重组HPV16 E7，11E7，6E7蛋白的克隆、表达、纯化及理化性质的检测--《山西医科大学》2007年硕士论文
重组HPV16 E7，11E7，6E7蛋白的克隆、表达、纯化及理化性质的检测
【摘要】：
目的构建PET30a(+)HPV16 E7,PET30a(+)HPV6 E7,PET30a(+)HPV11 E7的原核表达载体,并对PET30a(+)HPV16 E7进行表达纯化及理化性质的检测。为HPV体外检测试剂的研制提供相应的技术平台。
方法收集人病变子宫颈组织标本,提取基因组,根据已知的基因序列设计引物,然后经PCR扩增从中筛选出16型、6型和11型HPV阳性的标本。回收HPV16 E7,HPV6E7,HPV11 E7的基因片段。构建PET30a(+)HPV16 E7,PET30a(+)HPV6 E7,PET30a(+)HPV11 E7的原核表达重组质粒。用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列测定对重组质粒DNA进行鉴定,将序列正确的重组质粒转入工程菌E.coli BL21(DE 3)进行诱导以表达相应蛋白。通过调节IPTG诱导浓度及诱导表达的时间以优化表达条件。使用AKTK纯化设备,通过硫酸铵沉淀、阴离子交换和带组氨酸标记的亲和层析等方法对重组蛋白HPV16E7进行了纯化、回收重组HPV16 E7蛋白。Lowry法测定重组融合蛋白的浓度。用紫外分光光度计对重组融合蛋白进行紫外全波长扫描。SDS-PAGE电泳及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性。
结果PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7,HPV6E7蛋白得到高效原核表达,其中HPV16 E7在37℃,0.8mM IPTG的条件下主要以胞内可溶性表达。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换和组氨酸标记的亲和层析等方法对重组蛋白HPV16E7进行了纯化,得到纯化的目的蛋白。理化特性的研究结果显示:带有6个组氨酸标签的HPV16 E7蛋白的表观分子量大小为20KD,紫外吸收扫描图谱显示在280nm处有最大吸收峰。Lowry法测定纯化后的含his标签的HPV16E7重组蛋白浓度为0.89mg/ml。经Western Blot检测表明HPV16 E7蛋白有良好的免疫原性,带有六个组氨酸标签的HPV11E7蛋白和HPV6 E7蛋白的表观分子量大小为16KD。
结论pET30a(+)16 E7、pET30a(+)HPV11 E7和pET30a(+)HPV6 E7重组原核表达载体构建成功,HPV16 E7、HPV11E7和HPV6E7获得高效原核表达。得到纯化的HPV16E7目的蛋白。为进一步研制HPV体外检测试剂奠定了基础。
【学位授予单位】：山西医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2007【分类号】：Q78
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推荐hpv和tct都要做吗？
年龄：29岁
病情描述及疑问：推荐hpv和tct都要做吗？hpv68阳性有传染性吗?想问一下TCT检查正常HPV68阳性会不会传染？hpv68阳性有传染性吗?hpv68阳性有传染性吗?
发病时间：不清楚
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海南医学院附属医院
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建议： 分析：你好：HPV是一类在自然界广泛存在的DNA病毒。现代医学完全有能力将尖锐湿疣治愈，但是要承认HPV很顽固。一旦感染上HPV后，潜伏期1～8个月，平均3个月。在潜伏期之内，患者大都没有自觉症状，不痛不痒。而在这个阶段，病毒已在皮肤基底层大量蔓延。如果仅仅把疣体去除，其皮肤基底层仍有大量的潜在（亚临床感染）病毒存在，就有可能复发，复发的概率在70％以上。尖锐湿疣属常见病、多发病，不是疑难杂症，更不是绝症。只要患者能及时就医，有信心、有耐心地认真用药排毒，其治愈率还是非常高的。
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海南医学院附属医院
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建议： 分析： 你好！尖锐湿疣的传播途径有很多。例如间接传播。性爱传播等，尖锐湿疣一般被感染后1--3个月发病临床上大多数是2个月以内发病以后时间越长发病的几率就越小了。建议：建议您平时养成良好的生活习惯，避免不洁及无保护的性行为。如果确诊为尖锐湿疣建议尽快到正规医院的皮肤科就诊，在医生的指导下，采取合理有效的措施。
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我HPV阳性，半年了。大医院的医生说不用
匿名用户&&&&
| &&&&浏览9426次 &&&&| &&&&提问时间： 20:00:22 &&&&|&&&& 回答数量：
病情描述：
病情描述：我HPV阳性，半年了。大医院的医生说不用太担心。今天还是去了一个小医院复检，明天出结果。不知道会怎么？但是不知咋的，被这个小医院的医生说得吓死了，她说从药理上讲，不可能转阴。请问真是这样吗？为什么医生说的都不一样呢？
病情分析：
请根据患者提问的内容，给予专业详尽的指导意见。（最多输入500字）
指导意见：
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医生回答专区 因不能面诊，医生的建议仅供参考
病情分析：
你好，HPV又称人乳头状瘤病毒，在去年两岸学术交流会上台湾科学院的学者做过一个全台湾的妇科筛查，结果是宫颈癌，乳腺癌患者中99.7%有HPV的感染，也就是说宫颈癌患者基本都有HPV感染，HPV与其发病率呈强相关，但目前还不能确认HPV感染就以后一定会得宫颈癌，临床上面一般是如果宫颈糜烂II度以上，且感染HPV的一般建议进行手术治疗。追问： 谢谢您。这二天检查结果出来，再咨询您。好吗？回复： 好的，很乐意为您提供咨询。追问： 谢谢回复： 客气了：）追问： 还没有去结果，不过医生电话说问题不大，说支原体有什么问题。请问医生，我还需要去拿检查结果吗？因为离检查医院比较远，如果不需要的话，有点不情愿去拿报告单。行吗？追问： 耽搁您的时间。多谢回复： 支原体感染需要专科治疗，到时当地医院还是需要检查结果的。追问： 好的。明天去看医生。谢谢追问： 您好追问： 检查结果出来了，检测值hpv16值高大1069，这说明计计什么问题呢追问： 其它没问题，医生说得继续检查，正在做活检。唉，好怕追问： 会有宫颈癌的可能吗？回复： 估计得做手术，一般即使是宫颈癌只要不是恶性的都是可以治愈的。追问： 一般得做什么手续？会治愈吗？回复： 先看病理检查结果再说吧。追问： 谢谢徐医生回复： 客气了。
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擅长:内科护理综合
擅长:心理科综合
擅长:内科疾病
育儿|两性|男性|整形|养生|老人关于你所害怕的HPV疫苗的副作用
今年7月份内地才通过审批宣布将上市二价hpv疫苗，这已经足足迟到了10年，导致很多人已经错过了最佳接种期，这已经为我国女性之后的宫颈癌发病率埋下了隐患。
绝大多数子宫颈癌由HPV病毒感染引起，子宫颈癌也是唯一一个可以通过接种疫苗而预防的癌症。此次获批的疫苗属于二价疫苗，主要预防HPV—16型和18型这两种病毒。
但该消息在受到公众广泛关注的同时，也引发很多担忧和疑问：HPV疫苗安全吗？有效吗？什么人才有必要打？
【只谈疗效不谈副作用的用药是耍流氓，反之亦然。】
不管有没有危险，资料数据说话。
本文的资料来源，均为官方及学术机构，包括：
https://www.drugs.com/ (哈佛医学部推荐的医药网站)
http://www.mhlw.go.jp (日本厚生劳动省)
http://dl.med.or.jp（日本医师会）
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7284/
首先先来看一下主流HPV疫苗的安全性测试：
Cervarix的临床安全性测试，来源www.drugs.com
上图看不懂没有关系，这是上段文字的总结：葛兰素史克，Cervarix二价疫苗，HPV 16，18，临床测试，另一实验组为甲肝疫苗，对照组氢氧化铝（疫苗免疫助剂），受试者59%白人，26%亚洲人，剩余为其他人种，年龄组10~25岁妹子。
Cervarix的临床安全性测试，来源www.drugs.com
Cervarix的临床安全性测试，来源www.drugs.com
实验结果：与甲肝疫苗相比，Cervarix疫苗的临床常见不良反应，像是头疼，发热，麻疹，后背痛，其他病原体继发感染一类的，都没有特别的增高，临床常见不良反应发生的概率，和肝炎疫苗差不多。【可能有人会觉得打的时候有点儿疼有点肿……但是，打个盐水还疼呢是吧】
下面是默沙东的四价HPV疫苗Gardasil（HPV 6,11,16,18）的安全性测试：
Gardasil的临床安全性测试（女性），来源www.drugs.com
Gardasil的临床安全性测试（男性），来源www.drugs.com
解释出来就是：Gardasil的安全性测试因为抗原种类更多，测试更加严格，不再与肝炎疫苗对比，而是直接与不含抗原的羟基磷酸铝硫酸（相当于Cervarix组的氢氧化铝组），以及安慰剂盐水进行对比。同时，因为有效抗原增加，实验对象扩大到9~26岁男性。
安全性测试的结果，Gardasil的常见不良反应（红肿发热麻疹背痛等等），也在正常范围内，并且，男性与女性的安全性，并没有显著的差异（男性甚至更低）。
说了那么多，现在到了大家关心的问题了，打hpv疫苗有哪些不良反应？
▲发烧，注射部位疼痛，肿胀，关节痛，肌肉痛，头痛，恶心，呕吐，腹泻。
其实这些反应很多疫苗都会有，比如乙肝疫苗等
除了这些常见的不良反应，对于网传的那些比如严重疼痛，严重过敏，高热，呼吸困难等，是真的吗？
确实，这并不假。打了hpv疫苗可能会出现这种症状。
是不是有网友愤怒了：有那么多不良反应还建议我们打？
在愤怒之前请先听我讲。
对于网上所传的不良反应是真实存在的，但是没有大家想的那么坏，在没有完全了解的情况下，不要以讹传讹。
这是日本厚生劳动省发出的HPV疫苗不良反应救济通知：
日本厚生劳动省发布的HPV及其他疫苗产生不良反应的救济通知，来源www.mhlw.go.jp
日本医生会发布的HPV疫苗接种后不良反应诊断和应对手册：
日本医生会发布的HPV副作用应对手册，来源http://dl.med.or.jp/
那么，因为这些不良反应，日本真的废止了HPV疫苗吗？？
日本医学会发布的手册是这样说的：
日本医生会发布的HPV副作用应对手册，来源http://dl.med.or.jp/
翻译过来大意就是:
“由于HPV疫苗接种后，出现了以疼痛为中心的各种不良反应，所以，日本的HPV疫苗注射工作无法进行。但是，作为先进的大日本帝国，发达国家里面只有我们日本不打疫苗，这，是不对的。不打HPV疫苗可能会导致我们日本未来的子宫颈癌发病率比别的国家高很多，这不可以。但是同时，疼痛等不良反应的存在也是事实。因此，希望日本的疫苗还是要打的，我们医学会发出这个手册，各位根据手册列出的各种打疫苗后可能出现的症状，协助治疗现场的医生进行工作。——by 日本医学会会长”
所以，日本官方的态度，并不是叫停HPV疫苗，而是，根据不良反应对症治疗。
那么话说回来，打疫苗时出现的这个疼痛到底是什么呢？
日本医学会对疫苗注射疼痛的分类是这样的：
日本医学会对于HPV疫苗疼痛反应的诊断，来源http://dl.med.or.jp/
翻译过来大意就是：
注射HPV疫苗之后的疼痛分三种：
1，由于注射部位组织损伤或者炎症导致的疼痛（就是，单纯肉疼，针眼疼以及炎症感染）
2，注射的过程伤害到了神经末梢，或者其他神经病变引起的疼痛。
3，心理因素，（疼痛敏感，晕针或者装的）。（日本这个疫苗的接种时期普遍在青少年，中二病满地跑的年龄段。）
同时，其他疼痛，有可能是因为接种者本身患有青春期代谢病，青春期生长痛，肿瘤，甲状腺疾病等引起的。
总之，大多数疼痛都和HPV疫苗本身没有什么关系。
关于日本的辟谣到此结束。
那么，就算日本的不良反应没有谣言传的这么夸张，美国的安全测试也合格，我们注射HPV疫苗是不是就完全高枕无忧了？
不是的，除去这些不良反应，你最应该担心的，是过敏。
关于过敏反应：
为什么疫苗会过敏？我们先来看一下HPV疫苗的成分：
以Cervarix为例：Cervarix contains proteins of HPV types 16 and 18. The vaccine also contains 3-O-desacyl-4’-monophosphoryl lipid A (MPL), aluminum hydroxide, sodium chloride, and sodium dihydrogen phosphate dehydrate (来源drugs.com)
其中，HPV 16，18是有效的免疫成分，它会引导你的身体产生相应病毒抗体，从而具有免疫力；单酰磷脂（Monophosphoryl Lipid A (MPL) ）是一种抗癌疫苗的佐剂，帮助免疫调节，使疫苗更好地发挥作用。其他成分为疫苗助剂。
氢氧化铝（Cervarix助剂），或羟基磷酸铝硫酸（Gardasil助剂）作为疫苗成分，可能会导致疫苗铝含量超标。
但是，在疫苗的生产过程中，由于工艺原因，疫苗成分并不只是如上图所示，而是会混进其他的过敏原杂质。
例如，Cervarix疫苗，是将病毒基因重组后，在粉纹夜蛾（昆虫）的细胞中复制的，所以，可能含有某些昆虫的蛋白（极低含量）。对这种昆虫蛋白过敏的人，可能出现严重的过敏反应。
再例如，Gardasil疫苗，生产过程中用到酵母，所以，对酵母过敏的人，可能出现严重的过敏反应。
你觉得这种过敏很可怕吗？那我告诉你，很多对鸡蛋过敏的人，是不能打麻疹疫苗或者流感疫苗的，因为生产过程中需要用到鸡胚。
总而言之，HPV疫苗，不良反应【有】，过敏【有】
但是，所有的副作用，都没有网上传的这么严重，都和其他疫苗差不多，都在安全许可的范围之内。
所有药物都不是百分之百安全，疫苗的防护也不是百分之百，免疫和过敏都要因人而异。
根据自己的身体情况，结合疫苗的安全须知，科学接种，科学防疫。
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