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血液的Raman光谱和荧光光谱几种新现象研究 ...
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血液的Raman光谱和荧光光谱几种新现象研究
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流式荧光染料――蓝色激光（488nm）激发篇
荧光素名称
激发光 (nm)
最大发射光 (nm)
相对荧光强度
(1 为最低,
FITC (Fluorescein Isothiocyanate)
推荐使用：530/30 带通滤片
也可以用于荧光显微镜
Alexa Fluor& 488
推荐使用：530/30 带通滤片
光稳定性好，用于荧光显微镜的更好选择
R-PE (R-Phycoerythrin)
推荐使用： 575/26 带通滤片
适用于低表达抗原的流式检测
适用于荧光显微镜，但容易淬灭（流式检测不受影响）
PE-eFluor& 610
推荐使用： 610/20 带通滤片
用于替代PE-Texas Red&，荧光更强
PE-Cyanine 5
推荐使用： 670/14带通滤片
与APC同时使用时干扰很大，此时可用PE-Cyanine 5.5替代
PE-Cyanine 5.5
(PE-Cy5.5)
推荐使用： 695/40带通滤片
可以与APC一起使用
PerCP-Cyanine 5.5
(PerCP-Cy5.5)
推荐使用： 695/40带通滤片
可以与APC一起使用
PerCP-eFluor& 710
推荐使用： 710/50带通滤片
可以与APC一起使用，亮度是PerCP-Cyanine 5.5的2~3倍
PE-Cyanine 7
推荐使用： 780/60带通滤片
与常用荧光素的补偿较小
推荐使用： 670/14带通滤片
选择性结合DNA的GC区
用于死活细胞鉴定
Propidium Iodide (PI)
推荐使用： 575/26带通滤片
DNA嵌入性染料
用于死活细胞鉴定
文章来源：
相关自主发布奥林巴斯荧光显微镜使用方法
&&发布者：admin&
这里将以奥林巴斯和BX43荧光显微镜为例，来做分析。
System Microscope BX53
奥林巴斯和尼康的三波段激发的荧光滤光片组合包括两个很精确的平衡组合(DAPI-FITC-TRITC和DAPI-FITC-Texas Red)，每个组合包括三个带通的发射区域，可以选择性的通过蓝色、绿色、黄色、橙色和红色光谱区的激发光。这样的相互辅助作用就可以探究激发滤光片和发射滤光片光谱以及多色反光镜的激发和发射滤光片的改变(为在紫外、蓝光和绿光区的多色荧光标记设计的三波段激发光组合)是如何影响信号级别、光谱交叉、整体滤光性能和图像对比度的。
DAPI-FITC-TRITC&这个滤光片组合的设计是用来同时检测DAPI, FITC和TRITC或者其他具有相似光谱的荧光探针。三个窄带激发和发射波段是紫外激发光的特定区和相对应的蓝色发射光，蓝色激发光对应的绿色发射光，以及绿色激发光和相对应的橙色-红色发射光。
DAPI-FITC-Texas Red&与标准的DAPI-FITC-TRITC组合相比，这个滤光片组合的设计初衷是为了观察紫外激发-蓝色发射的带通区，和蓝色激发-绿色发射的带通区之间的细微变化。这个设计是为了更好的与Texas Red所需的更大的激发和发射波长结合。多带通区域提供了最佳的探测条件，最小的光谱交叉和噪声，可以同时观察DAPI, FITC和Texas Red，或者具有相似波长的荧光探针组合。
奥林巴斯使用方法
首先是随即选择的荧光标本出现在Specimen Image窗口，同时紫外-蓝光-绿光的三带通激发光滤光片组合(DAPI-FITC-TRITC)的光谱特征显示在&滤光片组合&(Filter Set Spectral Profiles)栏下。通过选择在&光谱交叉部分&(Spectral Cross Sections)下合适的check box(Absorption或Emission)，荧光的吸收和发射光谱交叉的部分(滤光片投射带通的重叠部分)就可以单一或者一起观察了。当一个或者多个check box被激活时，组合的滤光片传送和发射光谱会附加在用于标本荧光观察的吸收和发射光谱(不包括自发荧光的植物标本)上。荧光吸收光谱在辅助区时用褐色填充的，而在相应的发射光光谱区用灰色填充的。滤光片组合的波长特征以较低的位置展示在黑色的长方形box内。这些数值常常根据滑块从左到右转换而更新。
为了操作这个辅助部分，使用Filter Set滑块可以将三带宽激发的两个滤光片组合相互转换。因为滑块是由左至右滑动的，所以激发光和阻挡滤光片以及多色反光镜的光谱会同时转换。值得注意的是，持续转换光谱并不意味着任何的滤光片组合都是可能的，也不意味单一的滤光片组合的光谱可以随意改变。在选择的滤光片组合中改变光谱范围很简单，有助于在每一个光学模块中的滤光片组合建立联系。
单一的滤光光谱(激发光，发射光和多色反光镜)可以通过选择和去除Filter Set Spectral Profiles下相应的check box来添加和删除。除此之外，荧光的吸收和发射光谱可以通过同样的操作添加和删除(Spectral Cross Sections)。观察样本的图像会随着滤光片的转换而改变，反应出信号强度和对比度的变化;而这种变化是由滑块移动引起滤光片组合产生的。一个新的目标样本可以通过Choose A Specimen的下拉菜单随时进行，而用于观察的荧光种类就列在下拉菜单中。在任何情况下，样本都经过两种或者多种荧光探针的染色，通过选择的宽窄的带通阻挡滤光片组合来观察。
奥林巴斯荧光显微镜详细介绍
奥林巴斯和尼康的三波段荧光组合主要是为特定的三色荧光组合观察而设计的，而且他们在相似的吸收和发射光谱的其他探针组合中同样有效的观察。利用精确的波段选择，和在反射与传递区的极速转换，多种的激发和发射信号可以在最低的干涉条件下区分开来。为了保持三个不同荧光信号波段的稳定性，这些特制的滤光片组合也可以将多带通特性和多色反光镜结合，这样与特定激发和发射滤光片互补的传递和发射区就可以使用了。每一个尼康的三波段荧光组合都为DAPI、FITC和TRITC优化设计。与这些荧光组合的相关光谱区的范围由紫外激发和蓝光发射到绿光激发和红光发色区域。
奥林巴斯和尼康DAPI-FITC-TRITC的三波段滤光片组合一个为紫外区域激发光(385到400nm)设计的激发滤光片结合，这个激发光滤光片伴有一个带通发射滤光片在它最初的信号波段内传递蓝色荧光(450到465nm)。这个滤光片的第二个激发-发射波长组合使蓝光在475-490nm这么窄的波长范围内激发，在505-535nm探测到绿色荧光。第三个荧光信号由绿光区域激发光产生(nm)，这可以引起橙色-红色光发射，探测到580-620nm的波长。这个组合的三色荧光波段可以同时优化DAPI, FITC和RITC组合。尤其是对不同的细胞成分观察时;DAPI, FITC, and TRITC的荧光组合也适合这个滤光片组合使用，这是因为Alexa Fluor 488和MitoTracker Red CMXRos的光谱特性与FITC和RITC的光谱特性相似的缘故。
在三色激发模块中，与在其他的多波段组合一样，多色反光镜的设计原则是以分开不同荧光信号为基础的，还可以检测到最小的光谱交叉(spectral bleedthrough)和噪声。与长分光光束器常用于传统的滤光片组合相反的是，多波段组合中使用有几个带通的区域的多色反光镜。典型的是，第一个反光镜的cut-on波长值就在短波长激发光峰值上几纳米处，接着是极速的cut-off，这样可以允许第二个激发波段通过。在三波段滤光片组合中，这个传递-反光模式可以在第三个信号通道中再次重复。在DAPI-FITC-TRITC模式中使用的二色反光镜有多带通传递区域。这些cut-on的波长位于435, 500和570nm。
在多波段滤光片组合中应用薄片干涉技术的应用使各荧光信号水平得到平衡，这样可以得到最佳的成像效果。在很多滤光片组合中，短波长激发峰值的传递会降低以平衡两个或者三个发射信号，还可以是光漂白和对样本的毒害降到最低。这一点在为在紫外光谱区有单一荧光激发设计的滤光片组合中尤为重要，因为它可以使较短波长获得高的激发效率。短波长激发峰的密度的显著下降在尼康三波段组合中的传递光谱区域均有体现;也可以通过检测滤光片组合传递光谱区域获得同样的结果。举例来讲，双波段的FITC-Texas Red和三波段的DAPI-FITC-Texas Red组合利用同样的双色反光镜和发射光滤光片，仅仅在激发光滤光片部分有差别，在这两组滤光片组合中第三个短波带通添加到DAPI激发模式下。
要想同时检测DAPI, FITC和Texas Red(或相似谱区的荧光)，利用DAPI-FITC-Texas Red三激发波段滤光片组合很容易的观察到。紫外激发、蓝色发射光滤光片波段和蓝色激发、绿色发射波段(分别对应于DAPI和FITC)与DAPI-FITC-TRITC组合有类似的特性，但是与TRITC相比，它们的绿色激发红色发射在更长的波段发生。这个组合中使用的激发滤光片一个带通区为395-410nm，发射滤光片的带通区为450-470nm，这些波段适宜DAPI和相似荧光基团观察中使用。第二个波段的激发光在蓝色波长范围490-505nm，检测对应的绿光发射范围在515-545nm(用于FITC及相似荧光基团观察)。Texas Red荧光的信号通道最佳的激发光范围在560-580nm，发射波段是在红光区域的600-650nm处。
虽然DAPI, FITC和Texas Red的三波段组合已经达到最佳，但是形同的吸收和发射光谱特性的荧光探针也可以用这个滤光片组合观察。跟DAPI-FITC-Texas Red 模块相比，DAPI-FITC-TRITC模块，具有红色发射光带通可以在较短波长观察情况下调整15nm，产生的图像颜色更偏橙色。DAPI-FITC-Texas Re滤光片组合中的双色反光镜(分束器)的带通区根据激发和发射光滤光片的窗口在445，510和590nm时定位。奥林巴斯显微镜荧光激发块
&&发布者：admin&
&在生命科学领域，随着科研水平和实验手段不断的提高，荧光染色方法以其特异性强，使用相对于放射性元素更安全，检测越来越灵敏等特点，受到越来越多的研究人员的认可，并且在实验室中广泛应用，成为经常性的实验方法。检测荧光方法和手段根据不同的实验要求和目的也多种多样，使用最多的还是荧光显微镜，荧光酶标仪，流式细胞仪等。但是，无论何种仪器，无论仪器的性能如何，要得到准确的实验结果，准确的实验数据，最基本的条件就是根据所使用的荧光染料正确设置激发和发射波长。奥林巴斯显微镜荧光激发块下面我们以荧光显微镜的荧光滤色镜为例，介绍一下滤色镜组的构造以及根据染料，如何正确选择滤色片。荧光激发块是荧光显微镜中用来激发荧光标本和观察荧光的核心部件，它实际是滤色片的组合，一般含有3种滤色片:1. 激发滤色片（Exciter Filter）：选择透过某个波段的光，来激发荧光染料。2. 分色镜 （Dichroic Mirror）：反射激发光，透过荧光，一般激发光波长短，而发射光波长较长。3. 发射滤色片(Barrier Filter) ：透过发射光，也就是我们看到的&荧光&。同时阻挡各种杂散光和激发光的反射光。 奥林巴斯显微镜荧光激发块根据荧光观察的原理&荧光染料吸收特定波长的光（即激发光），跃迁到激发态，然后再释放出特定波长的发射光（即荧光），回到基态。由此可知荧光染料所需的激发光和释放的荧光都是特定波长的，所以需要利用各种滤色片来选择性的透过某种特定波长的光来实现荧光观察。否则，就会出现激发不了，激发了却看不到或串色的现象。所以选择合适的滤色片非常重要！下面我们以荧光染料DAPI为例，阐述该如何选择荧光激发块。 通过上图，我们可以了解到DAPI的激发光波长为300nm-410nm左右，激发峰值在360nm左右，也就是说激发光在300-410nm时可以激发DAPI染料，在360nm时激发效率最高。发射光波长为390nm-600nm，峰值在470nm左右。接着，我们就根据这些数据来选择滤色片。 上图为Olympus U-FUW激发块的光谱信息。我们可以了解到此激发块可以提供的激发光波长在300-400nm之间，刚好可以激发DAPI。允许透过的荧光光谱范围也在410nm以上，所以此激发块可以用来实现DAPI荧光染料的观察。让我们再来看一个激发块的光谱图： 上图为olympus U-FGW激发块的光谱信息，可以看出此激发块可以提供的激发光在530-560nm左右，允许透过的荧光光谱范围在570nm以上，所以此激发块并不适合DAPI激发。如果用此激发块来做DAPI的观察，就会出现看不到荧光的现象。可见，要选择合适的荧光激发块，我们首先要知道荧光染料激发和发射光的波长特性和激发块光谱的各项数据。但是，荧光染料和滤色片的种类非常多，用户往往没有渠道来获取这些信息。在实际实验中使用荧光显微镜时，因为荧光激发块配置错误而得不到好的观察效果的现象经常发生，对于用户来说是一件非常烦恼的事。为了方便用户正确选择激发和发射波长，节省时间，日本理化研究所脑科学所－奥林巴斯合作中心开发了软件Spectrum Manager。用户选择荧光染料，软件会给出染料的光谱信息和推荐的滤色片选择等信息，使用非常方便。 还可利用Data Manager自行对光源信息、染料数据库或滤色片信息进行更新。 奥林巴斯显微镜荧光激发块此款软件已经整合至奥林巴斯共聚焦显微镜的一款软件中，发布以来得到了用户非常好的反响。由于是针对共聚焦显微镜的软件，所以软件中仅提供了激光光源谱线。如果您有需要，也可以将汞灯和氙灯光源信息导入至软件。以下提供普通荧光显微镜常用的汞灯和氙灯光源的图谱，供大家参考。 汞灯在313, 334, 365, 406, 435, 546, 578nm有比较好的激发峰。 氙灯在可见光光谱范围内强度更稳定（没有像汞灯那样的光谱峰值），在红外波段比汞灯强度高。但在紫外波段有一定的缺陷性。所以选择光源时，光源特性一定要与我们的具体应用相匹配。 &奥林巴斯显微镜荧光激发块规格名称激发光波长（颜色）发射光波长（颜色）二次分光波长（颜色）带宽通道类型U-MWU2330-385不可见420蓝色400紫色宽一U-MNU2360-370不可见420蓝色400紫色窄U-MNV2400-410紫蓝色455蓝色455蓝色窄U-MWBV2400-440蓝紫色475蓝色455蓝色宽U-MNBV2420-440蓝色475蓝色455蓝色窄U-MWB2460-490蓝色520IF绿色500绿色宽U-MNB2470-490蓝色520IF绿色500绿色窄U-MSWB2420-440蓝色475蓝色455蓝色超宽U-MWIB2460-490蓝绿色510IF绿色505绿色宽U-MWG2510-550绿色590绿色570绿色宽U-MNG2530-550绿色590绿色570绿色窄U-MSWG2480-550绿色590绿色570绿色超宽U-MWIG2520-550绿色580IF绿色565绿色宽U-MWIY2545-580绿色610IF红色600红色宽U-MNUA2360-370不可见420-460蓝色400紫色窄U-MWIBA2460-490蓝色510-550绿色505绿色宽U-MNIBA2470-490蓝色510-550绿色505绿色窄U-MGFPHQ460-480HQ蓝色495-540HQ绿色485蓝色&双U-MYFPHQ490-500HQ蓝绿色515-560HQ绿色505绿色&U-MCFPHQ425-445HQ蓝色460-510HQ蓝绿色450蓝色&&}