冠状病毒(CCV)K378株纤突蛋白(S)基因序列,设计合成了4条寡聚核苷酸引物 P1(18bp,bp)、P2(19bp
在生长季节分3次对部分葡萄品种枝条上部、中部和下部叶片及韧皮部,进行双抗体夹心法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-
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如何提高rt-pcr的拟转录效率
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PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
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我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。应用内含子方法构建 PC 基因 mRNA 竞争 RT-PCR 内参照徐闯，夏成，刘国文，王哲，姜玉富，张乃生，付世新 （中国人民解放军军需大学，长春，130062）摘 要： 运用 PC 基因 mRNA 与 PC 基因 DNA 相比缺少一个 81bp 内含子序列的基本原理， 应用 PCR 技术和生物工程原理，通过一对引物，进行一次克隆，成功构建了 PC 基因 mRNA 的 466bp 竞争 DNA 模板重组质粒，PC 基因 mRNA 与 PC 基因 DNA 可以互为内参照。为应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测糖代谢过程中 PC 基因 mRNA 水平奠定方 法学基础。 关键词：PC 基因；竞争模板；内含子；定量 RT-PCR；克隆Constructing Competive Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Inter-Reference of PC mRNA by Intron ApproachXu Chuang1,Wang Zhe1(Faculty of Military Veterinary Medicine, Quartermaster University of PLA,Changchuen 130062)Abstract: Inter-reference of Competive Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) was constructed by intron method to detect the change of PCmRNA level in the pathway of carbohydrate metabolism. The experiment was based on the principle that 81bp intron sequence was deleted in PCmRNA compared with PCDNA sequence . 466bp competive DNA templat recombinant plasmid. PCmRNA was successfully built with a pair of primer and once clone ,and PCDNA could be inter-reference each other. The applied intron approach in our experiment has broken traditional method of building competive templat. Key words:PC C I Quantitive RT-PCR; Clone 丙酮酸羟化酶（pyruvate carboxylase，PC）是糖异生过程三大关键酶之一，催化丙酮酸盐生成草酰 乙酸。反刍动物机体所需糖的 90%以上是由糖异生提供。PC在机体糖代谢过程中起重要作用。PC基因 mRNA水平直接反映机体糖异生的能力。利用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，可定量检测PC 基因mRNA水平[1]。但PC基因mRNA 定量RT-PCR方法最关键的是需要构建PC基因mRNA竞争模板，作 为内参标准。目前常用的外源性内参标准有RNA竞争模板和DNA竞争模板，内源性内参标准主要是应 用β-微球蛋白（β-Actin）作为RNA内参照定量模板，但其应用受到许多因素的限制。应用内含子插入 序列的方法，可省去了酶切、连接及诱变等步骤，具有精确定量、操作简单及适用广泛等特点。目前尚 未见有关应用内含子的方法构建PC基因mRNA竞争RT-PCR内参标准。1材料与方法主要试剂：新生牛肝组织；质粒、DNA 回收试剂盒及组织基因组 DNA 提取试剂盒购于杭州维特1.1 主要试剂和引物 洁生物技术公司。感受态细胞 DH-5α由中国人民解放军军需大学生物化学教研室保存；焦磷酸二乙酯 （DEPC） 、10mM dNTP 购自 Sigma 公司。反转录酶（AMV） ；Olig dT；DNA 聚合酶、PMD18-T 载体、 RNA 酶抑制剂、限制性内切酶 EcoR I、Hand III 购于 TaKaRa 公司。总 RNA 提取 TRIPURE 试剂盒购 于 Roche 公司。 引物设计根据 Genebank 中 PC 基因 mRNA 和 PC 基因 DNA 的共同序列，设计扩增引物，由上海 生物工程有限公司合成：上游引物 CP1： 5-CCCCTGGAGCGTGTGTTCGACTAC-3，下游引物 CP2：5-GGATGCCGATGTAGCCCTGCAGGA-3。 扩增 PC 基因 mRNA 片段大小为 385bp，PC 基因 DNA 片段大小为 466bp。基金来源：国家科学自然基金（） 。作者简介：徐闯（1979-） ，男，黑龙江省七台河市，硕士，主要从事内科与 诊断方法的研究。Tel：；Fax：；E-mail:.cn．1.2 PCmRNA 基因的扩增及克隆测序 （1）总 RNA 的提取 按试剂盒说明操作提取总 RNA。 按试剂盒说明操作。PC基因的逆转录反应体系：总RNA 5?l，Oligo （2）cDNA合成及PCR扩增（dT） 50pmol，5×RT Buffer 4?l，dNTP Mixture 20mM each，Rnase Inhibitor 40U，AMV 10U，加 无菌H2O至 20?l；反应条件：70℃变性 5min，0℃退火 5min，42℃逆转录 90min，90℃AMV失活 5min，0 ℃冷却 5min。 PC基因的PCR反应体系： Taq 2.5U， 10×PCR Buffer （Mg+） 2.5?l， dNTP Mixture 10mM each， cDNA 2?l，primer（10?M）各 1?l加无菌H2O至 25?l；反应条件：94℃预变性 5min；94℃变性 45s，60 ℃退火 45s，72℃延伸 45s，30 个循环；最后 72℃延伸 10min。 （3）PCmRNA 基因的克隆测序 PCmRNA 基因克隆应用 PMD18-T 载体，按常规方法操作。连接产物转 化 DH-5a 大肠杆菌，氨苄抗性 LB 培养基筛选可疑阳性菌落，摇菌，用碱裂解法提取质粒，克隆质粒作 PCR 鉴定和酶切鉴定，对阳性质粒作测序分析。挑选出 PMD-PCmRNA 质粒。 1.3 PC 基因 mRNA 的竞争模板重组质粒构建 （1） 肝组织基因组 DNA 的提取 （2） PC 基因 DNA 的扩增 按试剂盒说明操作。 扩增条件、扩增体系同上。（3）PMD-PCDNA 质粒构建 回收目的片段，连接到 PMD18-T 载体上，按常规方法操作。连接产物 转化 DH-5a 大肠杆菌，氨苄抗性 LB 培养基筛选可疑阳性菌落，摇菌，用碱裂解法提取质粒，质粒作 PCR 鉴定和酶切鉴定，对阳性质粒作测序分析。挑选出 PMD-PCDNA 质粒，PMD-PCDNA 质粒就是 PC 基因 mRNA 的竞争模板重组质粒。PCDNA 基因既是 PCmRNA 基因的 DNA 竞争模板。2结果与分析结果见图 1。 RT-PCR 扩增出一条 385bp 的片段，大小与预期设计的相符。用 EcoR I、Hand III 对2.1 PC 基因 mRNA 的 RT-PCR 扩增及 PMD-PCmRNA 质粒酶切和测序 PMD-PCmRNA 质粒进行双酶切，得到约 445bp 的酶切片段（包括载体的多克隆位点序列） ，大小与预 期结果相符。 测序结果表明基因重合率为 99.5%， 只有两个碱基发生突变， 证明所获得的片段为 PCmRNA 基因片段。 PCmRNA 测序结果：阴影部分为引物序列，方框内为突变基因。 cccctggagcgtgtgttcgactacagcgagtactgggagggggcccgggggctgtacgcggcctttgactgcacggccaccatgaagtccggtaactcgga cgtgtatgagaacgagatcccagggggccagtacaccaacctgcacttccaggcgcacagcatggggctcggctccaagttcaaggaggtcaagaaggccta cgtggaggccaaccagatgctgggcgacctcatcaaggtgacgccctcctccaagatcgtgggggacctggcccagttcatggtgcagaacgggctgacccg agctgaggccgaagcgcaggcagaggagctgtccttcccccgctcggtggtggagttcctgcagggctacatcggcatcc 其中 T 突变为 C，C 突变为 T。 1 2 M图 １ PMD-RCmRNA 质粒酶切及 PCmRNA 基因 M ： Marker DL 2000 ； 1 ：RT-PCR 扩 增 结 果 RT-PCR 结果PMD-RCmRNA 质粒酶切结果；2：PCmRNA 基因Diagram 1 The results of enzyme-cutting ofPMD-RCmRNA plasmid and RT-PCR Amplification of PCmRNA gene M:Marker DL 2000;1:enzyme-cut PMD-RCmRNA2:RT-PCR Amplification of PCmRNA gene2.2 PCDNA 基因 PCR 扩增、PMD-PCDNA 质粒酶切和测序 结果见图 2。 从基因组 DNA 中，扩增出一条约 466bp 的片段，PCDNA 质粒酶切结果（加上目的片段两边的多克隆位点） 与该片段大小相符。 测序结果表明 PC 基因序列包含有一内含子， 大小为 81bp， 位于上下游引物的中间位置。 PCDNA 基因序列：其中方框内为突变基因，阴影部分为内含子序列。CCCCTGGAGCGTGTGTTCGACTACAGCGAGTACTGGGAGGGGGCCCGGGGGCTGTACGCGGCCTTTGACTGCACGGCCACCATGAAGTCTG GCAACTCGGACGTGTACGAGAACGAGATCCCAGGGGGCCAGTACACCAACCTGCACTTCCAGGCGCACAGCATGGGGCTCGGCTCCAAGT TCAAGGAGGTCAAGAAGGCCTACGTGGAGGCCAACCAGATGCTGGGCGACCTCATCAAGGTGAGCCAGGCGCGCCCACCCTTGCCGCGGG GTCTCCGTAAGGTGCCTGGCCCCCTAAACCCAGGGGTCCCCTCTCCTCAGGTGACGCCCTCCTCCACGATCGTGGGGGACCTGGCCCAGTTC ATGGTGCAGAACGGGCTGACCCGAGCTGAGGCCGAAGCGCAGGCAGAGGAGCTGTCCTTCCCCCGCTCGGTGGTGGAGTTCCTGCAGGGC TACATCGGCATCC其中 T 突变为 C， A 突变为 C，中间插入一段 81bp 内含子序列。 M 1 2图 2 PCDNA 基因 PCR 扩增及 PMD-PCDNA 质粒酶切结果 果 M： Marker DL2000； 1： PCDNA 基因 PCR 结果；2：PMD-PCDNA 质粒酶切结2 The results of PCR Amplification of PCDNA gene and enzyme-cutting of PMD-PCDNA plasmid M:Marker DL2000;1:PCR Amplification of PCDNA2: enzyme-cutting of PMD-PCDNA plasmidDiagram2.3 PC 基因 mRNA 与其竞争 DNA 模板的竞争 PCR 结果 结果见图 3。竞争 PCR 一个体系中同时扩增出 PC 基因 mRNA 带和其竞争模板 PC 基因 DNA 带， 大小分别为 385bp 和 466bp。 M 1 2 3图 3 PC 基 因竞争 RT-PCR 结果 M ： MarkerDL2000；1：竞争 RT-PCR 结果；2：PCmRNA 基因 扩增结果；3：PCDNA 基因扩增结果 Diagram 2 PC gene competitive RT-PCR result M:Marker DL2000;1:competitive gene RT-PCR RT-PCR 2:PCmRNA3:PCDNA gene amplification result3讨论定量RT-PCR方法与传统的RNA分析方法相比具有灵敏性高、特异性强及能对大量样本同时进行量3.1 内参标准的意义及其分类 化分析的优点。因而有取代Northern-blot杂交技术和RNA酶保护技术在RNA定量分析上的趋势，在实验 中已经广泛应用，其核心技术是构建一合适的内参标准[2]。内参标准构建的难易程度是直接影响实验成 功与否的关键。内参标准的构建应以准确性强、操作简单、应用范围广等。 目前，国内外使用的内参标准主要有两种：一是外源性内参标准；二是内源性内参标准。外源性内 参标准有RNA竞争模板和DNA竞争模板。RNA竞争模板有如下缺点：样品中提取的总RNA含mRNA的 量很少；操作过程中容易降解，保存困难，导致结果重复性较差，不稳定；逆转录过程需要大量的RNA 酶抑制剂，造成大量浪费。因此，RNA竞争模板很少使用。而本实验采用的DNA竞争模板有如下优点：竞争模板与目的cDNA有相似序列，与待检样品逆转录产物在同一管中，在相同引物下共同扩增，共同 竞争引物、dNTP、酶，可以最大限度减少扩增差异，扩增产物由于大小不同，可通过电泳分开，达到 检测PCmRNA变化的目的。内源性内参标准主要是应用β-微球蛋白（β-Actin）作为RNA内参照定量 模板，但其受到如下因素的限制：内源性mRNA模板必须与目的mRNA的量相接近，只有这样两者才有 相同的扩增动力学和相同的指数扩增期；为保证逆转录效率的一致，二者mRNA的序列大小、组成和高 级结构应该接近； 二者PCR扩增片段大小的不同， 会影响扩增效率， 使用的两对引物之间相互作用较强， 容易形成引物二聚体，影响扩增效率；内源性mRNA表达量不总是稳定的，特别是在病理条件下更易改 变，而我们经常是模拟病理状态的实验。因而，内源性基因模板不能对目的mRNA进行精确定量[3、4]。另外，在基因上没有合适的酶切位点时，可以通过定点诱变的方法，产生合适的酶切位点，便于用 酶切连接的方法构建模板。 但是该方法操作烦琐， 需要诱变核酸和大量的时间。 Real-time及荧光RT-PCR 方法是最准确的基因定量方法，误差极小。但需要专用的PCR仪器，很难普及应用。因此，我们采用的 DNA竞争模板定量的竞争PCR是合适的方法[5、6、7、8]。3.2 应用内含子方法构建内参照方法的提出及其优点 本实验首次提出应用内含子构建DNA和RNA竞争模板的新思路，未见国内外有相关报道。其基本 原理：同时提取基因组和总RNA，应用RNA中缺失内含子，从而改变相同基因DNA序列和RNA序列长 度的原理，构建RNA和DNA互为竞争模板。本方法具有以下优点：1）精确定量。本方法构建的模板为 外源性DNA模板，具有DNA模板的所有特点，准确性强；2）操作简便。与传统的酶切连接方法和基因 诱变方法构建DNA竞争模板相比，内含子构建方法操作更加简便节省时间，不必花费大量的时间寻找 合适的酶切位点，去作基因的酶切连接及诱变实验。如果要对某一mRNA进行定量，只须提取基因组， 应用PCR技术扩出该基因的DNA序列，把该基因DNA作为其mRNA逆转录后cDNA的竞争DNA模板即 可；如果要对某一基因DNA定量，只须提取RNA后作逆转录，然后应用PCR技术扩出该基因的mRNA 序列，作为该基因的竞争模板即可；3）应用范围广。决大多数基因DNA与其RNA相比都含有数目、大 小不等的内含子，这为我们所建立的方法提供了理论依据和应用前景；另外，在碱基组成、片段大小、 高级结构等方面，本方法构建的竞争模板与目的片段相比达到了最高的接近程度[9]。 本方法构建竞争模板时要求内含子的长度与 mRNA 的长度要有一定的差距，也就是内含子的长度 尽量大一些。否则，在凝胶分离时两条带不易充分分离。当然，这也是酶切方法和基因诱变方法所面对 的问题。但是，使用本实验方法所获得的凝胶图片可以用凝胶分析软件分析。 参考文献：[1] Souaze F,Ntodou-Thome A,Tran CY ， Rostene W, Forgez P Techniques,-295. [2] 陈高明，王白岚，李春海，孙丽亚 复合定量 PCR 检测谷胱甘肽-S 转移酶和多耐药相关基因 mRNA 表达水平方法 的建立和初步应用。临床检验杂志，） ：197-199. [2] Chen Gao ming,Wang Bai lan,Li Chun hai,Sun Li ya Detection of the expression of GST-πand MDR1 by complex quantitative polymerase chain reaction and its clinical application. Journal of Clinical Laboratory Science,):197-199 [3] 付世新， 王玮， 王哲 竞争性 RT-PCR 法检测 Ctrl 基因 mRNA 变化的内参构建。 中国兽医科技， 2003， 33 （8） ： 39-41. [3] Fu Shi xin,Wang Wei,Wang Zhe The Construction of Ctrl mRNA gene inter-reference and using competitive RT-PCR method to test it. Chinese Journal of Veterinary science and technology,):39-41 [4] 曹丽萍，王斌，郁知非 250－253． [4] Chao Li ping,Wang Bin,Yu Zhi fei Construction of the internal standard RNA and DNA templates for MRP gene quantitative analysis.China J Hematol,):250-253. [5] Bustin S A Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR(RT-PCR): trends and problems Journal of Molecular Endocrinology. -39. [6] Lucas S, Tavernier G, Tiraby C, Mairal A, Langin D Expression of human hormone-sensitive lipase in white adipose tissue MRP 基因 RT-PCR 内标准 DNA 模板和 RNA 模板的构建．中华血液学杂志，） ： Quantitative RT-PCR:limits and accuracy . Bio-of transgenic mice increases lipase activity but does not enhance in vitro lipolysis. Lipid Research. 2002. [7] Gilliland fluorescence quantitative PCR assay for agentsin hepatitis. ProcNatlSciUSA. 5 [8] Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R kinetic PCR analusis:real-time monitoring of DNA amplification reaction. Biotechnology,6-1030. [9] Grunebach F, Griese E, Shumacher K Competitive nested polymerase chain reaction for quantification of human MDR1 gene expression. Cancer Res Clin Oncol, ):539-544.
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