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【求助】求各位前辈看看我的WB问题在哪，为什么总有杂带。
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这个帖子发布于2年零122天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
操作：收集培养皿内细胞，PBS洗2次，用RIPA裂解细胞，冰上10min，加loading buffer 煮蛋白10min。上样量40ul。100V电泳至指示带到胶边缘。300mA 2h转膜。转膜后预染marker清晰，胶上无残留。TBST洗膜5min，用5%脱脂牛奶室温封闭3h以上。TBST洗膜5min。一抗是milipore的 β-cantenin
（1:500 5ml
用5%BSA稀释）
4度过夜（12h以上）。用TBST洗膜4*10min。二抗是santa 的抗鼠（1:5000
用5%脱脂牛奶稀释）
室温1h。用TBST洗膜3*15min。Thermo的ELC，发光2min（这一步我特意改到暗室里加，当时加到膜上没看到荧光，大概过了半分钟，看到最右边 出现荧光，那一道是我加的公司送的marker,5ul）压片10min，显影定影后，除了MARKER，其他的带都比较浅，所以我有压了一张，过夜了，大概8h。就是上面这张。我的目的条带大概92kDa.RT，杂带太多了，只在100kDa附近看到弱弱的条带，应该不是特异性的。请问可能是什么问题，怎么解决呢。我们实验室才组建，体系还没建起来。做不出来急人啊。另外想请问一下，TBST对实验影响大么，因为我们的pH计没法校准了，每次配TBST都是按照经验加1.3ml 盐酸。（TBST配方：3g Tris
0.2g KCl 溶于800ml 灭菌水，加1.3ml盐酸，定容到1L，再加500ul tween20）
不知道邀请谁？试试他们
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你这是收集细胞，提取蛋白进行WB的吧，孵育时间太长，洗涤不充分，每次最好洗5min最少两次（震动下洗涤）抗体可以一起加入4度过夜或者轻微震动60min都可，洗的话，时间不需10min3次，每次6 7分钟就可以（大于5min），marker上样量多了，其实你的这个结果也不错，至少可以判断出来有没有，就是各个步骤时间什么的可能有点问题吧，优化一下应该就可以了，可以看两篇资料吧
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请问，你的问题解决了吗？我是用DAB显色，结果和你的差不多，都有好多条带二抗已经稀释过了还是不行，我都是孵育1h的求交流
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一抗12h不算长吧；我在孵育完一抗和二抗之后洗涤时间都挺长的；那个marker是多了，现在我不加了，只加预染marker。谢谢你了！
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关于丁香园新人想问一下70假紫是除了ss最好的矛的说法【dnf战斗法师吧】_百度贴吧
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新人想问一下70假紫是除了ss最好的矛的说法
在下新人一枚，上次在贴吧看到有人说70假紫矛是除了纯白最好的武器（大概是这个意思），但是洗了1000w也没出，后来想想也想不通，70假紫为什么比65粉好。65粉暗属性还有霸体，价格也不太贵。假紫洗出来价格逆天了而且我试了试出了毁击的也没什么亮点，白字也不缺，80连有冰冻者之魂配合还是很简单的。强击貌似还和装备有冲突...再说高强，65粉红字绝对是一个优势，假紫强打红字太贵，强击的冲突，高强起来也效果高不了多少，如果13以上火矛（火矛灼伤还是挺容易出的）和笛子（虽然笛子是棍子）也比的上假紫了。况且假紫的成本要高那么多，如果用同样多的钱，65粉+10了估计假紫也没成型。我没有冒犯各位前辈的意思，只是想问一下70假紫比好在哪儿，性价比如何
2017超火的三国策略游《极速体验入口》
果然。。误导作用来了
70假紫要找好属性，一般都是在拍卖上搜，看运气，而且已经有高强了的就不用考虑假紫了
求各位前辈赐教
果然……那种帖子应该先声明什么的……
和强击有冲突的装备都可以被替代。南非狮强击的双s假紫确实伤害不会低，但是攻击范围独立什么的有些蛋疼
马超兄真是伟大
误导真是害死人
奶奶的 假紫是啥·······菜 B求解释啊
开局只有5个农民,从荒岛到创造家园！
那些，果然不应该给新人看得。完全是误导。
那天我说是误导还有人出来骂娘-_-
难道是假的?
我在国服PK
拿 70紫 4300攻。
65粉 4700攻。
可以说明问题吗。
不是一个叫什么马发的帖子么……纯属误导小孩和咯应吧里神豪的
粉之所以是粉是有原因的，不可能被个什么紫比过去。少年不要被误导
强化是个很基本的差距亲
高强假紫最坑了
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求各位前辈指点，这两个台锯相比哪个稍好点
一个是宁乾的，就算是精诚的吧。JTS250 IID，另一个是易可的台锯，就淘宝的那个1750的。现在没多的资金预算，这两个机器哪个好一点值得购入，请各位大神指点指点，本人刚入坑小白一个。多谢多谢！
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15:10 上传
22222.JPG (20.77 KB, 下载次数: 15)
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唉，当时我也犹豫这两台，担心花了钱，又不好，又看牧田，博世，得伟，越看越好，只是玩玩，三四千，这些都是小型的，四千不是有又有什么中型的，最后感觉代价高了点！直到现在没下手！
唉，当时我也犹豫这两台，担心花了钱，又不好，又看牧田，博世，得伟，越看越好，只是玩玩，三四千，这些都 ...
兄台现在买了没有?
都是谁买谁悔的货。。。。要么多花点钱，买台好点的。要么电圆锯倒装（扰民的声音），把钱省了。
要么买个贵的，要么就倒装。
头像被屏蔽
我是来挣刨花的
都是谁买谁悔的货。。。。要么多花点钱，买台好点的。要么电圆锯倒装（扰民的声音），把钱省了。
其实我倒装了一个，只是看着赤裸裸的锯片总担心安全问题，每次用的时候都有点怕啊
要么买个贵的，要么就倒装。
大哥能给个建议不？
我是来挣刨花的
顺便指导下呗
精诚吧，虽粗糙点，但能干点活。要是预算少就别买了，还是电圆锯加轨道有用，精确用途广。
精诚吧，虽粗糙点，但能干点活。要是预算少就别买了，还是电圆锯加轨道有用，精确用途广。
电圆锯加导轨吗？也想过，靠山不好买啊
本帖最后由 danmo2009 于
16:42 编辑
凡是大件的货，性价比高的，绝对是贵的。老话说得好，人不识货，钱识货。
像台剧这种大件货，买贵了，买好了。用得舒服。以后不用，转手容易。
买到垃圾，用得闹心。卖又不好卖。别人买了你的废铁，又得罪人。有时你卖又卖不掉。白花花的几千块丢角落吃灰。让人想死的心都有。再者，你还没卖过大件货，那打包打架子是一整天的苦逼活。本来转手亏钱。这不是折磨人是什么？
按我说，你要买台锯。.&&4千块是等论坛前辈更新转手的。比如九哥上次出的那钢市（不知道出了没有），九哥的人品就不用提了吧，东西好就好，差就差。不坑你。
5000左右的预算可以买新货。具体什么牌子自己看好下手。运气好你能碰到海威的1代小金刚。（2手的）
8000可以买新的二代小金刚。
个人认为，作为新手，在黑市等转手的货比较好。拍下前先了解出货人的人品。可以避免被坑买到瑕疵品。首先是便宜，第二，新手容易犯三分热情这种毒。那么再转手，可以把损失降到最低。
意见中肯，让我又有点动了念头啊
买吧，就当纯练手了。 买个夏利回去只能学开车，离开赛车差的太多了。可是上来买赛车又太tm贵的没谱了，所以还是得先从头开始买，胖子是一口一口吃出来的。
必须有一样
不以此谋生的工作
京公网安备
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本人初恋，不太了解女生的心思，求助各位前辈，帮忙看下我女朋友到底是咋了
她还未成年,她一开始是因为前男友太伤她心了,遇到我她就和他提出分了,以前分过好几次吧,我对她很好,她说早点遇见我就好了,出去第一次玩她很伤心的告诉我她不是CN了,是前男友在她喝酒情况下强迫的,我当时不在乎,以后也没在过多提起,因为我知道不是她的错,因为她...
我有更好的答案
但你却不得不，也应该思考一下你们的前途在哪里。你坚持多久都没用，耗尽所有的感情和精力，之后成功率其实微乎其微。首先，这样是不能长久的。你能改变她吗，你是不是对她太好了。也没必要。去找别的芳草吧，真的，怜爱什么都代表不了，只能表明她的一种状态，之后激发你的爱心？一切都可以容忍是不可以的。这不是你能不能做到的问题，让人怜爱。于是你就被蒙蔽了初恋总是让人全身心地投入？不要妄想了，她能吸引住你，自然是有她的道理的，很重要的一点是因为她柔弱，去保护她。我很佩服你的毅力，可以肯定作为你 已经做得很好了，还是要看她怎样想。最后的建议，她的每一点温存，你所努力争取来的，只有一点，是当局者迷吧，但也是不怎么样的。这样说很伤人，而是原则性的问题，它会关系到之后的交往啊。我想说，她的人品在如此的反复之后已经无疑了，不是不好，没有必要再无语于她有没有联系前男友，她就是这样的女子，人格还不健全，可确实是如此。一个糊里糊涂之后对你也没有拿出真心去爱你的“女友”，没有多少前途的。其次。离开吧，渐渐少打点电话，坚持对她好
采纳率：40%
人生要学会放弃一些东西，这样的人生才可以说是完美的，很多我们擦身而过的感情，东西 我们必须要放弃的，不然 伤害到的不是你自己 而是双方
我只能说你内心太强大了，你是初恋，你不应该遇到她的，羡慕她，同时觉得这对你不公平
擦，感情问题果断点撒，分了吧。
她有那样的事，应该是对男的有恨意了。虽然她知道你爱她，对她好。她可能还是担心这暂时的好是否可以代表永远。以后你会不会因为她的那些事又把她给抛弃了。她可能还在挣扎中…
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不是说做单页静态网站比较容易被百度收录吗，怎么我的网站到现在百度都还不收录呢，是不是哪里出问题呢？我做的是一个彩票网站;,各位前辈能不能帮我看一下，不胜感激。还有要怎么做才会被百度快速收录。
11-02-06 &
多了解一下seo,注意网站内容的原创性和多做些外链就Ok，我的单页网站首页当天就收录了&呵呵。。。
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