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简介：本文档为《电化学测量技术实验报告.docdoc》，可适用于综合领域，主题内容包含电化学测量技术实验报告doc实验报告课程名称:电化学测试技术实验地点:材料楼同实验者:管先统SQ朱佳佳SQ吴佳迪SQ杨小艳SQ实验一铁氰化钾的循环伏符等。
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LiF对Na3AlF6-Al2O3熔盐电解阴极过程的影响
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二茂铁及其衍生物的电化学与结构理论研究
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氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学文库
氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学文库.txt 我的人生有 A 面也 有 B 面，你的人生有 S 面也有 B 面。 失败不可怕，关键看是不是成功他妈。现在的大学生太 没素质了！过来拷毛片，居然用剪切！有空学风水去，死后占个好墓也算弥补了生前买不起 好房的遗憾。青岛科技大学 硕士学位论文 氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学 姓名：李小青 申请学位级别：硕士 专业：分析化学 指导教师：孙伟
青岛科技大学研究生学位论文 氧化还原蛋白质在离子液体屋内米材料复合体系中的直接电 化学 摘要 本论文主要研究目的在于构造和发展性能优良的以直接电化学为基础的第 三代生物传感器。血红素蛋白质是一种氧化还原蛋白质，研究其直接电化学对于 研究生命体内的电子转移过程，了解生命过程的氧化还原机理及建立高灵敏的检 测方法等方面具有非常实际的意义。纳米粒子由于其独特的光学、电学、催化等 性质，在修饰电极上的应用研究已经引起人们极大的关注。近年来，室温离子液 体逐渐成为研究的热点。本论文主要开展了以下几个方面的研究工作： 1．制备了 3 种离子液体修饰碳糊电极。以室温离子液体 1．丁基．3．甲基咪唑 六氟磷酸盐(BMIMPF6)、六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6)和 1．乙基一 3．甲基咪唑四氟 硼酸盐(EMIMBF4)等为粘合剂和修饰剂，与石墨粉相混合制备了新型的离子液体 修饰碳糊电极(CILE)。 ’ 2．开展了血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(m)在 CILE 上的直接电化学行为研究。分 别以上述 3 种 CILE 为基底电极，以 Nation、多壁碳纳米管(MWCNTs)、单壁碳纳米 管(SWCNTs)、聚乙烯醇(PVA)、纳米 Ti02、壳聚糖(CTS)等为修饰材料，采用 层层涂布法、直接混合法等固定方法，将 Hb 和 Mb 固定到不同电极的表面制备了 不同类型蛋白质电化学生物传感器，如 De／Hb／CILE、CTS／nano．Ti02／Hb／CILE、 Nafion／Hb／SWCNTs／CILE、PVA／Hb／MWCNTs／CILE、Nafion／Mb／MWCNTs／CILE、 Nation．BMIMPF6／Hb／CILE。考察了 Hb 和 Mb 在不同修饰膜电极上的直接电化学和 电催化行为。采用扫描电子显微镜(SEM)、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外 光谱和多种电化学法对修饰电极的性质进行了研究和表征。实验结果表明，Hb 和 Mb 在不同的修饰膜内基本保持了其生物活性，循环伏安扫描出现一对准可逆的 氧化还原峰，并且在修饰电极上 lib 和 Mb 的电子传递能力明显增强，纳米粒子和 离子液体的存在提供了一个合适的微环境，对电化学行为有极大的促进作用，对 Hb 和 Mb 的直接电化学行为进行了研究，求解了相关的电化学参数。解释了电化 学行为的机理，进一步研究了该修饰电极对 H202、三氯乙酸(TCA)和亚硝酸钠 (NAN02)等小分子的电催化性质，实验结果表明所制备的胁和 Mb 修饰电极表现出 良好的电催化性能，求解了相应的表观米氏常数(KMapp)。 3．开展了 lib 在纳米 Ti02 中的直接电化学行为研究。以 BPPF6 修饰的碳糊电极氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 为基底电极，采用静电吸附的方法将 Hb 固定到电极表面上，制备了 Hb 修饰电极 (nano―Ti02／Hb／CILE)。考察了 Hb 在电极上的直接电化学和电催化行为。实验结果 表明，Hb 在 nano．Ti02 膜内能够保持其原始构象，循环伏安扫描出现一对准可逆的 氧化还原峰。对 Hb 的直接电化学行为进行了研究，求解了相关的电化学参数。 关键词：氧化还原蛋白质，室温离子液体，直接电化学，电催化，碳糊电极， 生物传感器，纳米粒子 II青岛科技大学研究生学位论文 DIRECT ELECTROCHEMISTRY OF REDOX PROTEINS IN IONIC LIQUID AND NANOPARTICLES MATERIAL COMPOSITE FILMS AB STRACT In this dissertation，the third-generation electrochemical biosensors based on direct electron transfer betw．een the proteins and the underlying electrodes were fabricated and developed．Heme proteins are a kind of redox proteins．Studies on the direct electrochemistry of redox proteins can be used for the understanding of the mechanisms of electron transfer reactions and oxidation／reduction in life processe， which call also be proposed as a sensitive method for proteins determination．Due to the unique optical ， electrical and catalytic characters of nanoparicles ， nanoparticles have attracted much attention for their novel applications in the modified electrodes． Room temperature ionic liquids(RTILs)have excellent physical and chemical properties．The main points of the thesis are summarized as follows： 1．Three room temperature ionic liquids(RTILs)modified carbon paste electrodes (CPE) were constructed based on the substitute of paraffin with 1-butyl-3-methylimidazolium hexatiuorophate(BMIMPF6)， N-butylpyrifinium hexafluorophosphate(BPPF6)or 1-ethyl?-3? ?methylimidazolium tetrafluoroborate (EMIMBF4)to mix with graphite power． 2．The direct electrochemistry of hemoglobin(wo)and myoglobin(Mb)on the carbon ionic liquid electrode(CILE)were carefully studied．Hb and Mb were immobilized on the surface of CILE with Nation and polyvinyl alcohol(PVA)film or Nafion／MWCNTs film by step―by-step method．The characteristics of Hb and Mb in these modified films were investigated by scan electron microscopy,UV-Vis spectrum， FT．IR spectrum and electrochemical methods．The results showed that Hb and Mb in Ili氧化还原蛋向质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 these films retained its native s 咖 cnlre．A pair of well，defined and quasi― reversible cyclic voltammetric peaks appeared．Nanoparticles and room temperature ionic liuqids could provide a favorable microenvironrnent and enhance direct electron transfer rate． The electrochemical behaviors of Hb and Mb in the modifled electrode were carefully investigated with the electrochemical parameters calculated．The Hb and Mb modifled electrode showed excellent electrocatalytic behaviors to the reduction of hydrogen peroxide(H202)，trichloroacetic acid(TCA)and sodium nitrite(NaN02)，The apparent Michaelis．Menten constants(KM8pp)ofthe sensors were calculated． 3．The direct electrochemistry of Hb with Ti02 nanoparticle was carefully studied on the carbon ionic liquid electrode(CILE)，which was fabricated by using N―butylpyridinium hexafluorophosphate(BPPF6)．Hb was immobilized on the surface of CILE with Ti02 nanoparticle by adsorption method．The direct electrochemistry and electrocatalysis ofHb in modified film was investigated．The results showed that Hb in the film retained its native structure．A pair of well．defined and quasi-reversible cyclic voltammetric peaks appeared and the electrochemical parameters were furthur calculated． KEY WORDS： redox proteins，room temperature ionic liquids，direct elelctrochemistry,electrocatalysis，carbon ionic liquid electrode，biosensor, nanoparticles W青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或 证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：套小南签字日期：刃呵年／月扩日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛 科技大学。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 本人签名： 导师签名： 考^j＼禹 汐?唧 1 日期：幻口 7 年石月 8-E1 日期：二秒口 7 年石月莎日青岛科技大学研究生学位论文 帚第一早章义文献陬琢综怂述 1．1 血红素蛋白质简介 氧化还原蛋白质是一类具有氧化还原性质的蛋白质，可以接受或给出电子， 在其氧化态和还原态之间转换。血红素蛋白质是一类含有血红素辅基的蛋白质。 血红素(heme)又叫铁卟啉，是由原卟啉(protoporphyrin)与铁(II)组成，又称铁一 原卟啉 IX(Fe．protoporphyriniX)，是一种以多种氧化态或还原态存在的分子，其 结构如图 1-1 所示【l】 。血红素辅基通常都是血红素蛋白质电活性基团。血红素蛋 白质在电极上的直接电化学实质上就是其中的血红素辅基与电极间的电子转移 反应。常见的氧化还原蛋白质主要有：肌红蛋白(Mb)、血红蛋白(Hb)、辣根过 氧化物酶(HI 心)、细胞色素 C(Cyt C)等。 C 图 1．1 血红素的化学结构 Fig．1-1 Chemical s 缸 ucn∽of heme 1．1．1 血红蛋白 血红蛋(Hemoglobin，Hb)是高等生物体内负责运载氧的一种氧化还原蛋 白质。分子量约为 64，500，等电点为 7．4【2】 ，分子尺寸为 6．5x5．5x5．0 nm【3】 。人 体内 I-Ib 是由四个亚基构成，分别为两个 a 和两个 p 亚基。Hb 的每个亚基由一 条肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红 素分子围绕在里面，这条肽链盘绕成的球形结构称为珠蛋白。血红素分子中有 一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上大的氮氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第 8 位的一个组氨酸残基中的吲 哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合，当 Hb 不与氧 结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当 Hb 载氧 的时候，就由氧分子顶替水的位置。 1．1．2 肌红蛋白 肌红蛋 I 兰 t(Myoglobin， Mb)位于肌肉的肌细胞中，其功能主要是储氧和载 氧。Mb 是由一条多肽链和一个血红素辅基构成的中等大小的单链蛋白质，其 分子量约 17，800，等电点为 6．8E41。Mb 的多肽链由 153 个氨基酸残基组成，X 射线衍射研究表明，Mb 中的多肽链 70％是以 0【螺旋形式存在的。链中的极性 的氨基酸残基几乎全部分布在分子表面，使 Mb 具有水溶性；而非极性的氨基 酸残基分布在分子的内部，使得内部成一个疏水空腔，血红素几乎整个包埋在 这个空穴中。血红素卟啉环中心的铁原子有 6 个配位键，其中 4 个键与卟啉环 上的 N 配位，形成一个平面，第 5 轴向配位键与肽链的组氨酸咪唑相联，第 6 轴向配位键或者空着，或者结合氧。故 Mb 的重要生理功能之一是储存和运载 氧分子。 1．2 蛋白质的直接电化学研究进展及研究意义 生命过程离不开电子传递，无论是能量转换，还是神经传导；无论是光合 作用，还是呼吸过程甚至是生命的起源、大脑的思维、基因的传递都与电子传 递密切相关。研究生命过程很重要的一个方面就是研究生物体内的电子传递过 程【5J。蛋白质是～类重要的生物大分子，研究氧化还原蛋白质在电极表面的电 子传输过程对于了解生命体内的物质代谢和能量转换、了解生物分子的结构和 各种物理化学性质、探索其在生命体内的生理作用及作用机制、开发新型第三 代生物传感器和生物燃料电池以及生物电子学等均具有重要意义。 由于多数蛋白质的分子量较大，结构复杂，其电活性基团或氧化还原中心 深埋在多肽链内部，与电极表面距离较远，因此，溶液中的氧化还原蛋白质与 电极直接交换电子非常困难，并且直接电子传输的机理也非常复杂，同时与蛋 白质在电极表面的构象和定位等很多因素有关，同时溶液中的大分子杂质在电 极表面的吸附和蛋白质本身的吸附变性也会阻碍蛋白质与电极间的直接电子转 移【61。 20 世纪 90 年代以来，为了实现蛋白质和电极之间有效的直接电子传递， 人们进行了大量研究，一个比较有效的方式是将蛋白质通过薄膜修饰电极固定 2青岛科技大学研究生学位论文 在电极表面，因此薄膜修饰电极为蛋白质的直接电化学研究提供了一个新的思 路。 1．2．1 蛋白质的固定方法 为了研制价格低，灵敏度高，选择性好和寿命长的生物传感器，蛋白质固定 化技术显得非常重要。主要包括物理吸附法，共价键合法，化学交联法，包埋法， 夹心法等。现己报道的较为成熟的固定方法可归纳如下【7】 。 1．2．1．1 物理吸附法此法是通过蛋白质的极性键、氢键、疏水键的作用将生物组 分吸附于不溶性的惰性载体上，常用的惰性载体如石墨粉、活性碳、分子筛等。 物理吸附法的特点是方法简便、操作条件温和，对生物活性影响小，缺点是蛋白 质与固体表面结合力比较弱，容易导致蛋白质的泄露或脱附，从而造成传感器的 稳定性和重现性差，而且蛋白质暴露在外，容易受温度、pH、离子强度等环境因 素的影响，因此使用寿命无法满足实际要求。 1．2．1．2 共价键合法将蛋白质通过共价键与载体表面结合而固定的方法称为共价 键合法。该方法是将基体表面进行活化处理，然后与蛋白质偶联，从而使生物组 分结合到基体表面。该法的优点是通过形成共价键将蛋白质固定，相对比较稳定， 不易发生脱附。但是容易导致灵敏度降低或蛋白质失活，操作复杂，耗时，成本 高。 1．2．1．3 化学交联法使用戊二醛等双功能团试剂，使蛋白质以共价键交联在固体 表面。该法的优点是蛋白质的固定比较牢固，不易脱落。其缺点是难以控制，形 成的蛋白质比较膨松，导致扩散阻力大，且需要的试剂量比较大，容易引起蛋白 质活性降低。 1．2．1．4 包埋法包埋法将生物功能物质与生物高分子或者聚合物等溶剂混合而使 生物功能物质包埋于其中，经溶剂挥发后制成敏感膜的方法称为包埋法。常用的 聚合物如壳聚糖、琼脂糖等，由于包埋法优点较多，而且方法简单，操作简便， 因而在生物传感器的构造中得到了广泛应用。 1．2．1．5 夹心法此法是将蛋白质封闭在双层滤膜或电极／滤膜之间，这种方法可以 为蛋白质分子提供一个相对封闭的微环境，对提高蛋白质分子的稳定性能发挥比 较积极的作用，这种方法主要用于蛋白质反应器和早期的传感器中。 3氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 1．3 蛋白质修饰电极的类型 利用薄膜修饰电极来研究氧化还原蛋白质，为蛋白质的直接电化学研究开 辟了新的方向【8’9】 。这里被研究的蛋白质不是处于溶液相中，而是处于修饰电极 的表面的薄膜中。在薄膜所提供的不同于水溶液的独特而有利的微环境中，氧 化还原蛋白质往往可以与电极进行直接快速的电子交换，从而表现出良好的电 化学行为，避免了由于引入外界媒介体而给电极反应带来的复杂性与局限性。 同时，薄膜修饰电极中，蛋白质和酶的用量极微，这为蛋白质的直接电化学研 究提供了极大的便利。 按照薄膜材料不同，可将蛋白质薄膜电极分为双层类脂膜【8】 ，表面活性剂 薄膜[101，聚合物水凝胶薄膜㈣121，复合物薄膜【13】 ，天然高分子薄膜‘141，纳米粒 子薄膜【1 5】等不同类型。 按照对电极修饰方式不同，薄膜电极可以分为涂布型薄膜、溶胶一凝胶薄膜、 Langmuir?Blodgett(LB)膜、自组装膜(SAMs)、双层类脂膜(BLMs)、层层组装 (Layer―by-Layer Assembly)薄膜等。 1．4 纳米材料及其在生物传感器中的应用 纳米材料可以广泛地应用于生物医药领域，如进行细胞分离、细胞染色等， 正是由于纳米材料具有上述一系列优异特性及广阔的应用前景，系统地研究和 开发新型纳米材料具有重要的实际意义，同时深入研究纳米材料的各种物性及 其微观结构的内在联系对于进一步促进低维固体物理的发展也具有深刻的理论 意义。要实现蛋白质和电极之间比较有效的直接电子传递，就要构造一个合适 的薄膜电极界面，因此构建膜的物质的选择非常重要，各种新型成膜材料和物 质也不断被应用于蛋白质薄膜电极的制备。由于本论文采用了纳米材料和室温 离子液体两类物质，因此将两种类型的材料及其在蛋白质的直接电化学和生物 传感器方面的应用进行简单的介绍。 1．4．1 纳米材料简介 广义地讲，纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围 (1．100 nm)或由它们作为基本单元构成的具有特殊性能的材料【16】 。由于纳米结 构单元的尺度与物质中的许多特征长度，如电子的德布洛意波长、超导相干长 度、隧穿势垒厚度、铁磁性临界尺寸相当，从而导致纳米材料的物理、化学特 性既不同于微观的原子、分子，也不同于宏观物体，从而把人们探索自然、创 4青岛科技大学研究生学位论文 造知识的能力延伸到介于宏观和微观物体之间的中间领域。 1．4．2 纳米材料的特性 一般来说，纳米材料有以下几个特征【17】 ： (1)小尺寸效应。当超微粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的 相干长度或透射深度等特征尺寸相当或更小时，周期性的边界条件将破坏声、 光、电磁、热力学等特性均会呈现新的效应 IiPd,尺寸效应。这就是纳米粒子的 小尺寸效应(也称体积效应)，是其它效应的基础，这种效应为纳米材料的具体 应用开拓了广阔的新领域。 (2)表面与界面效应。纳米微粒由于尺寸小，表面积大，表面能高，位于表面 的原子占相当大的比例。这些表面原子处于严重的缺位状态，因此其活性极高， 极不稳定，遇见其它原子时很快结合，使其稳定化，这种活性就是表面效应。 (3)量子尺寸效应。当粒子尺寸下降到某一值时，金属费米能级附近的电子能 级由准连续变为离散能级的现象以及纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据 分子轨道和最低轨道能级而使能隙变宽现象均称为量子尺寸效应。 (4)介点限域效应。随着纳米晶粒粒径的不断减小和比表面积不断增加，其表 面状态的改变将会引起微粒性质的显著变化，从而导致它比裸露纳米材料的光 学性质发生了较大的变化，这就是介电限域效应。 (5)宏观量子隧道效应。当微观粒子的总能量小于势垒高度时，该粒子仍能穿 越这一势垒的能力，后来人们发现一些宏观量，如磁化强度、量子相干器件中 的磁通量等也具有隧道效应，称之为宏观量子隧道效应。 1．4．3 纳米材料的分类 纳米微粒的特异效应，尤其是其小的尺寸和大的比表面积，使得纳米材料 具有与常规材料不同的物理的、化学的和电学的性质。纳米材料尺寸、结构和 性质的可控性为设计新颖的传感体系和提高生物分析装置的性能提供了极好的 前景。纳米材料种类繁多，在酶或蛋白质的直接电化学和生物传感器构造方面 用的比较多的纳米材料包括导电的纳米材料，如贵金属、碳材料和导电聚合物 和半导体纳米材料等，这些纳米材料，不论是纳米管、纳米线、纳米球还是多 孔的纳米材料，常常可以作为电极表面的修饰材料，提高对生物分子的固定量，氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 进而起到提高传感器性能的作用。下面就这几种纳米材料在酶或蛋白质的直接 电化学和生物传感器方面的应用作一简单的介绍。 (1)金属纳米材料 这类材料中用的比较多的主要是贵金属纳米粒子，如 Pt，Pd，Au，Ag 等， 因为其很好的导电性可以应用在生物传感器中，同时这些材料本身又有较宽的 电位窗口和很好的化学稳定性，所以对生物传感器的发展有着重要意义。Ding 等【l 8J 以离子液体和 Au 纳米粒子作为修饰膜研究了 0L 一甲胎蛋白质的直接电化学 行为。Xu 等【l 9J 将 Au 纳米粒子和离子液体 EMIMBF4 混合涂布到热解石墨电极 表面上，然后将 Cty C 固定到该修饰电极的表面上，研究其直接电化学行为， 并且该修饰电极对 02 具有较好的电催化行为。 (2)碳材料 碳材料是生物传感装置中用的最普遍的一类材料，因为其极好的电子导电 性、化学和电化学稳定性以及机械强度等而在生物传感装置中具有不可替代的 地位，这类材料包括碳纳米管、碳纳米纤维、介孔碳微球等，其中碳纳米管有 单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)两种形式。Yang 等【20】利用 C60 来修饰 MWCNTs，并用于 Fib 的固定，实验结果表明，c60 修饰 MWCNTs 更有助于提高 Fib 的电化学活性和稳定性，C60 起到了电子媒介体的作用。Li 等 瞄 lJ 报道了 C 够 C 在 SWCNTs 修饰的玻碳电极上的直接电化学及其对 H202 的电 催化行为。Zhou 等【22】观察到过氧化氢酶在 SWCNTs 薄膜修饰的 Au&电极上有一 对可逆的循环伏安峰，并研究了其对 H202 的电催化行为。 (3)半导体纳米材料 半导体纳米材料，由于其通常具有高的比表面积、非毒性、生物相容性和 光学透明性较好、化学和光化学稳定性高等优点而在生物分析领域吸引了越来 越多研究者的兴趣。Ju 等怛副将肌红蛋白(Mb)固定到介孔硅纳米材料上实现了 Mb 在电极表面的直接电化学。Li 等【24】将肌红蛋白固定在 Au／Ti02／GCE 表面上， 研究了其电化学和对三氯乙酸具有较好的电催化行为。Luo 等【25】研究了 Hb、 Mb 与 Cyt C 在纳米 Ti02 膜中的直接电化学行为，提出了这三种蛋白质能够表 现出较好的电化学行为的原因可能为：纳米 Ti02 具有较强的生物相容性、较大 的比表面积而且能够与蛋白质分子发生特殊的键合作用。Lu 掣 261 采用多孔片状 的 C0304 纳米粒子和 Nation 将 Hb 固定到玻碳电极表面上，研究了直接电化学 行为，同时制备了一种新型的过氧化氢传感器，最低检测限为 0．19mol／L。 6青岛科技大学研究生学位论文 (4)纳米复合材料 纳米复合材料近年来的研究和应用越来越广泛，复合材料的种类也越来越 多，像无机．无机复合材料、无机．有机复合材料、有机一有机复合材料等。复合 材料最大的优势是能够利用两种材料各自的优点而带来单种材料所不具备的一 些性能，或者利用材料之间的协同作用达到意想不到的奇特效应，在酶和蛋白 质的直接电化学和生物传感器研究方面的应用越来越广。 1．4．4 纳米材料在电化学生物传感器中的应用 目前纳米材料在电化学传感器中的应用主要有贵金属纳米材料、碳纳米管、 半导体纳米材料等。Gimen∥等【2 刀发现在热解石墨电极上形成的 Pd 纳米岛能高效的 催化氢原子的吸附和脱附反应。董绍俊等【128,29】1 报道纳米 Pd 单层膜修饰的玻碳电极 和 HOPG 电极都对肼的氧化呈现出较高的催化活性，可用于检测微量的甲肼化合 物。聚合物一纳米 Pd 多层膜修饰碳电极可以改善对肼类化合物氧化的催化响应， 也能催化氧的还原，该修饰多层膜相当稳定【301。经层层组装形成的纳米 Pt／金属卟 啉多层膜修饰玻碳电极，对氧通过 4e 还原生成水，具有很高的催化活性和高稳定 性，可望用于燃料电池氧阴极材料的研制【311。碳纳米管(CNT)的发现为低维纳米 结构在电化学和生物传感方面的应用开辟了崭新的方向，CNT 特殊的结构表现出 优异的催化性能。Lin 等【32J 用 CNT 伟 IJ 备了葡萄糖生物传感器，可以在对乙酞氨基 酚、尿酸和抗坏血酸共存下选择性检测葡萄糖。WaIlg 等 p3J 制备了 CNT 纤维微电 极，对 NADH、I-12,02 和多巴胺都有很好的催化活性，他们将 CNT 和聚四氟乙烯混 合修饰电极，同样对 NADH 表现出强的电催化活性【341，将 CNT 修饰在玻碳电极上， 可以实现 Hb 的直接电化学【351。Sun 等【36】用 SWCNTs 和 Nation 将 Hb 固定到离子液体 修饰电极表面上，研究了 m 的直接电化学和电催化行为。Zheng 等【3 7】将 MWCNTs 固定到玻碳电极(GCE)上，然后将肌红蛋白和纳米 Ti02 混合修饰到 MWCNTs／GCE 表面以研究其电化学行为。 由于纳米粒子高的比表面和其本身的生物兼容性，在生物电催化反应中起着 重要作用。与小尺寸纳米粒子结合组装的酶，其活性中心可更接近电极表面，易 于进行电子转移，提高了生物电催化活性。导电的纳米粒子与氧化还原蛋白质和 酶之间可以发生直接的电子转移，不需要电子媒介体，可作为理想的第三代生物 传感器，如辣根过氧化物酶(HRP)与纳米 Au【38，391、纳米 Ti02【251、铂黑【40】的混合 组 装膜对 H202 的直接电催化还原。Kenneth 等【41】人在 Sn02 电极上修饰纳米金后，对 细胞色素 C 的直接电化学行为进行了研究。Mn02 纳米粒子与肌红蛋白(Mb)的多层 组装可形成稳定、多孔和高表面积的多层膜【421，在约 30 am 厚的膜层中，仍可实 7氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 现 Mb 的直接电化学。将溶胶一凝胶和纳米自组装技术相结合来固载 HRP，也实现 了酶的直接电化学，对 H202 的还原显示出很高的催化活性【431。Fe304 纳米粒子因 兼具磁性和小尺寸效应，在生物领域内得到广泛应用。Hu 等【l5】采用层层组装的方 法将 Hb 固定在在纳米 Fe304 薄膜电极上进行了研究，实验结果表明 Fe304 纳米粒子 薄膜为蛋白质与电极间的直接电子转移提供了一个适宜的微环境，使 Hb 能够很好 地实现其直接电化学行为，同时，该电极对亚硝酸盐、三氯乙酸和 H202 有较好的 电催化行为。 1．5 室温离子液体在生物电化学中的应用 1．5．1 离子液体简介 离子液体(IL)是在室温及相邻温度下完全由离子组成的有机液体物质，简称 离子液体【44,45】 。许多离子液体都是有很宽的液态温度范围，从．70℃到高达 300．400℃，在这些温度下都可以作为液体使用。从结构上说，离子液体一般是 由特定的体积相对较大的有机阳离子和体积相对较小的无机阴离子构成，大体 可以分为 A1C13 型离子液体、非 A1C13 型离子液体和其它特殊离子液体。最常见 的阳离子又烷基铵盐、烷基磷酸盐、吡啶离子、咪唑离子等，常见的阴离子有 卤素离子、含 F，P，S 的离子等。由于离子液体可以根据需要设计其阴阳离子 的组成并改变其取代基，进而改变其性能，在一定程度上可以实现人为设计， 使其能够符合化学学科各个方向的研究需要，在有机化学、催化化学、电化学、 萃取分离等领域有了广泛的应用【46,47】 ，并且已经渗透到功能材料、能源环境和 生命科学等其它学科。 1．5．2 离子液体的物化性质 作为一类新型溶剂，室温离子液体具有传统溶剂所不具备的特点：(1)液态温 度范围宽；(2)溶解能力强，且具有溶剂和催化剂的双重功能，可作为许多化学反 应的溶剂或催化活性载体；(3)无显著的蒸汽压，不易挥发，不可燃性，在使用、 贮藏中不会蒸发散失，可循环使用，不会造成环境污染；(4)热稳定性和化学稳定 性高；(5)粘度大，受 02、pH 等的影响小，可简化实验条件；(6)较高的离子导电 性，因此无需另外加入电解质；(7)电位窗口宽；(8)低的毒性和环境影响；(9)种 类繁多，并可通过选择合适的阴阳离子对其性质进行调节；(10)具有良好的化学 和热力学稳定性。而且，离子液体中蛋白质、酶的稳定性好，有利于进行生物化 学和生物催化反应。 8青岛科技大学研究生学位论文 综上所述，作为新颖的绿色溶剂，室温离子液体与常规的分子溶剂有很大不 同，具有更低的环境毒性，更易被回收利用，这些性质使得室温离子液体在化学、 材料学和生命科学等领域中有着广泛的应用。 1．5．3 室温离子液体在生物电化学方面的研究进展 由于离子液体具有导电率高、电化学窗口宽等特点，使其在电化学和电分 析化学领域中具有较明显的优点，而且其挥发性小、溶解性好、酸碱性可调， 使其在电化学的多方面都有巨大的应用前景。孙伟【48】就室温离子液体在分析化 学中的应用进行了综述。同时，Endres【49】和 Buzzeo[50】详细地介绍了室温离子液 体在各种电化学过程的应用，主要有以下几个方面： (1)离子液体可以作为粘合剂和修饰剂。孙伟等【51-53]利用 1．丁基．3．甲基咪 唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)为粘合剂代替传统石蜡制备了 BMIMPF6 离子液体修 饰电极(CILE)，并以其为基底电极，用海藻酸钠、Nation 和纳米 CaC03 将 Hb 固定到该修饰电极表面上，研究了 Hb 在该电极上的直接电化学和电催化行为。 同时，也利用六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6)代替传统石蜡制备了 BPPF6 修饰电 极，并以其为基底电极，用纳米 CaC03 和 Nation 将．I-Ib 固定到该离子液体修饰 电极表面上，研究了 Hb 的直接电化学和电催化行为。Maleki 等 154J 人以正辛基 吡啶六氟磷酸盐(OPPF6)为粘合剂制备了高性能的碳糊组合电极，研究结果表明 该离子液体修饰电极具有良好的电化学性能，有效地提高了各种有机／无机电活 性物质的电子转移速率，并且降低了生物分子的过电位值。同时，也采用离子 液体 OpyPF6 为粘合剂制备了离子液体电极(CILE)，并以其为基底将 Pd 采用电 沉积的方法固定到该修饰电极表面制备了 Pd／CILE，研究了肼的电催化行 15 引。 Zheng 等【56】采用 1．丁基吡啶六氟磷酸盐([BuPy][PF6】)作粘合剂代替液体石蜡制 备了离子液体修饰电极，研究了葡萄糖氧化酶(GOx)在该修饰电极上的电化学， 循环伏安扫描可以得到一对准可逆的氧化还原峰，并且进一步研究 T(GOx)对 H202 的催化行为。 各种类型碳纳米材料与离子液体复合物修饰电极被广泛应用于研究生物大 分子。董绍俊等【57】对基于室温离子液体和碳材料的复合材料进行了电化学和生 物电化学方面的研究，他们分别将 HRP 和微过氧化物酶(MP．11)包埋在 BMIMPF6／多壁碳纳米管(MWCNTs)或者 BMIMPF6／空心碳微球复合材料中，发 现这两种基于室温离子液体和碳复合材料修饰的酶电极能够在磷酸缓冲液中发 生直接电子传输，并且酶电极能够促进氧气和过氧化氢的还原。由于碳纳米管 和离子液体之间存在着特殊的相互作用，它们的复合材料表现出优良的性质， 被广泛应用于构建各种生物传感器【5 蹦 o】 。Zhang 等[6l】人将大量的单壁碳纳米管 9氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 溶解在离子液体中制备了碳纳米管离子液体膜修饰电极，并将葡萄糖氧化酶固 定于膜中用于葡萄糖的测定。 “等【62】入将单壁碳纳米管与离子液体组成的凝胶 用于微电极的制备并且研究了其对 NO 的电催化氧化，检测线性范围为 100 nmol／L 到 100 I_tmol／L。Xiang 等【63】人用金纳米粒子／离子液体 BMIMBFd 多壁碳 纳米管复合膜将 cyt C 固定到玻碳电极表面上，研究了其直接电子转移和对 H202 的电催化行为。Zhang 等【叫用室温离子液体(RTILs)、壳聚糖(CTS)、多壁 碳纳米管(MWCNTs)复合膜将细胞色素 C(Cyt C)固定到玻碳电极表面上，研究 了 Cyt C 的直接电化学，同时该修饰电极对 H202 也具有良好的电催化作用， 检测限为 8．O?10’7 mol／L，这为第三代生物传感器的研制奠定了基础。 由于离子液体具有高的导电性和稳定性，因此可以作为一种膜材料固定于 电极表面上。Sun 等[65】将离子液体 BMIMPF6、皂土和血红蛋白混合均匀后涂布 于热解石墨电极表面制备了修饰电极并研究了 Hb 的直接电化学与电催化行为。 Yu 等【66】人将亲水性离子液体修饰于玻碳电极表面后形成单分子膜，该膜的存在 对尿酸有电催化作用，并能够促进 HRP 的直接电子转移过程。Zheng 课题组【67】 采用离子液体 HMIMPF6 制备了离子液体修饰碳糊电极(CILE)，应用该修饰电极 考察了对苯二酚的电催化行为，并和该离子液体作为膜材料制备的(IL／CPE)进 行了比较。 “掣 68】人采用离子液体 BMIMBF4 和硅溶胶一凝胶混合制备出 HRP 修饰电极，与传统的硅溶胶一凝胶修饰 HRP 电极相比，这种新型修饰电极具有 更好的稳定性和反应活性。 (2)离子液体可以作为电化学研究过程中的溶剂和支持电解质。王欢等【69】 采用循环伏安和计时库仑等电化学方法研究了间硝基苯酚在离子液体 1．乙基．3． 甲基咪唑溴化物([EMIM]Br)中的电化学还原行为，考察了扫描速度、温度和底 物浓度等因素对其电化学行为的影响，求得扩散系数 D 为 9．18xlO～cm2／s，电 子转移系数 a 为 0．37，证明了在[EMIM]Br 体系中，其反应是受扩散控制的不 可逆反应。杨家振等【_70， 】在室温离子液体四氟硼酸正丁基吡啶(BPBF4)中研究了 ‘” Fe”的电化学行为，求解了在不同浓度和温度下 Fe3+的扩散系数和扩散活化能， 结果表明扩散活化能随浓度增加而增大。Wang 等【72】人用琼脂糖水凝胶将亚铁 血红素蛋白固定在玻碳电极上后在离子液体 BMIMPF6 中研究了它的电化学行 为。 (3)离子液体还可以做电化学气体传感器。由于离子液体具有较强的溶解 能力，它还可用于制备各种类型如 02、S02、C02 和 NH3 的气体传感器。Buzzeo 等【73J 人利用离子液体制备出修饰膜用于气体传感器，可以将待测气体溶解于膜 中进而产生响应，使这种传感器的响应速度非常快。这种传感器不需要再加入 任何支持电解质，而且由于离子液体的热稳定性和低蒸汽压的特点，可以使该 10青岛科技大学研究生学位论文 种气体传感器用于高温高压的特殊环境中。Wang 等【74'751 人分别以【BMIM]PF6 和 1．乙基．3．甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)为固体电解质制备了安培氧气传 感器，采用计时安培法可得到 02 产生瞬间的氧化还原电流，且可对气体混合物 中的 02 进行定量检测。 1．6 本论文的立题思想和研究内容 1．6．1 立题思想 氧化还原蛋白质和酶的直接电化学研究不仅对于了解生命体内的物质代谢 和能量转换、了解生物分子的结构和各种物理化学性质、探索其在生命体内的 生理作用及作用机制具有重要的意义，同时它为开发新型无媒介体的第三代生 物传感器以及生物燃料电池、生物医疗器件生物电子学等奠定基础。 1．6．2 研究内容 利用室温离子液体和纳米材料等，通过与壳聚糖、Nation 等生物相容性聚 合物优化组合，设计多种新的生物相容性复合体系，如聚合物室温离子液体的 复合体系，聚合物纳米材料的复合体系，将这种基于室温离子液体或者纳米材 料的复合体系用于构造性能优良的酶电极，为酶和蛋白质直接电化学的研究和 第三代生物传感器的发展提供新的机遇。 (1)制备了 3 种离子液体修饰碳糊电极。以室温离子液体 1．丁基一 3．甲基咪唑六 氟磷酸盐、六氟磷酸正丁基吡啶和 1．乙基一 3．甲基咪唑四氟硼酸盐等为粘合剂和 修饰剂，与石墨粉相混合制备了新型的离子液体修饰碳糊电极(CILE)。 (2)构建了基于氧化还原蛋白质的电化学生物传感器。以制备的多种新型的离子 液体修饰碳糊电极为工作电极，以血红蛋白(Hb)、肌红蛋白(Mb)等为模拟酶，以 Nation、多壁碳纳米管(MWCNTs)、单壁碳纳米管(SWCNTs)、纳米 Ti02、皂土 (Clay)、聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖(CTS)等为修饰材料，采用层层涂布法、直接 吸附、直接混合等固定方法，将蛋白质固定在电极的表面制各了不同类型的氧化 还原蛋白质电化学生物传感器如 NafioMm?／MWCNTs／CILE、 NafioIl／】酏／SWCNTs／CILE、Nation 一[BMIM]PFdHb／CILE 等。采用扫描电子显微镜 (SEM)、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱和多种电化学法对修饰电极的 性质进行了研究和表征。实验结果表明，蛋白质在不同的修饰膜内基本保持了其 生物活性，循环伏安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰，并且在修饰电极上其电氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 子传递能力明显增强，纳米粒子和离子液体的存在对电化学行为有极大的促进作 用，对 Hb 和 Mb 的直接电化学行为进行了研究，求解了相关的电化学参数，解释 了电化学行为的机理，构建了多种新型的电化学生物传感器。 (3)利用所制备的电化学生物传感器进行多种样品的测定。该电化学生物传感器 对 H202、三氯乙酸(TCA)、亚硝酸钠(NaN02)等多种重要的小分子具有良好的电催 化效果，催化还原峰电流与测定对象的浓度成正比，进而构建了用于检测微量分 析对象的电化学传感分析的新方法，对电催化机理和反应动力学进行了研究，求 解了相应的米氏常数。 12青岛科技大学研究生学位论文 参考文献 [1】贺平丽，血红素蛋白质在层层组装薄膜电极上的直接电化学和层层组装驱动力的研究 【D】 ，北京：北京师范大学，2004 [2]Matthew J． ， B． Hanania G． H． Gurd,F． N． Coordination complexes and catalytic I． ， R． ． properties of proteins and related substances ． 1 04 ． Electrostatic effects in hemoglobin： hydrogen ion equilibriums in human deoxy-and oxyhemoglobin A【J】 ，Biochemistry， 1979， 18(10)： [3】Weissbluth M． ，Molecular Biology：Biochemistry and Biophysics Springer．Verlag： New York，1974，V01．15 [4]Bellelli A． Antonini G． Brunori M． et． Transient spectroscopy of the reaction ， ， ， al， of cyanide witll ferrous myoglobin effect of distal side residues[J]，J．Bi01．Chem． 990， ，1 265： 1 [5】Milazzo，G，Blank，M． ，合编， ．肖科、唐宝璋、史尔纲译，生物电化学～生物氧化还 原反 应[M]，天津科学出版社，天津，1990 【6】6 Nassar A．E．F． ，Zhang Z． ，Flu N．F． ，et．al，Kumosinski T．F． ，Proton-coupled electron transfer from electrodes to myoglobin in ordered 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在膜内没有发生变性。在 pH 值 7．0 的 PBS 缓冲溶液中 的循环伏安曲线上出现一对准可逆的氧化还原峰，为 Hb 中血红素辅基 Fe(III)／Fe(II)电对的特征峰，且式电位不随扫速的变化而变化，并求解了相关的 电化学参数，其中电子转移数 11 为 0．89，电子转移系数 a 为 0．463，反应速率常 数忽为 0．428 s～。 关键词：血红蛋白；葡聚糖； ‘离子液体；碳糊电极；直接电化学 血红蛋白是一种重要的生命物质，其电化学与电分析化学方面对于研究生命 体系内的电子转移过程，了解生命过程的氧化还原机理及建立高灵敏的检测方法 等方面具有非常实际的意义。由于电分析化学具有实时、快速、灵敏、易于微型 化等特点，所以将它应用于研究血红蛋白的性质是一种非常有效的方法。 室温离子液体(RTIL)是指在室温及邻近温度下完全由阴、阳离子组成的 液体物质，电化学窗口宽、导电率高、化学和热稳定性高、溶解性好等特点特 别适合于电化学与电分析化学的研究领域，它既可以作为溶剂又可作为支持电 解质，是电化学研究中的一种优良的介质功能材料【l】 。Zhao 等【2J 人制备了多壁 碳纳米管／离子液体修饰电极和碳微须／离子液体修饰电极，采用交流阻抗谱和循 环伏安法表征了上述两种离子液体修饰电极，并将该两种电极用于辣根过氧化 物酶(HRP)的直接电化学研究及其对 02 和 H202 的催化还原测定。 葡聚糖 De 凝胶是蛋白质纯化中的一种层析介质，它具有生物相容性、稳 定性好、吸附性强等优点，本文采用疏水性离子液体 1．丁基．3 一甲基咪唑六氟磷 酸盐(BMIMPF6，其结构如图 2．1 所示)为粘合剂代替传统液体石蜡制备了一种 新型的离子液体修饰电极(CILE)，利用葡聚糖 De 凝胶将 Hb 固定到 CILE 电极 表面上，用电化学方法、紫外．可见光谱、傅立叶变换红外光谱等对包埋在膜内 的血红蛋白的性质进行研究。实验结果表明，Hb 在 De 膜内保持了良好的分子 19氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 ／⑦◇√P 聒／N＼夕 N-／＼／r％ 2．1 实验部分 2．1．1 仪器与试剂 CHI 750B 型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；三电极系统：以离子液体 修饰碳糊电极为工作电极(0--4 mm)，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极 为辅助电极；Cary 50 probe 型紫外可见分光光度计(澳大利亚 Varian 公司)；Tensor 27 型 FT-IR 红外光谱仪(德国 Bruker 公司)；pHs．25C 型酸度计(上海虹益仪器 仪表有限公司)。 ． 牛血红蛋白 f 生化纯，分子量为 64500，天津市川页生化制品有限公司)；1． 丁基．3．甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6，杭州科默化学有限公司)；葡聚糖(De， 分子量为 20000，国药集团化学试剂有限公司)；石墨粉(上海胶体化工厂，颗粒 度≤30 岬)；O．1 mol／L pH 7．0 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制方法：8．0 g NaCI+0．2 g KCl+1．44 gNa2HP04+0．2 g KH2P04 用水定容至‘1000 mL，然后再用 0．1 mol／L 的 H3P04 和 O．1 mol／L 的 NaOH 调到所需的 pH 值；所用试剂均为分析纯，实验 用水为二次蒸馏水。 2．1．2 De／Hb／CILE 的制备 将石墨粉和离子液体 BMIMPF6 以质量比为 4：1 的比例混合，用研钵研磨均 匀后，将混合物填入玻璃管中压实，内插铜线作为导线，即可得到离子液体修 饰碳糊电极(CILE)，使用前将电极表面在称量纸上打磨成镜面。 取 10 pL 浓度为 20．0 mg／mL 的 Hb 溶液涂布到表面处理好的 CILE 上，自 然晾干后，再在电极表面上涂布 10 pL 浓度为 6．0 mg／mL 的葡聚糖水凝胶，自 然晾干后就得到了所要制备的 De／Hb／CILE。 2．1．3 电化学行为的研究 以 De／Hb／CILE 为工作电极，考察了其在 O．1 mol／LpH 7．0 的 PBS 缓冲溶液 20青岛科技大学研究生学位论文 中的电化学行为。仪器条件为：扫描速度为 100 mWs，扫描电位范围为 O．3 v~ -0．8 V(I；8．SCE)。测定前向 PBS 缓冲溶液中通高纯氮气 30 min 以除去氧气，测 定时保持氮气氛围。 2．2 结果与讨论 2．2．1 紫外可见吸收光谱 在紫外．可见吸收光谱中，三价铁的 Soret 吸收带可以提供血红素蛋白质的 结构信息【3】 ，如果蛋白质的结构发生变化或变性其吸收带就会迁移或消失【4】 。 用紫外可见吸收光谱考察了 Hb 在 De 膜中的结构变化，结果如图 2．2 所示。Hb 在水溶液中的 Soret 吸收带在 405．7 姗(曲线 d)；在 pH 为 2．0 时，Hb 在 De 膜 中的 Sorct 吸收带在 365．1 nm 处(曲线 a)，说明 Fib 已部分变性，在 pH 为 7．0 和 9．0 时，Fib 在 De 膜中的 Soret 吸收带分别在 405．9 nlrn 和 407．0 B．tn(曲线 c 与 b)，与水溶液中 Soret 吸收带几乎相当，这表明 Hb 在 De 膜中几乎保持原本构 象，没有发生变性。 2．5 2 羔'-5 《 1 O。5 ∞0 400 600 ∞O Wavelength(n 缃) 图 2．2 血红蛋白在不同溶液中的紫外一可见吸收光谱图 Fig．2-2 Uv-Ⅵs absorption spectra oflib in the different solution：(a)Hb mixedwim De in pH 2．0 PBS，(b)I-lb mixed witll De in pH 10．0 PBS，(c)Hb mixed with De in pH 7．0 PBS and(d)the solution of Hb in water 2．2．2 傅立叶变换红外光谱图 FT-IR 也可用于检测蛋白质的结构信息，蛋白质的酰胺 I 和酰胺 II 红外吸 21氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 收带可提供多肽链二级结构的信息，如果蛋白质变性，酰胺 I 和酰胺 II 两个吸 收带会显著改变甚至消失。酰胺 I( cmJ)是由蛋白质肽链骨架中的肽 段连接处 C=O 的伸缩振动引起的；酰胺 II( cm 以)则产生于 N．H 弯曲 和 C．N 伸缩振动。实验结果显示，在
cm。1 范围内观察血红蛋白在 De 膜内的红外光谱，结果如图 2．3 所示。血红蛋白在膜内的酰胺 I 和酰胺 II 红外 吸收带分别在 1654．09 cm。1 和 1539．18 cm。1(图 b)，而天然血红蛋白的吸收带分 别为 1655．34 cm 以和 1535．80 cm。1(图 a)。从谱图的相似性可以认为 Hb 在 De 膜 内基本保持了其天然构象。 胃巴 Q U= c= 皇 驾 是 占 00 00 X，Vavenumber(on 一 1) 图 2．3(a)血红蛋白和(b)葡聚糖膜内的血红蛋白红外光谱图 Fig．2-3 FT-IR spectra of(a)Hb and(b)Hb embedded in De film 2．2．3 Hb 在 De／CILE 中的直接电化学行为 将 De／Hb／CILE 放入 pH 7．0 的 PBS 缓冲溶液中，在 0．3～O．8 V 电位范围内， 经循环伏安扫描后可观察到一对稳定且准可逆的氧化还原峰(如图 2-4a)，阴极 峰电位(Epc)和阳极峰电位(Epa)分别为一 0．355 V 和．0．195 V(vs．SCE)。与之对比， 裸 CILE 和 De／CILE 在 pH 7．0 的 PBS 缓冲溶液中，循环伏安扫描都没有氧化还 原峰出现，说明在电极表面上不存在电活性。由此说明，上述的氧化还原峰是 Hb 的血红素辅基 Fe(III)／Fe(II)电对的氧化还原峰。由伏安图可以计算出 Hb 的 式电位(EOI)为．0．275 V，这与 Hb 在无机膜【5】中的结果不同，说明不同固定方 式构成的不同微环境会对 Hb 的式电位产生影响。青岛科技大学研究生学位论文 《 寸 o --?■ 、＼△ ■_■ E～ 图 2_4 不同修饰电极的循环伏安图 Fig．2-4 Cyclic voltammograms of(a)De／Hb／CILE，(b)De／CILE and(C)bare CILE at the SCan rate of 1 00 mV／s in pH 7．0 PBS(inset：the background-subtracted cyclic voltammogram of De ／Hb／CILE using data presented in curve a and b) 2．2．4 扫描速度对 Hb 电化学响应的影响 考察了扫描速度与峰电位之间的关系，在扫速 50-250 mV／s 范围内，Hb 在 不同扫描速度下都得到了准可逆的循环伏安响应，且随着扫速的增加，还原峰 电位负移，氧化峰电位正移，但式电位基本不变。根据准可逆薄层电化学过程 的 Laviron 理论【6】 ，阴极峰电位 Epc 与 In,的斜率为一 RT 旭 IlF，阳极峰电位 Epa 与 In．的斜率为 RT／(1．a)nF。考察了 Ep 与 In．的关系，结果如图 2．5 所示，根 据公式，可以求得电子转移数 11 为 0．89，电子传递系数 Q 为 0．463，说明能垒 基本对称，符合准可逆过程特征。 根据公式．109k,=tzlog(㈨+(1 刊 logtZ--log(等 m(1 刊酱 可计算得出反应速率常数忽为 0．428 S～。氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 ／． 、 【工] U∽ (力 & ＼．―／ 言 lrro(v／V s-1) 图 2-5 峰电位与扫描速度的对数之间的关系 Fig．2-5 The relationship ofthe anodic(a)and cathodic(b)peak potential against scan rate(1nv)in pH 7．0PBS 在 50―250 mWs 范围内考察了峰电流与扫描速度的关系，随着扫速的增 加，峰电流在增加。以峰电流 Ip 为纵坐标，扫描速度 l，为横坐标，做 Ip 川的 关系曲线可得两条直线，结果如图 2-6 所示，峰电流与扫描速度呈良好的线性 关系。这表明在该扫速范围内电极反应是吸附控制过程，即为薄层电化学行为 【7】 。对于薄层电化学来说，电活性的 Hb Fe(III)或 Hb Fe(II)在发生还原或氧化反 应时，通过电极的总电量与扫速无关。对循环伏安还原或氧化进行积分，可以 得到电极中电活性物质通过电极表面发生还原或氧化时所消耗的电量(Q)。由 公式：Q=nAFF*，可求得电活性物质的表面浓度，式中 11 为电活性物质发生电 极反应时的电子转移数，F 为法拉第常数，A 为电极面积(cm2)，r 宰为电活性物 质的表面浓度(mol／cm2)。由此可得 De／Hb／CILE 中电活性 Hb 的平均表面浓度 (r 木)为 2．64x10‘9 mol／cm2。 24青岛科技大学研究生学位论文 0．05 0．10 0．15 0．20 0．25 12(V／s) 图 2-6 扫速与峰电流的关系曲线图 Fig．2-6 Linear relatiomhip of cathodic(a)and anodic(b)peak current Ip versus scan rate V for De／Hb／CILE in pH 7．0 PBS． 2．2．5 pH 值对 Hb 电化学的影响 缓冲溶液的 pH 值对 Hb 在 De／CILE 上的循环伏安行为有显著影响，随着溶 液 pH 值增大，De／Hb／CILE 的氧化还原峰电位均负移。当 pH 在 5．5~9．O 范围内， 式电位(∥)与 pH 值呈良好线性关系，结果如图 2．7 所示，pH 值每增加 1 个单 位，式电位增加 44．7 mV，这比 200C 可逆体系的理论值．56 mV 要小，原因可 能是 Hb Fe(II)的水合作用以及氨基酸残基与血红素形成的氢键影响 Hb 的电势 值。式电位随 pH 增加而负移的现象与水分子以及血红素周围氨基酸的质子化作 用有关，因为在蛋白质分子中同时存在着氧化还原中心和质子化位点，电子传 递伴随质子转移的反应，会改变氧化态或还原态中心离子与质子化过程的静电 作用，表现形式为氧化还原峰电势随溶液 pH 值的增加而负移。 6 4 2 O 乏 4 击 名 《c．oH／dH氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 ／-、∞ U ∽ ∞》 ＼-／ & -’＼ o ∞ 图 2．7pH 值与血红蛋白式电位的关系图 Fig．2-7 The relationship between the formal potentials(Eo．)and pH 2．2．6 电催化行为． 用循环伏安法考察了 Hb 修饰薄膜电极对 H202 的电催化还原，在 pH 7．0 的 PBS 缓冲溶液中加入 H202 后进行测定，在．0．468 V 出现新的还原峰，且随着 H202 的加入，还原峰明显增大，而氧化峰逐渐消失。而在同样条件下，裸电极 和 De／CILE 电极在 H202 溶液中均未观察到相应的还原电信号。说明被固定在 膜中的 Hb 能有效地发生直接电子转移，而且保持了其生物电催化活性，能够 催化 H202 的还原。当 H202 浓度在 4．O?lO 西～1．5x104mol／L 范围内，催化电流与 H202 浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程 Iss(1aA)=O．133C(1amol／L)+35．44 (n-6，7=0．993)。利用米氏方程可以求解催化反应的动力学参数。根据 Linewearer-Burk 方程的电化学表达形式【8】 ： 一 1：上+兰墨 Iss Im 驭 j Im．飘 c 式中 I。 。是加底物后的稳态电流，c 是底物的体积浓度，Imax 是饱和底物状 态下所测得的最大电流，可以计算此催化反应的表观米氏常数为 1．695pM。这比以前报道的 基于血红蛋白的过氧化氢传感器的酽值要低【9，10】 。胪越小 表示酶的催化能力越强，因此血红蛋白在 De 膜内具有较高的催化活性。 2．2．7 电化学交流阻抗谱图 26青岛科技大学研究生学位论文 交流阻抗能反映电极表面修饰过程中阻抗变化的信息。图 2．8 分别为裸 CILE(曲线 a)，De／CILE(曲线 b)和 De／Hb／CILE(曲线 c)的电化学阻抗谱图。在裸 CILE 上电子传递电阻(Ret)为 72．0 Q，主要是由于 CILE 具有较好的导电性。修 饰有 De 的 CILE，其 Ret 值为 108．2 Q，因为 De 的存在能够阻碍电子转移。而 De／Hb／CILE 上阻抗明显增大(曲线 c)，其 Ret 值为 134．5 Q。这种阻抗值的逐步 增加说明了 De 和 Hb 被层层修饰于 CILE 电极表面，从而阻碍了[Fe(CN)6]3 棒 电对的氧化还原。 g： 呻 Z。疵 图 2-8 不同修饰电极的交流阻抗图 Fig．2-8 Electrochemical impedance spectroscopy for(a)bare CILE，(b)De／CILE and(c) De／Hb／CILE in the presence of 1 0．0 mmol／L[Fe(CN)6】3‘and 1 0．0 mmol／L[Fe(CN)6r and o．1 mol／L KCl with the frequencies swept from 1 0‘4 to 1 0。2 Hz 一 2．2．8 电极的稳定性 考察了 Hb 修饰电极的稳定性，实验结果表明该修饰电极在室温下放置 15 天后其峰电流减少了 2．7％，放置 30 天后其峰电流减少了 7．8％，表明固定在 电极上的 Hb 能保持较长时间的电活性。 2．3 本章小结、 采用层层涂布法用葡聚糖膜将血红蛋白固定在离子液体修饰碳糊电极表面 制备了 Hb／De／CILE，采用电化学、紫外可见光谱、傅立叶红外光谱等分析方法 27氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 对埋藏在膜内的血红蛋白的性质进行了研究，结果表明 Hb 保持了原有的构象， 可以有效地进行电子传递。考察了 Hb 在 De 修饰 CILE 上的直接电化学行为， 并求解了相关的电化学参数。 28青岛科技大学研究生学位论文 参考文献 [1】李汝雄，绿色溶剂．离子液体的合成与应用[M】 ，北京：化学工业出版社， 【2】Zhao E，Wu X．M． ，Wang M．K，et．al，Electrochemical and bioelectrochemistry properties of room―temperature ionic liquids and carbon composite materials[J]，Anal．Chem． ， 2004，76：
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1000 一一’ ? 一工 Wavenumber／cm 一 图 3．3 Hb 在不同修饰膜中的红外吸收光谱图 ．Fig．3-3 FT-瓜 spectra of the films of lib(a)and(b)Ti02／Hb／CILE 3．2．3 循环伏安图 图 3_4 显示了不同修饰电极在扫速为 200 mWs，0．1 mol／L pH 7．0 PBS 中 的循环伏安曲线。在裸 CILE(曲线 c)上没有观察到任何氧化还原峰；当 Fib 吸 附到 CILE 表面后，可以观察到有一对准可逆的氧化还原峰(曲线 b)，由图 3．4 可知，Hb 的氧化还原峰电位分别为 Epc=．0．345 V，Epa=一 0．096 V(vs．SCE)(曲 线 b)，式电位(E∥)为．0．221 V，这一对氧化还原峰是由 Hb 血红素辅基 Fe(III)／Fe(II)电对的电极反应而产生的，说明 Hb 在 CILE 上实现了直接电子转 移，但是该电极的稳定性较差，循环伏安峰会逐渐减小，直至消失，表明 Hb 逐步解离到溶液中。在 Hb／CILE 表面吸附上纳米 Ti02 后，电极的稳定性明显提 高，电化学响应值表现稳定。在 pH 5．0 PBS 中，纳米 Ti02 带正电，与带负电的 Hb 相互作用形成 Ti02／Hb／CILE，对电极表面的 Hb 起到了保护作用，使该修饰 电极的稳定性提高，且电化学响应也相应提高，由于纳米粒子独特的催化性质， 促进了 Hb 与电极之间的电子传递，循环伏安峰电流增强。 从曲线 a 中可知其氧化还原峰电位分别为 Epc=一 0．340 V，Zpa=．0．161 V(vs． SCE)，式电位(E0’)为．0．251 V，AEp=179 mV。以上可以说明不同固定方式构成 的不同微环境对 Hb 的式电位产生了影响。 33 一琴奄。口≈#Hg{；q≈占．氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 《 _中 o -?_■ ＼ △ ■?一 9 E／V 图 3_4 不同修饰电极的循环伏安图(a)Ti02／Hb／CILE，(b)Hb／CILE 和(c)裸 CILE，扫速： 200 mV／s(插图为曲线 a 和 b 分别扣除空白 c 所得) Fig．3-4 Cyclic voltammograms of(a)Ti02／Hb／CILE，(b)Hb／CILE and(c)bare CILE at the scan rate of 200 mV／s in pH 7．0 PBS buffer,(inset：the background-subtracted cyclic voltammogram ofTi02／Hb／CILE(1)and Hb／CILE(2)using data presented in calve c) 3．2．4 扫速对 Hb 电化学响应的影响 为了研究电极反应过程，考察了扫描速度对电化学响应的影响，结果如图 3．5 所示，在 100,-600 mV／s 范围内，Fib 在不同扫描速度下都得到了准可逆的 循环伏安响应，氧化还原峰电流随扫速的增大而线性增加，其线性关系如图 3-6 所示，表明 Ti02／Hb／CILE 表现出薄层电化学行为，说明在该扫描速度范围内电 极反应是吸附控制过程。青岛科技大学研究生学位论文 《 毒 厶 卜_一 EN 图 3―5 不同扫速下 Ti02／Hb／CILE 的循环伏安图 Fig．3-5 Cyclic voltammograms ofthe Ti02／Hb／CILE in pH 7．0 PBS witll the different scan rates (from a tO f)as 1 00，200，300，400，500，600 mV／s，respectively 0．12 O．24 0．36 0．48 0．60 u／(mV／s) 图 3-6 氧化峰电流(a)和还原峰电流(b)与扫速(V)的关系曲线 Fig．3-6 Linear relationship of the cathodic(a)and anodic(b)peak current(Ip)versus scan rate (V)for Ti02／Hb／CILE in pH 7．0 PBS 对于薄层电化学行为，电活性的 heme Fe(III)在负向扫描时被还原为 heme Fe(II)，而在反扫过程中电活性的 heme Fe(II)又被氧化为 heme Fe(III)。在扫速 100,600 mV／s 范围内氧化还原峰电流随扫速的增加而线性增加，但是积分电量 35 加 竹 0 ∞ 加 ∞ ． 盖／dH氧化还原蛋白质在离子液体／纳米材料复合体系中的直接电化学 基本不变。根据公式：Q=nAFF*，式中 Q 为积分电量，A 为电极表观面积，F 为法拉第常数，n 为电极反应电子转移数，r 宰为电活性物质的表面覆盖度，由 此公式可以求得 r}为 3．05x10 毋 mol／cm2，这比文献报道值要大【6l。 -0．07 -0．14 ／． 、幽 殳-0．21 ∽ ∞ o-0．28 & 盆 岫．0．35 旬．42 -2．5 -2．0 ．1．5 ．1．0 -0．5 logV(V／s) a b 图 3-7 氧化峰电位(a)和还原峰电位(b)与扫速的对数 logv 之间的关系 Fig． The relationship of the anodic(Epc) 3-7 ‘and cathodic(Epa)peak potential against logv 图 3-7 是氧化峰与还原峰峰电位与扫速的线性关系曲线，根据准可逆薄层 电化学过程的 Laviron[7,s]公式， epc 圳‘一筹 1。91， (1) 劬=^而 2．3 丽 RT 1。91， (2) logt=tzlog”仅)+(删哪-，zl，1，og 丽 RZ．TjK 一』紫， ㈣气、 由图中的线性方程 Epa(V)=0．058 logv．0．036(n=12，7=0．992)和 Epc (V)--0．065 logv-0．428(n=12，7=0．995)，由方程(1)和(2)可以求得电子转移数 11 =O．87，电子传递系数 a=O．469，说明能垒基本对称，符合准可逆过程的特征， 根据公式(3)可计算得出反应速率常数氟=0．635 S。1。 3．2．5 pH 对 Hb 电化学响应的影响 研究了不同 pH 值的缓冲溶液对 m 薄膜修饰电极的电化学行为的影响。随 着溶液 pH 值增大，修饰电极的氧化还原峰电位均负移。在 5．5～10．0pH 范围内， Hb 的电化学行为都表现为稳定的准可逆过程，且式电位(Eo．)与 pH 值呈良好线 36青岛科技大学研究生学位论文 性关系，结果如图 3-8 所示，其方程的斜率为 41．4 mV／pH。这比 25&C 可逆体系 的理论值．59 mV／pH 稍小，原因可能是质子化作用不是简单过程，而受血红素 轴向配位基团和水合铁离子质子化作用的共同影响【9】 。但仍可以肯定 Hb 在该修 饰电极上发生一个电子传递的同时还伴随着一个质子的转移【101，其反应方程式 如下【11】 ： Hb Fe(III)+If+e-毒 Hb Fe(II) ， ‘、 山 o (，) ∞& & ’ 、 石 l=U pH 图 3-8 式电位(Eo．)与缓冲溶液 pH 的关系曲线 Fig．3-8 Linear relationship of buffer pH versus the formal potential(EoI) 3．2．6 电极的稳定性 考察了 Hb 修饰电极的稳定性，实验结果表明该修饰电极在连续扫描}