2.&每个盘中加入 2.1 ml 甘氨酸溶液（浓度为 2M），轻柔振荡混匀，室温孵育 5min，终止交联反应。加入甘氨酸后，培养基的颜色会发生改变。
3.&吸出所有上清，并用 PBS 清洗细胞一次。
4.&用细胞刮收集细胞到 50ml 细胞离心管中。
5加入预冷 PBS 至终体积为 40ml，并用细胞计数板计算管内细胞数量。
6.<span style="mso-spacerun: 'yes'; font-family: 宋体; font-size: 9.g 10 min 离心收集交联的细胞。
7.尽可能干净的去除上清液。
8.制备完成的细胞用液氮速冻，并用干冰寄送。
1.&室温 300g 离心 10min 收集悬浮的细胞。
2.&弃上清。
3.&加入 40ml 无血清细胞培养基，再加入 1.12ml 37%甲醛使终浓度为 1%，加入甲醛后迅速轻柔颠倒摇匀（可根据培养基的体积调整，保证甲醛终浓度为 1%即可）。加入甲醛后，培养基的颜色会发生改变。
4.&室温精确孵育 10 min，保持轻柔颠倒摇匀。
5.&一次性快速加入 4.2 ml 的 2 M 甘氨酸，终止交联，混匀。加入甘氨酸后，培养基的颜色会发生改变。
6.&室温孵育 5min 以彻底中止反应。
7.&<span style="mso-spacerun: 'yes'; font-family: 宋体; font-size: 9.g 离心 10 min，收集交联的细胞。
8.&加入预冷 PBS 至终体积为 40ml，并用细胞计数板计算管内细胞数量。
9.&<span style="mso-spacerun: 'yes'; font-family: 宋体; font-size: 9.g 离心 10 min，收集交联的细胞，尽可能干净的去除上清液。
10.&制备完成的细胞用液氮速冻，并用干冰寄送。
1.2 染色质免疫共沉淀测序研究内容&
ChIP 与高通量测序的结合（ChIP-Seq）可以在全基因组范围内对蛋白质结合位点进行高效而准确地筛选与鉴定，广泛应用于组蛋白修饰、转录因子调控等相关领域的研究。通过富集 peak 检测，研究转录因子、RNA
聚合酶或其它蛋白在基因组上结合位点及其相关基因。提取 peak 区域的序列，寻找结合位点的 motif，并对 peak 进行基因、CpG 岛、GO 和 KEGG 等注释和分析。对于多个样品，可进行差异分析；用于组蛋白修饰的表观遗传学研究。通过不同的特异性抗体检测 DNA 链的某一位置会出现何种组蛋白修饰，以及组蛋白修饰与基因表达的关系。
因表达起始于多种蛋白因子结合于特异的非编码 DNA 序列，非编码区域的主要研究方向之一即是&
Motif 研究。基因表达调控机制研究是生物学研究的重点内容，鉴定 DNA 调控元件尤其是 DNA Motif，对于基因表达调控机制研究具有重要意义。&您现在的位置：>>> 正文
ChIP-Seq 遇见的那些事
& & & & & & & & & & & & & ChIP-Seq 遇见的那些事1.怎么判断抗体满足ChIP要求？通常每个公司的抗体说明都标有级别（grade），ChIP级。如果没有，通常的规则是ChIP-PCR分析阳性control是阴性control的5倍以上的抗体认为是到达了ChIP级。2.如果没有商业化的kit怎么办？表达的表位标记的蛋白也可以。最经常使用的标签包括HA，Flag，Myc和V5。除了表位的抗体，所述靶蛋白也可以标记有生物素受体序列，其可以与生物素经由生物素连接酶在体内或体外进行标记。&3.多少细胞数合适？10^6到10^7个细胞才能保证最终得到10到100ng ChIPed DNA。一般10^6可以满足高丰度蛋白（如RNA polymerase II）和局部组蛋白修饰（如H3K4me3）的ChIP。如果是低丰度的转录因子蛋白和其他组蛋白修饰则需要10^7个细胞。&4.用什么作为Control？关于control是问得最多，也是最困惑的一个问题。&不推荐IgG，原因是：第一，大多数的IgG抗体不是来源于转录因子或特定组蛋白抗体同一动物的免疫前血清。第二，IgG通常pull down非常少的DNA，这样导致在后期的建库过程中PCR Cycles 数增加，导致不能达到作为control去除背景噪音的目的（会缺失和放大部分信息）。&因此比较而言，Input更适合作为control。首先Input的建库量够，这样建库过程不需要over-amplifed，bias小。其次，最后测序得到的数据更均匀，以及全基因组覆盖度会更好。有人提到deletion 或者 RNAi knockdown目标转录因子的细胞同时做ChIP-Seq作为control更好。&5.是否需要生物重复？&有人建议需要生物重复，但是从目前我经历的项目来看，生物重复性不太好。还有人推荐用不同公司的抗体来做生物重复，这就需要考虑到经费的问题。6.关于超声处理超声没有什么特别的，需要注意的是超声处理在含有SDS的缓冲液中可能会破坏蛋白质－蛋白质和蛋白质－DNA相互作用。但是含有SDS的缓冲液能增加超声的效率，适应与DNA紧密结合的转录因子的ChIP-Seq。最近遇到一个老师，他的项目是一个转录因子跟不同的Parters蛋白结合，再binding到相关的区域，行使调控功能。这种情况就不建议用含有SDS的缓冲液了。&7.交给Vendor后是否万事大吉？这里还提些数据分析过程中需要注意的问题。需要多少数据量？大部分人认为20 Mb 是个比较适合选择。&Call peak不同软件各有优势。&Peak&类型适合项目工具大（Broad）组蛋白CCAT,SICER小（Sharp）转录因子MACS大和小（Sharp&Broad）&ZINBA需要注意的是重复区域的peaks可能被忽视，原因是在前期的数据处理过程中，mapped到不同位置的reads被丢掉，而这些reads大部分是因为比对到重复区域。另外一个问题是怎么比较不同细胞和不同条件下ChIP后测序得到的数据。ChIP条件的不同，背景噪音也不同，加上测序系统误差，所以需要均一（normalization）的软件在样本比较前对数据进行预处理。最近有个工具DIME可以处理这个问题。
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ChIP & ChIP-Seq实验原理与成功要素及NGS测序数据分析解读
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ChIP & ChIP-Seq实验原理与成功要素及NGS测序数据分析解读
染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是用于检测细胞核天然染色质结构内的蛋白质与DNA之间相互作用的通用经典技术。近些年来NGS测序技术快速发展，基于NGS测序技术的ChIP-Seq测序分析为用户提供了蛋白质/DNA相互作用的高分辨率基因组范围视图，这是使用实时PCR分析无法实现的。ChIP-seq测序分析因此成为一种适合研究正常发育过程中或病理状态下发生的表观遗传变化的强大技术。
本次研讨会主要内容包括：
1.ChIP和ChIP seq的区别和应用范围；
2.ChIP和ChIP seq 实验的操作步骤和成功要素；
3.酶解和超声的优缺点及如何正确选择；
4.如何选择合适的用于ChIP和ChIP seq的抗体；
5.CST 标准 DNA文库建立方法及ChIP-Seq测序数据分析解读
陈芳 博士，CST ChIP 研发科学家
: 中科院上海生命科学研究院 博士
: Post-Doc Yale University
: Associate Research Scientist
Yale University
现任Cell Signaling Technology美国总公司ChIP 研发科学家，陈芳博士具有8年以上ChIP技术应用经验，对植物材料，癌细胞，动物组织等各种材料的ChIP都具有直接的经验。曾在PNAS, Plant Cell等杂志以第一作者身份发表ChIP或ChIP-seq相关文章多篇。目前负责各种ChIP试剂盒，ChIP和ChIP-Seq抗体产品的开发，并活跃于客户服务和技术支持等各项工作，在ChIP技术领域积累了丰富的直接或间接研究经验及产品知识，希望能为广大科研工作者提供帮助。
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