A．同样特殊疾病中能发现同一种病原菌
B．这种病原菌能在体外获得纯培养
C．不能在体外获得纯培养的微生物也适用
D．将纯培养接种至易感动物能引起相同的疾病
E．能从感染动物体内重新分离出这种病原菌的纯培养

科赫法则基本内容包括：

1 在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者体内不存在；

2 要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中得到纯培养；

3 用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；

4 从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。

如果进行了上述4个步骤，并得到确实的证明，就可以确认该生物即为该病害的病原物。

科赫法则是伟大的德国细菌学家罗伯特·科赫（Robert Koch，1843～1910年）提出的一套科学验证方法，用以验证了细菌与病害的关系，被后人奉为传染病病原鉴定的金科玉律。它为病原微生物学系统研究方法的建立奠定了基础，使其成为一门独立的学科。它作为一种研究方法，可能多少已经受到现代研究方法的冲击而显得意义不再；但是作为一种研究思路，对人们建立严谨的思考习惯还是极有意义的。

1893年发现有些霍乱带原者以及伤寒玛莉等案例并无任何症状表现，因此科赫后来又将第一条原则后半删去。后来在小儿麻痹、疱疹、艾滋病、丙型肝炎都有类似发现，甚至今日几乎所有医师和病毒学家都认同小儿麻痹病毒只会对少数感染者造成瘫痪。
第三条原则也同样不尽完美，科赫本身也在1884年发现霍乱、结核等疾病未必能在不同个体产生相同表现，以今日之观点，艾滋病毒无法感染CCR5 Δ32基因删除的个体。
科赫氏法则发展于十九世纪，是以当时技术水平能用来辨认病原体的技术通则。但科赫生活的年代，已有许多疾病明显和某些物质相关，却无法符合这套法则的检验。而过于信任这套研究方法的学界，也在无法透过培养基分离培养病毒的情况下，导致病毒学发展窒碍难行。目前，已有不少疾病证实为某种病原体造成，却不能满足柯霍提出的理论。因此，虽然科赫氏法则在史上占有一席之地，也持续对微生物诊断有所帮助，但目前已不要求必须完全符合四项准则考验的研究了。